畜禽基因组BAC文库构建与保存技术规程

畜禽基因组BAC文库构建与保存技术规程

国家标准 GB/T25170一2010 畜禽基因组BAC文库构建与 保存技术规程 TeehmiealregulationoffarmanimalsgenomeBACIibrary costretionandpreservatiom 2010-09-26发布 2011-03-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T25170一2010 前 言 本标准由农业部提出 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口 本标准起草单位;农业科学院北京畜牧兽医研究所 本标准主要起草人:关伟军、马月辉、刘长青、潘春留、刘洪坤、甫亚斌、余露露
GB/I25170一2010 畜禽基因组BAC文库构建与 保存技术规程 范围 本标准规定了畜禽基因组BAC文库构建方法 本标准适用于猪、牛,羊,马,驴,鸡、鸭、鹅等畜禽的基因组BAC文库构建与保存 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3.1 基因组文库genomelibrary 用重组DNA技术将某种生物细胞的核DNA的全部片段随机地连接到载体上,再转移至适当的宿 主细胞中,通过细胞增殖而形成的各个片段的无性繁殖系的总集 3.2 细菌人工染色体baeterialartificialechromosomme,BAc 以大肠杆菌致育因子为基础.利用现代重组DNA技术体外人工合成的具有容纳高分子量外源 DNA的特性载体 3.3 DNA连接DNAligation" 在DNA连接酶催化下,靶DNA片段与载体DNA相邻的5’端磷酸与3'端胫基之间形成磷酸二醋 键的过程 3.4 感受态细胞competentcells 在特定条件下细胞膜通透性发生改变,允许外源DNA进人细胞内的特殊状态下的受体细胞 电转化electrotransformmation 在高压脉冲的作用下,将外源DNA导人感受态细胞的过程 3.6 脉冲场凝胶电泳puserieldelelectrphoretis,PrGE 利用脉冲场电泳系统电场方向周期性交替变化的功能而分离和鉴定生物大分子的技术 3 重组体 rec0mbinant 两种以上不同来源的DNA片段连接所形成的杂种DNA分子
GB/T25170?2010 ?? й涨,??????GB/T6682??? LB滺?(Iuria-bertanimedia 360mmol/1.K.HPO,l3.2mmol/1KHPO,1.7mmol/1,0.4mmol/LMgsO 6.8mmol/LNHSO,4.4%,100mL,???滺?LB?1:9 ? 4.25--4--3--/D?(5-rom4-ehlorn3-indolsl/Daactoside.x-gal) ???X-gal,20mg/ml?-20??档 4.31mo/LIris-CI 121.10g/1Tris800ml/L??(doubledistilledH,OddH.(O),HClpH 8.0,1000ml,? 4.4 ?? 0 mmol/LDTT,1mmd mg/mLIBSA,l0???1 nol/? 4.5socC ?20.00???,5.00???,0.50gNaCl,?2.5ml1mol/KCl.10ml 2mol/LMgsoMgCl.980mLddH.O,??60C,10ml2molL ? -D?(ipropht-D2alactside.,ITG) ?1.00gIPTG5.0mL??,??1mL/,?20C ??鴢? 800mldaH0м186.10g?(ehylenediaminetetracetieaed,EDTA), ?,pH8.0,ddH.01000mL,? 4.8CsC???? 3.3nmlCsCl,?10mL ????(N-DodeceanoyHN-methyllyeinesodiumsalt,NDs ?186.00EDTA1.20gTrisC,700ml.ddH,G,pH8.0,NDspH 9.5,ddH.01L, 4.10(?) ?0.48??1.32g?1.47?,ddH.0100mL.,? ù 4.11 ,??12.54g/ml-20C档 4.12Iris(10mol/LpH18.0)-EDrA(1.0mmo/LpH8.0)?,T 10mmol/LpH8.0Tris.Cl,1.0mmol/pH8.0EDTA,?,±档 4.13LB? ?10.00g????5.00?????10.00NaCl800mL ddH,O,pH7.4,1L,? 4.14LB ?10.00g??5.00g?????10.00gNaCI,800mL ddH,(O,pH7.4,15.00g??,1L,? 4.15? 4.l4??LB,???,2ml;1AlLù (12.54g/mL)?ù,20mL90mmС?,40L
GB/T25170一2010 X-gal和7ALIPTG混匀后,均匀涂于培养基表面,超净台里晾干备用 4.16碱裂解液I 50mmol/L葡萄糖,25mmol/LpH8.0Tris-CI,10mmol/儿LpH8.0EDTA,定容至1L,高压灭菌 4C保存 4.17碱裂解液I 0.2mol/LNaOH,1%SDs,现用现配 4.18碱裂解液皿 1.32mol/L乙酸甲,4C保存 主要仪器,设备 水浴锅、电热恒温鼓风干燥箱,培养箱、电子天平、一80C低温冰箱,超纯水仪,低温离心机,凝胶 自动成像分析系统和脉冲电泳仪等 基因组BAc文库构建 高分子量DN制备 6.1 细胞收集 家禽血细胞的收集 采集3.0ml一5.0mL畜禽新鲜血液,立即注人含1mL肝素钠(500U/ml)或柠檬酸钠葡萄糖的 离心管中抗凝 4下.450og离心5min.弃上清 加人等体积预冷的pH7.0磷酸盐缓冲液 phosphatebufferedsaline,PBS),混匀 上述血细胞收集步骤重复离心3次后,加人1.0mlPBS重悬 细胞 重悬细胞后计数,将血细胞密度稀释到1.0×10个/ml一2.5×10"个/ml 6.1.1.2家畜血细胞的收集 采集10ml一20ml家畜新鲜血液,加人等体积红细胞裂解液,37C下放置1h,4C下,583离心 5min,其余步骤同6.1.1.1 6.1.1.3畜禽其他组织细胞收集 在干冰或液氮存在的条件下,将新鲜的畜禽组织碾成粉末,悬浮在PBS中,振荡混匀,用两层纱布 过滤 其余步骤同6.1.1.1 6.1. 2 细胞裂解 取细胞密度为1.0×10个/ml一2.5×10个/mL的悬液和1%低熔点琼脂糖在45C下放置5min 后,等体积混匀,隔3min一5min再混匀一次 将100L混合液置于专用模具中,4C下放置15min~ 30nmin形成凝胶块 将凝胶块置于含有0.1mg/ml蛋白酶K和30mL1%NIS缓冲液中,50C下水浴 3h后更换相同缓冲液,再50 C水浴24h28h 用30mLTE缓冲液(pH7.6)在30nmin内洗涤3次(冰 上操作)以去除TE缓冲液,置于1.0mmol/L苯甲基碱酥氟(phenylmethylsulonylluoride，PMSF)中 50C下水浴30nmin,中间换液一次 将凝胶块储存于0.5nmol/LEDTA(pH8.0)中4C可保存半年 6.1.3基因组NA酶切与回收 将凝胶块在4C下用30mLTE缓冲液浸泡3h4h,中间换液3次一4次 置于1mL的适宜限 制性内切酶缓冲液中,冰浴1h,中间换液1次 分别移至不同酶量(1U20U)的酶切缓冲液中,冰上 30 渗透1h后,37C下酶切10min min,用1/10体积0.5mol/1EDTA(pH8.0)终止反应 将不完 全消化的DNA凝胶块在0.5×TBE中,13C,180V~120V,120"角,脉冲时间60s~10s条件下进行 PFGE电泳,电泳时间16h一24h 6.1.4最适DNA片段获得 6.1.4.1 第一次电泳选择 用1%琼脂糖凝胶电泳分离酶切获得的大分子量DNA,电泳条件同6.1.3,电泳时间24h 电泳结
GB/T25170一2010 束后,取出凝胶,将DNA分子量标尺与相邻胶切下,在0.5×TBE中染色40min后 置于长波紫外灯 下观察,用标尺测量并标记凝胶块所需回收的分子量的片段(100kb400kb. 6.1.4.2第二次电泳选择 将未染色的样品条带切成100kb200kb,200kb300kb和300kb400kb三段 用新的1%琼脂糖凝胶进行第二次脉冲电泳,电泳条件同第一次电泳选择条件 根据DNA分子量 标尺切下各条带中100kb一400kb的DNA片段,用TE洗2次一3次,保存在0.5mol/LEDTA中 6.1.5电洗脱 6.1.5.1透析袋处理 透析袋在2%质量浓度)NaHco和1mmol几.EDTA(pH8.0)浒液中煮沸10min,用蒸溜水彻 底漂洗,再置于1mmol/L EDTA(pH8.0)中煮沸10min后冷却,4C下保存于纯水中 6.1.5.2电泳 将不同大小范围DNA胶条分别放人一透析袋中,用0.5×TBE充满透析袋,浸泡在0.5×TBE的 电泳槽中,13C,120"角,4V/em一5V/em电泳3h,使DNA分子从凝胶中移出 将透析袋旋转180" 再电泳30s1min,以解析透析袋上的DNA分子 6.1.5.3电泳后处理 电泳结束后将透析袋在4C下0.5×TE中透析12h,从透析袋中将回收的DNA溶液吸出,依照 -定的分子量标尺对回收的基因组DNA进行定量 保存于4C,一周内使用 6.2BAC质粒载体制备 6.2.1BAC载体制备 SDS碱裂解法制备BAC载体 将含有适当BAC质粒的菌液涂布于含12.54g/mL 的氯霉素的 LB平板上,37C培养12h 挑单个菌落接种到LB液体培养液中,200r/min.37C振荡过夜 将 6ml培养物，4下,20000g离心1min,收集细菌 细菌沉淀悬浮于碱裂解液I中,剧烈振荡 加新 配制的碱裂解液于细菌悬液中,颠倒混匀,放置于冰上 加碱裂解液,颠倒混匀 4C下,20000g 离心30min,取上清,加人0.6倍体积的异丙醉,混匀,室温放置10min 4c下,20006离心30nn. 回收核酸沉淀 用70%的乙醇涮洗管底及管壁,室温干燥DNA沉淀 用TE(pH8.0)溶解核酸沉淀 超螺旋质粒纯化 密度梯度离心法纯化超螺旋质粒 每毫升DNA样品加1.00g固体CsCl,至完全溶解 加入DNA 和CsCl溶液,混匀,加石蜡油,800000g离心24h后,可见两条相隔约4mm的清晰条带,弃石蜡油和 部分溶液,吸取线环式质粒和超螺旋质粒于一离心管中 收集液体于透析袋中,依次用2.0L0.5×TE 透析3h,4L0.5×TE透析4h,4L.0.5×TE透析12h 收集液体,4C保存 6.2.3BAC载体酶切和去磷酸化 用适当的限制性内切酶进行酶切,反应体系为20L10×缓冲液100L.(5"g一104g)载体 DNA;l"l40mmol/L亚精胺;适当的限制性内切酶;用ddH,0定容至1504L,37下酶切6h后 加人2.0AL1U/L牛小肠碱性磷酸酶(calfintestinalalkalinephosphatase,CIAP)和20L10× CIAP缓冲液,用ddH,(0定容至190L,37C放置1h后,70C反应15min,进行去磷酸化 通过低熔 点琼脂糖凝胶电泳分离载体DNA,染色,紫外灯显示条带,经熔化凝胶和酚、三氯甲烧抽提进行载体 DNA的回收 6.2.4载体脱磷效果检测 分别用T4DNA连接酶和T4DNA连接酶缓冲液及T4多核苷酸激酶对所制备的载体于16C自 连12h 取1.5L~2.OL连援产物加到18pl一20L适当的感受态细胞中,37C下,在soC培养 基中,200r/min下培养1h 将转化的菌液适量涂布于含有氧霉素、,IPTG和X-gal的LB固体培养基 表面,于37C下放置24h36h,检测脱磷效率
GB/T25170一2010 6.2.5载体连接率检测 16C下,将制备的载体与经酶切的入DNA在T4DNA连接酶的作用下连接12h 反应体系为 1.0MlLTADNA连接酶;l0Al2倍连接酶缓冲液;10ML(约25ng)载体DNA;2.5AL(约100ng l00kb标准外源片段 把灭活后的连接产物加到适当的感受态细胞中,经培养后取适量菌液涂布于含 氯霉素,IPTG和X-gal的LB固体培养基表面,37C下,培养24h一36h 随机挑取若干个白色菌落于 3mLLB液体培养基中培养12h 提取少量质粒DNA,经酶切后进行脉冲电泳检测,电泳条件同酶切 回收,电泳时间24h 脉冲结束后,经染色,检测外源片段插人情况 感受态细胞制备 取一80C冰箱中保存的适当的菌种复苏,培养至光密度值opticaldensity,ODm)约为0.72一 0.76后,置于冰水混合物中骤冷,4C下1000g离心10min,弃上清 用ddH,O重悬菌体,4笔下 100g离心10mim,弃上清 加10%甘油重悬，4C100og离心10min,重复2次,弃上清,用残存管 底的甘油悬浮细胞,4笔下1000g离心2min,弃上清,用1.0ml10%甘油重悬细胞以每管100L分 装于离心管中,一80C保存 6 基因组DNA和载体DNA的连接 将回收的大片段DNA与30ng制备好的载体以1:2~1:3的比率连接,连接体系含400U的T4 DNA连接酶,l6C下连接12h 65C温育15min,将连接产物转移到0.025pm的透析膜中央,用 0.5×TE4C透析2h 从透析膜上回收透析产物,再用0.5×TE十30%的PEG80004C透析 30min 1,浓缩连接混合物中的DNA 6.5电转化 将适当的感受态细胞置于冰上解冻后,取20L感受态细胞,加人2.0L重组体连接物.冰上放置 min一5min 将混合液加人预冷的电击杯中,电击 取出电转化后的细胞移至1mL37C的soC培 养基中,混匀,37C下225:/min培养1h一1.5h 铺于含有叙霉素.IPTG和xgal的固体LB培养基 7七倒置培养24h 随机挑选白斑,用椭切整定插人大小.片段大小应在1b以上.转化次数 表面,37 在0次左有,可以进行大量连接和转化 转化后的简液用含10%甘油的LB冻存液,以每份00L" 装,于一80保存 基因组BAc文库的保存 取出转化的冻存菌液,于冰上融化 取适量菌液涂于氯霉素板上,37C培养24h 将LB培养冻 存液以每孔110L,加到384孔培养板中 将氧霉素平板上的白色菌落挑至384孔板,每孔1个菌落 将384孔板置于专用摇床中,37C下培养24h 取出384孔板进行编号,即为文库母板 将文库母板 置于一80C冰箱中长期保存 文库的扩增及应用 应用自动平板复制器将已构建好的文库母本复制若干份,复制完成后将384孔板置于专用摇床中 37C下培养24h,-80保存工作文库,进行后续相关研究