痒病诊断技术

痒病诊断技术

国家标准 GB/T22910一2008 病诊断技术 Diagnostietechniquesforscrapie 2008-12-31发布 2009-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22910一2008 前 言 本标准是参照OIE《国际动物卫生法典2000年版)及《诊断试验和疫苗标准手册2000年版),以 及美国农业部动物病研究所和瑞士的OIE传染性海绵状脑病参考实验室的有关规程和技术资料,结合 我国农业部动物检疫所的验证试验结果编制而成 本标准的附录A、附录B、附录C为规范性附录 本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口 本标准起草单位:动物卫生与流行病学中心 本标准主要起草人:王志亮、刘雨田、吴槛三,吴晓东、于建敏、邹艳丽、王树双
GB/T22910一2008 痒病诊断技术 范围 本标准规定了痒病临床诊断和实验室诊断的技术要求 本标准适用于绵羊和山羊的痒病诊断 临床诊断 痒病临床症状各种各样,病程短则儿周,长则1年以上,终归死亡 患病母羊可发生流产 少数病 例取急性经过,症状轻微,发病数日后突然死亡 病羊死后内脏常无肉眼可见的病变 当病羊出现以下 全部或部分症状而又不能确定为其他疾病时,应怀疑痒病的可能 -行为异常 病初症状不易觉察,表现为耐力下降,然后步态不稳并逐渐加重 时常欲饮水却饮得很少 此外 表现为焦躁不安,恐惧,精神错乱;呈攻击性或离群独处,呆立一旁,或摇头竖耳、凝视,或高抬腿跑步 初显症状3至4个月后,患羊感染加重而进一步消瘦,行为异常逐渐加剧 瘙痒 瘙痒是痒病的重要临床症状 表现为头顶、臀部和尾部开始擦痒,甚至强烈摩擦,啃咬或用后蹄搔 抓身体痒感处,致使头顶、颜面、耳部、躯干体表和四肢皮肤脱毛、破损甚至撕脱 尤其胸部、胁部和后肢 被毛广泛脱落 人为摩擦病羊夙部脊梁可诱导啃咬反应,或反射性伸颈摇头,咬唇和舌头运动 感觉或反应过敏 患羊反应过敏,对声音敏感,易受惊 有的病例的随意肌,特别是头、颈,胁腹和股部,呈现肌肉震 颤,因人接近而兴奋使震颤加重,安静时则震颤变轻 -运动失调 运动失调首先表现在转弯僵硬,后肢落地困难 随后,病羊瞒珊或倒地不起 -体重和体况 患羊的体重和体况明显下降,并随着病程的发展而进一步恶化,最后消瘦而死亡 实验室诊断 3.1组织病理学检查 3.1.1采样 临床症状可疑的痒病病羊经注射麻醉药物致死后,按剖检术式取出全脑,包括大脑和完整脑干 3.1.2固定 将全脑和脑干直接放人10倍20倍脑体积的10%中性福尔马林溶液中渗透固定5d,换液后再维 持一周 固定液配法见附录A 3. 1.3组织切片制作 .1.3.1组织切块 33 把脑组织横切3mm5mm厚的组织块,选取以下部位组织作进一步处理;脑门尾侧处延髓闭合 部与开张部),脑干的桥脑、中脑、丘脑及大脑纹状体,以上5块供检测用,保存其他部位备用 先切延 髓,再切脑干 用新配制的固定液再固定一周,其间更换固定液3次 3.1.3.2甲酸处理组织块 将固定的组织块放人流水中漂洗24h后,移人95%~98%甲酸中作用2h,水洗2遍,每遍10 min
GB/T22910一2008 然后再移人新配制的福尔马林溶液中保存至少24h 3.1.3.3脱甲醛 将组织块放人流水中漂洗24h以上 3.1.3.4脱水 依次在以下梯度酒精中分别脱水: a)75%酒精中3h; b) 85%酒精中3h; 95%酒精I中3h; c d) 95%酒精I中3h; e)100%酒精I中3h; f)100%酒精I中2h 3.1.3.5透明 依次在以下试剂中透明 二甲苯I中20min a) 二甲苯I中20min b 3.1.3.6浸蜡 依次在以下试剂中浸蜡" a)软蜡40min; b) 硬蜡I(熔点57C一58 C)1h; e)硬蜡I(熔点57C一58C)1h 3.1.3.7包埋 将浸过蜡的组织块放人包埋框内用熔化的新硬蜡(熔点57C一58C)包埋,切面朝下放平 放冷 后过夜修切成形 3.1.3.8切片 将石蜡组织块切成了p四厚的组织薄片 每块组织连续切片3片一10片,切片碎屑和废弃组织经 134C138C高压蒸汽消毒15min方能废弃或者直接焚烧处理 组织薄片用干净的粘附剂预处理过 的载玻片贴片,也可用特殊处理的进口玻片贴片 3.1.3.9烤片 贴好组织薄片的载玻片先在自然条件下晾干,然后放人45C50C的恒温箱或烤箱中烘干4h 以上 3.1.3.10脱蜡和脱二甲苯 依次在二甲苯和梯度酒精中脱蜡去二甲苯 二甲苯I10min; a b) 二甲苯I10mins 100%酒精I2min; d 00%酒精I2 min 95%酒精I2min 95%酒精I2 min; g)85%酒精2 min; h 75%酒精2 min; i 自来水洗2 min 苏木素(H E)染色 有关试剂配制见附录B
GB/T22910一2008 依次按以下程序染色 a)苏木素染液15min b 自来水漂洗21 min; 1%盐酸酒精10 s D 自来水漂洗5 1min 饱和碳酸锂水溶液30s; f 自来水漂洗10 mln; 75%酒精2 min; g h)85%酒精2 min; iD 95%酒精伊红液1 mln 3.1.5脱水、,透明 依次处理的程序如下 95%酒精2min; a b) 100%酒精I2min; c 100%酒精I2min; d 二甲苯I2min: 二甲苯I2min. e 3.1.6封片 以适量中性树胶封片,置38C温箱干燥或自然干燥 3.1.7贴签 用适当大小的不干胶签贴在载玻片的磨砂端,然后用铅笔或记号笔将切片的编号、名称实验时间 等记录在不干胶签上 3.1.8镜检及判定 3.1.8.1镜检观察 在光学显微镜下观察切片,倍数分别为10×10,10×20和10×40 3.1.8.2阳性结果 灰质区神经细胞或神经纤维网浆中出现空泡变性 神经细胞内呈规则的圆形或卵圆形,空泡内不 着色或被伊红淡染,界限明显,胞核被挤压于一侧,甚至消失;有的神经细胞被单个或多个特异性空泡胀 大,成为“气球样”空泡性神经细胞 特别容易出现病变的部位有延髓的迷走神经背核、舌下神经核、橄 榄核、网状结构,桥脑的桥核、网状结构,中脑的红核、被盖核和丘脑内诸核等处 这些部位的神经细胞 出现特异的大空泡以及丘脑、大脑纹状体空泡病变,且呈双侧对称性分布 在正常情况下,动眼神经核 和红核处也可能有少量空泡出现,但不呈双侧对称,应注意区别 3.1.8.3阴性结果 灰质区无特征性空泡变性 3.1.8.4确诊 组织病理学检查只是痒病确诊的辅助方法,进行确诊时还应结合免疫组织化学方法或其他免疫学 方法来进一步诊断 3.2免疫组织化学法检查 3 .2.1试剂配制 见附录C 3.2. 2 采样 3.2.2.1脑组织采样同3.1.1. 3.2.2.2活体采集第三眼脸淋巴组织的方法如下:在被检羊眼角滴加2%盐酸利多卡因局部麻醉后，
GB/T22910一2008 用消毒的眼科器械翻转并固定第三眼脸,采集粘膜表层淋巴组织 3.2.3固定 将剖检取出的全脑或活体采集的淋巴组织,直接放人10倍一20倍组织体积的10%中性福尔马林 溶液中渗透固定5d,换液后再维持一周 固定液配法见附录A 3.2.4操作方法 每次免疫组织化学检查,都要设置阳性和阴性痒病组织切片作为免疫组织化学检测对照用 3.2.4.2组织切片制作法同3.1.3 自水中取出经脱蜡、去二甲苯的切片,在磷酸盐缓冲液(PHBS)中洗3次,每次5m min 甲酸(98%)作用5min,然后在PBs中洗3次,每次2min(系处理高度感染组织特别需 要的 将蛋白酶缓冲液水浴加温至37C,按5g/ml加人蛋白酶K,立即放人切片确保切片全部 浸人消化15min 一个不锈钢饭盒中倒人刚煮沸的蒸溜水,并立即将切片放人盒中确保切片完全浸人水中 3.2.4.6在 盖好盒盖,在121C高压(约103kPa)处理20min自然冷却至60C以下取出 3.2.4.7 在PBS中洗3次,每次5min. 3.2.4.8将切片完全浸人3%双氧水甲醉溶液中室温处理5min. 3.2.4.9在PBs中洗3次,每次5min. 3.2.4.10在切片的组织上滴满5%正常猪血清,置湿盒中室温作用20min 3.2.4.11弃去正常猪血清,用吸水纸吸干组织切片四周的液体 3.24.12将抗H”核心片段单克隆抗体(有商品)稀释为》e/mL.滴加在组织切片上，确保组织完 全覆盖,湿盒中37C作用4h,或者在2C8 C下作用过夜 3.2.4.13在PBS中洗3次,每次5min 3. 2.4.14洗完后用吸水纸吸干组织切片四周的液体,然后在组织切片上滴加适量工作浓度的生物索 标记的抗鼠抗体(有商品),确保组织完全覆盖,湿盒中室温作用10min 3. 2.4.15在PBS中洗3次,每次5min. 3. .2.4.16洗完后用吸水纸吸干组织切片四周的液体,然后在组织切片上滴加适量工作浓度的亲和素 辣根过氧化物酶结合物(有商品),确保组织完全覆盖,湿盒中室温作用10min 3.2.4 17 在PBSs中洗3次,每次5min 3.2.4.18在蒸馏水中放置2min 3 .2.4.19洗完后用吸水纸吸干组织切片四周的液体,然后在组织切片上滴加适量工作浓度的AEC (3-氨基-9-乙基咔陛)底物显色液(有商品),确保组织完全覆盖,湿盒中室温作用5nmin10min 3.2.4.20用Mayer氏苏木素液复染脑组织1min,淋巴组织30s 3.2.4.21在燕僧水中放置2min. 3 .2.4.22专用封片剂封片 3.2.5结果判定 在光学显微镜下(倍数为10×10,10×20和10×40)观察切片,结果判定如下 阳性结果;在阳性和阴性对照片染色结果正确的条件下,若组织切片灰质区(特别是脑门部的 a 迷走神经背核、孤束核等处)或淋巴组织的生化中心出现特异性铁锈红色染色颗粒,则将该样 品判为痒病阳性 b 阴性结果:若组织切片灰质区(特别是脑门部的迷走神经背核、孤束核等处)或淋巴组织的生 化中心未见特异性铁锈红色染色颗粒,则将该样品判为痒病阴性
GB/T22910一2008 附 录A 规范性附录 10%中性福尔马林固定液的配制 10%中性福尔马林固定液的配制: 氯化钠 8.5g 蒸馏水 900ml 40%甲醛 100ml 把以上材料混匀溶解即可使用
GB/T22910一2008 附 录 B 规范性附录 组织病理学检查(HE染色)试剂配制 B.1苏木素染色液 B.1.1配方 苏木精 1.0g 无水乙醇 10ml 蒸憎水 200mL 氧化汞 0.5g 冰乙酸 8ml 钾明矶 20.0g B.1.2配法 先将苏木精溶于无水乙醇,然后将钾明矶和蒸僧水煮沸溶化,去火并迅速加人苏木精无水乙醉溶液 中,立即加人氧化汞并煮沸,迅速冷却后加人冰乙酸,过滤后使用 B.21%盐酸酒精 在100ml的70%或80%酒精中加人0.5mL或1mL的浓盐酸 B.3碳酸锂饱和水溶液 在100mL的70%或80%酒精中加人0.5ml.或1mL的浓盐酸 B.4碳酸锂饱和水溶液 碳酸锂2g加100ml蒸僧水,充分溶解 B.595%酒精伊红溶液 伊红0.5g加人100ml.95%酒精中溶化
GB/T22910一2008 C 附 录 规范性附录 免疫组织化学检查的试剂配制 C.1蛋白酶K缓冲溶液 C.1.1配方 Tris/Hemol/L,pH8.0 2.5mL CaCl.(0.1mol/I) 0.75ml 加蒸水至 50ml C.1.2配法 用前加蛋白酶K14.7mg/mL)17AL使终浓度达54g/mL C.23%双氧水-甲醇(使用前5min配制 50mL 甲醇 H,O.(30% 1.5mL C.310×0.1mol/LPBs(plH7.4 NaCI 80 g KCl 2g Na;HPO. 14.4g KHPO 2.4g 使用时作10倍稀释 加水800ml溶解,调pH到7.4,加水至1L C.45%正常猪血清(NSs) 0.1mol/1PBS(pH7.4 4ml NSS 200AL C.5ayer氏苏木素液 C.5.1配方 苏木精 lg 钾明酬 50g 碘酸钠 0.2g 水合氯醛 50g 枸橡酸 1g 1000mL 燕僧水 C.5.2配法 将苏木精、钾明帆及碘酸钠依次加人水中略加热并搅拌,待全部溶解后过夜 再加人水合氧醛及 枸橡酸并加热煮沸5min 冷却后过滤备用 如不急用可以不煮沸而在室温下待其成熟后使用,染液 可以贮存较长时间