酿酒酵母和乳酸克鲁维酵母的鉴定方法

酿酒酵母和乳酸克鲁维酵母的鉴定方法

国家标准 GB/T41219一2021 酿酒酵母和乳酸克鲁维酵母的 鉴定方法 ethudth”idemtfteatonofSacharomyweseretiaeadKluyomyes lactis 2021-12-31发布 2022-07-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/41219一2021 前 言 本文件按照GB/T1.1一2020<标准化工作导则第1部分;标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 本文件由全国食品工业标准化技术委员会(SAC/TC64)提出并归口 本文件起草单位;食品发酵工业研究院有限公司、广东省食品工业研究所有限公司、乐斯福(明 光)有限公司、安琪酵母股份有限公司、山东圣琪生物有限公司 本文件主要起草人，孟镇、周世伟,周芳梅、刘明、郑国斌、易勇,武竹英、吴李嫩孙雅芳、张继祥 郭新光、钟肖琼、朱永兵、孟庆祥、赵学文、张媛媛
GB/41219一2021 酿酒酵母和乳酸克鲁维酵母的 鉴定方法 范围 本文件规定了酿酒酵母(Saccharomycescerewisiae) )和乳酸克鲁维酵母(Kuyeromyces s)的 lact2s 鉴定原理、鉴定方法和鉴定结果表述 本文件适用于酿酒酵母(Succharomycescerevuisiae )和乳酸克鲁维酵母(Kuyeromyceslactis)的 种水平鉴定 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件 GB4789.1食品安全国家标准食品微生物学检验总则 GB/T66822008分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 缩略语 下列缩略语适用于本文件 bp;碱基对(basepair DDB;日本DNA数据库(DNADataBankofJapan) DNA;脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicaceid) dATP;脱氧腺苷三磷酸deoxyadenosinetriphosphate' lCTP脱氧胞苷三磷酸(deoxyceytidinetriphosphate) dGTP;脱氧鸟苷三磷酸(G deoxy-guanosinetriphosphate 小NTP脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate dTTP;脱氧胸苷三磷 酸(deoxy-thymidinetriphosphate) dUTP;脱氧尿苷三磷酸( deoxy-uridinetriphosphate) EB;澳化乙锭(Ethidiumbromide) EDTA:乙二胺四乙酸ethylene(diaminetetraaeeticacid EMBsL.;欧洲分子生物学实验室(TheEauropean.Molcularhoogylaborator?) PCR:聚合酶链式反应(polymerase chainreaction Taq:水生栖热菌(thermusaquatieu
GB/T41219一2021 Tris;三羚甲基氨基甲烧[tris(hydroxsymethyl)aminomethane YM酵母麦芽(YeastMalt) Dextrose YPD:酵母浸出粉腑葡萄(YeastExtract tPeprtone" 26srDNA;26S核糖体脱氧核糖核酸(26Sribosomaldeoxyribonucleieacid) 鉴定原理 获得酿酒酵母(Saccharomycescerevuisiae)和乳酸克鲁维酵母(Kluyeromyceslactis)菌种纯培养 物后,采用表型试验和聚合酶链式反应(PCR)方法相结合的方式鉴定 鉴定方法 6.1表型试验 根据酵母菌株的培养形态,生理生化特征等,与分类系统对照,得到菌株的分类信息,雕酒酵母 yerom.yceslactis表型试验按照附录A的方法鉴 Saccharomycescerevisiae和乳酸克鲁维酵母(Kuy 定,也可按照自动微生物鉴定系统等方法进行鉴定 6.2PCR方法 获得待鉴定菌种纯培养后,提取待鉴定菌种的基因组DNA,并对目标序列进行扩增(26SrDNA D1/D2区序列,将扩增产物纯化后进行测序,并将测序得到的DNA序列与已有核酸序列数据库(如 (GenBank、EMBL、,DDB等)中已知参考序列进行同源性搜索比对,得到菌株的分类信息,酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)和乳酸克鲁维酵母(Kluyeromyceslactis26srDNAD1/D2序列分析 (PCR方法)按照附录B的方法鉴定,也可使用其他目标序列进行鉴定 鉴定结果表述 根据菌株的核酸序列、形态特征观察和生理生化特征,对照通用的鉴定系统,确定待鉴定菌株的分 类地位 菌种名称采用国际命名规则,使用属名和种加词的拉丁词,并附中文译名,有异名时应同时 标注
GB/41219一2021 附 录 A 规范性 酿酒酵母和乳酸克鲁维酵母的表型试验方法 A.1设备和材料 除另有规定外,实验用水应符合GB/T6682一2008中三级水的要求 A.1.1超净工作台 A.1.2恒温培养箱 A.1.3恒温水浴培养箱 A.1.4光学显微镜;放大倍数400以上 A.1.5高压灭菌锅 A.1.电子天平感量0.0lg 7 pH计或pH比色试管或精密pH试纸 A.1.8巴林糖度计 A.1.9无菌培养皿;直径90mm. A.1.10无菌锥形瓶;250ml,500ml A.1.11试管:15mm×150mm A.1.12无菌盖玻片:75%乙醇浸泡的清洁盖玻片 A.1.13无菌载玻片:75%乙醇浸泡的清洁载玻片 A..2培养基和溶液 麦芽汁液体培养基;麦芽汁加水稀释至10 Bx(巴林糖度计),分装于试管,每管约 A.2.1 Bx15 33 mL,在高压灭菌锅中121C灭菌15min A.2.2麦芽汁琼脂培养基;麦芽汁加水稀释至10“Bx一15"Bx(巴林糖度计),加2%琼脂粉,在高压灭 菌锅中121C灭菌15min 临用时加热融化琼脂,冷却至50C时使用 A.2.3玉米粉琼脂培养基称取12.5g黄玉米粉加人到300mL水中混匀,置恒温水浴培养箱中以 60C热水浴保温1h,用滤纸过滤,滤液加水至300mL,加人3.8g琼脂,加热溶解,分装至锥形瓶中,在 高压灭菌锅中115C灭菌15nmin. A.2.4MeCL.ary琼脂斜面培养基;分别称取葡萄糖1.0g、氯化钾1.8g、酵母膏2.5g、醋酸钠8.2g、琼 脂20g,加人到1000ml.水中,加热溶解,调节pH至6,4士0.2,分装至试管中,在高压灭菌锅中115C 灭菌15nmin后,经自然冷却.待气压降至零时.将试管从高压灭菌锅中取出.趁热直接摆成斜面,待凝固 后备用 A.2.5YPD液体培养基:分别称取酵母粉5.0g、蛋白胯10.0经、葡萄糖20.0g,加人到1000mL水中 加热溶解,分装至试管中,在高压灭菌锅中116C灭菌15min A.2.6YM琼脂培养基;分别称取酵母浸膏3.0g,麦芽粉3.0g,蛋白眸5.0g,琼脂20.0g,加人到 1000mL水中,加热溶解,分装至锥形瓶中,在高压灭菌锅中121C灭菌15min A.2.7无菌生理盐水;将8.5g氯化钠加人到1000ml 水中,搅拌至完全溶解,分装后,在高压灭菌锅 中121C灭菌15min. A.2.8染色液 A .2.8.1孔雀绿染液;将5.0g孔雀绿加人少许水中充分混匀,待完全溶解后,加水定容至100mL混 匀备用
GB/T41219一202 A.2.8.2 番红水溶液;将0.5g番红加人少许水中充分混匀,待完全溶解后,加水定容至100mL混匀备用 A.3试验步骤 A.3.1无菌要求 全部操作过程均应遵循无菌操作程序 A.3.2菌株活化 A.3.2.1样品处理;半固体或液体菌株直接活化 固体菌株或真空冷冻干燥菌株,可先加适量无菌生 理盐水或其他适宜稀释液,溶解菌粉后再活化 A.3.2.2活化;用接种环挑取一环至两环处理好的样品(见A.3.2.1)接种在麦芽汁液体培养基中,25 士1C培养48h72h,进行活化,获得培养物 A.3.3酿酒酵母的鉴定 A.3.3.1接种和培养 A.3.3.1.1取一环至两环活化的培养物见A.3.2.2)接种在麦芽汁液体培养基中,在25C士1C恒温 培养箱中培养3d 观察是否形成菌醋,菌环或岛,并用无菌水制作水浸片在显微镜下观察,记录酵母细 胞的形状、大小及增殖方式 A.3.3.1.2取活化后的培养物(见A.3.2.2)以划线法接种在麦芽汁琼脂平板培养基中,在25C士1C 恒温培养箱中培养3d,观察其菌落形态 A.3.3.1.3在无菌培养皿中倒人15mL 20mL融化的玉米粉琼脂培养基,待凝固后,在培养基表面用 活化的培养物(见A.3.2.2),以划线法接种两条或三条,每条线上盖以无菌盖玻片，盖上培养皿盖,在 28C士1C恒温培养箱中培养4d5d后打开培养皿盖,取下盖玻片,放到无菌载玻片上,在显微镜下 观察是否有菌丝生长及菌丝类型,或打开培养皿盖,在显微镜下直接观察 A.3.3.1.4将活化好的培养物(见A.3.2.2)接种于麦芽汁琼脂斜面培养基中,在25笔士1C恒温培养 箱中培养24h,连续转接培养两次或三次后,用接种环取转接后的培养物,接种到McCLary琼脂斜面培 养基中,在25C士1C恒温培养箱中培养7d,涂片后在酒精灯火焰上固定,用染色液进行染色(在涂片 上滴加孔雀绿染色液,染1min~1.5min,水洗;加95%乙醇脱色30s,水洗;最后用番红染色液复染 30s1min,水洗、干燥),显微镜下观察是否形成子囊抱子、抱子的形状和特点,每个子囊内的袍子数 等 未见子囊袍子的,在17C士1C恒温培养箱中培养,每周检查一次,至少检测六周 A.3.3.2菌种鉴定 A.3.3.2.1菌落及培养特征 25C士1C静止培养3d后,在麦芽汁液体培养基底部有沉淀产生,不形成浮膜;在麦芽汁琼脂平 板培养基中形成乳白色、有光泽,不透明、扁平状、偶尔隆起或折叠,边缘整齐的菌落 A.3.3.2.2涂片镜检 酿酒酵母细胞呈球状、卵球形或长形(34m一84m)×(5um~104m),单个或成簇状,多边芽殖; 子囊抱子呈球形、卵形,表面光滑,每个子囊含有1个4个子囊抱子;在玉米粉琼脂培养基上不生长假 菌丝或有不典型的假菌丝形成 A.3.3.2.3生理生化特征 挑取麦芽汁琼脂培养基中典型菌落进行生理生化反应检测 酿酒酵母生理生化特征见表A.1
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GB:/T41219?2021 A.1??() ?? ? Saccharomycescereuisiae D? D? Myo- D- ? D D N-?-D? ? ? ? 2-- 5-?- D? ? ? 10%?/5% 50%D γ DBB ? 80? 25 30 37 40 ???;-?;v???????
GB/41219一2021 A.3.4乳酸克鲁维酵母的鉴定 A.3.4.1接种和培养 A.3.4.1.1取1环~2环活化的培养物见A.3.2.2)接种在YPD液体培养基中,在25C士1C恒温培 养箱中培养3d 观察是否形成菌、菌环或岛,并用无菌水制作水浸片在显微镜下观察,记录酵母细胞 的形状、大小及增殖方式 A.3.4.1.2取活化后的培养物(见A.3.2.2)以划线法接种在YM琼脂培养基中,在25C士1C恒温培 养箱中培养3d,观察其菌落形态 A.3.4.1.3在无菌培养皿中倒人15ml20ml融化的玉米粉琼脂培养基,待凝固后,在培养基表面用 活化的培养物见A.3.2.2),以划线法接种两条或三条,每条线上盖以无菌盖玻片,盖上培养皿盖,在 28C士1恒温培养箱中培养4d5d后打开培养皿盖,取下盖玻片,放到洁净载玻片上,在显微镜下 观察是否有菌丝生长及菌丝类型,或打开培养皿盖,在显微镜下直接观察 亿士1C恒温培养 A.3.4.1.4将活化好的培养物(见A.3.2.2)接种于麦芽汁琼脂斜面培养基中,在25 箱中培养24h,连续转接培养两次或三次后,用接种环取转接后的培养物,接种到McCLary琼脂斜面培 养基中,在25C士1C恒温培养箱中培养7d,涂片后在酒精灯火焰上固定,用染色液进行染色(在涂片 上滴加孔雀绿染色液,染1nmin一1nin,水洗;加95%乙醉脱色0,,水洗;最后用番红染色液复染 nmn,水洗、干燥),显微镜下观察是杏形成子囊袍子,袍子的形状和特点、每个子囊内的抱子数 30s1 等 未见子囊袍子的,在17C士1C恒温培养箱中培养,每周检查一次,至少检测六周 A.3.4.2菌种鉴定 菌落及培养特征 A.3.4.2.1 25C士1C静止培养3d后,在YPD液体培养基中可形成薄的浮膜;在YM琼脂培养基上形成生 长旺盛、有光泽、呈奶油色或粉红色的菌落 A.3.4.2.2涂片镜检 乳酸克鲁维酵母细胞呈椭圆形(24m一6m)×(2m一8m),单独、成对或以短链形式出现;子 囊袍子呈圆形、椭圆形或肾形,每个子囊含有1个一4个子囊袍子;在加盖玻片的玉米粉琼脂培养基上 通常形成发育不良的假菌丝 A.3.4.2.3生理生化特征 挑取YM琼脂平板培养基中典型菌落进行生理生化反应检测 乳酸克鲁维酵母生理生化特征见 表A.2 表A.2乳酸克鲁维酵母生理生化特征 乳酸克鲁维酵母 类型 鉴定项目 Kuyeromyceslactis 葡萄糖 半乳糖 发酵 蔗糖 麦芽糖 乳糖
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GB/41219一2021 表A.2乳酸克鲁维酵母生理生化特征(续 乳酸克鲁维脖母 类型 鉴定项目 Kayeromyceslactis 琥珀酸 柠檬酸 D氨基葡萄糖 D葡萄糖酸 同化 N-乙酰-D葡萄糖胺 十六烧 硝酸盐 无维生素 木糖醇 2-酮基-葡萄糖酸钢 D葡萄糖醛酸 葡萄糖酸-心-内酯 无氨基酸 亚硝酸盐 乙胶 赖氨酸 其他 产生淀粉 DBB 明胶 0.01%放线菌啊 30生长 尸胶 10%氯化钠 50%葡萄糖 注1:十表示阳性;一表示阴性;v表示可变反应;s表示缓慢的阳性反应 注2:在发酵和同化等特性的反应中,上标“”表示在乳酸克鲁维酵母和乳酸克鲁维酵母变种中可能具有不同的 特征 上标“h”表示CBS4693菌株具有不同的特征
GB:/T41219一2021 附 录 B 规范性) 酿酒酵母和乳酸克鲁维酵母的26SsrDNAD1/D2序列分析方法(PCR方法) 试剂和材料 B.1 警示澳化乙锭有致癌作用,配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废弃物 除另有规定外,试剂均为分析纯或生化试剂,实验用水为灭菌双蒸水或蒸圜水 B.1.1质控菌株 大肠杆菌ATCC25922,酿酒酵母ATcC18824T=JCM7255T=CGMCC2.1882T、乳酸克鲁维 酵母ATcC8585T,或目标菌种的其他已确定分类地位的参考菌株 B.1.2麦芽汁液体培养基;麦芽汁加水稀释至10“Bx15"Bx(巴林糖度计),分装于试管,每管约 3mL,在高压灭菌锅中121C灭菌15min B.1.3TaqDNA聚合酶 B.1.4adNTP混合游液;将浓度为10mmol/L的dATP.dTTP,dlcTP,dGTP种脱氧核糖核苷酸游 液等体积混合 B.1.5琼脂糖 B.1.610g/L.澳化乙锭(EB)溶液;称取1.0g澳化乙锭,溶解于100mL.水中,避光保存 注:根据需要可选择其他效果相当的核酸染料代替澳化乙作为核酸电泳的染色剂 B.1.7DNA分子量标记物(DNAMarker). B.1.8酵母基因组INA提取试剂盒 B.1.910nmol/1氢氧化纳(Na(OH)溶液;在160ml水中加人80.0只氢氧化钠,溶解后,冷却至室温 再加水定容至200ml,混匀备用 B.1.10500mmol/LEDTA乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na)溶液(pH=8.0);称取18.6丝乙二胺四乙 酸二钠,加人70ml水中,缓慢滴加氢氧化钠溶液(B.1.9)直至EDTA-Na完全溶解,用氢氧化钠溶液 (B.1.9)调节pH至8.0,加水定容至100mL.混匀,在高压灭菌锅中115C灭菌15min室温保存备用 B.1.1150×TAE缓冲液;称取242.2g三羚甲基氨基甲烧(Tris),加57.1mL冰乙酸,100ml乙二胺 四乙酸二钠溶液(B,1.l0),溶于水中,然后加水定容至1000mL,混匀,在高压灭菌锅中115C灭菌 15nmin室温保存 使用时用水稀释成1×TAE B.1.122%琼脂糖凝胶;称取称取2.0g琼脂糖,于100mL1×TAE缓冲液中,用微波炉加热溶解琼脂 糖,冷却至55C60C,加人10g/L澳化乙锭溶液约5EB溶液或适量的其他核酸染料,至终浓度 为0.5"g/ml左右,轻轻摇匀后,缓慢倒在制胶模具上 B.1.1310×PCR缓冲液 B.1.146×上样缓冲液(6×loadingbuffer). B.1.15无菌PCR反应管 B.1.16无菌离心管;l.5mL.2mL B.2 仪器和设备 B.2.1电子天平;感量0.01g B.2.2PCR扩增仪 B.2.3离心机 10
GB/41219一2021 B.2.4紫外凝胶成像仪 B.2.5电泳槽电泳仪等电泳装置 B.2.6微量移液器:10L、100L、200L、1000L B.2.7恒温水浴锅 B.2.8高压灭菌锅 B.2.9微波炉 B.2.10巴林糖度计 B.2.11超净工作台 B.3实验室基本要求和生物安全与质量控制 应符合GB4789.1的规定 B.4试验步骤 B.4.1菌株活化 B.4.1.1样品处理;半固体或液体菌株直接活化 固体菌株或真空冷冻干燥菌株,可先加适量无菌生 理盐水或其他适宜稀释液,溶解菌粉后再活化 B.4.1.2活化:用接种环挑取1环2环处理好的样品见B.4.1.1)接种在麦芽汁液体培养基中 25C士1C培养48h72h,进行活化获得培养物 B.4.2DNA模板制备 B,4.2.1DNA模板提取 无菌条件下,移取处于对数生长期的1.5ml酵母液体培养物,10000r/min离心2min~5min,小 心去除上清液 按照酵母基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA模板,所提取的模板DNA溶于 50L无菌双蒸水中,一20C保存,备用 B.4.2.2DNA模板浓度测定 按照GB/T19495.3规定的方法执行 B.4.3引物,PCR反应体系及反应条件 B.4.3.1引物选择 以酵母26SrDNAD1/D2区域序列为目的片段,长度550bp一600bp,上游引物序列;5’-GCA TATCAATAAGCGGAGGAAAAG3',下游引物序列;5'GGrccGTGTTTcAAGAcGG 3 B.4.3.2反应体系 10xPRCR缓冲液(含Me')5L,模板3L一5l引物各0.4wmol/L..TuqINA聚合鹏1.5u. dNTPs0.2mmol/L,无菌双蒸水补充至504L,同时设置阴性对照,阳性对照和空白对照 B.4.3.3反应条件 95C预处理5 min ,95C变性1min,52退火1min,72C延伸lmin30s,36个循环后,72延 伸10min. n,4C保存反应产物 1
GB/T41219一2021 B.4.4CR质量控制 每个PCR反应均应设置两个平行试验,同时应设置空白对照、阳性对照和阴性对照,空白对照的 PCR反应体系中使用无菌双蒸水代替DNA模板,阳性对照使用与目标菌种同种或同属的质控菌株的 DNA为模板,阴性对照采用不含目标序列的DNA为模板 B.4.5CR扩增产物的电泳检验 将2%琼脂糖凝胶放置在电泳槽中,在电泳槽中加人1×TAE缓冲液,使溶液没过胶面,吸取5HL PCR扩增产物与1AL6×上样缓冲液混合均匀后,在凝胶点样孔中点样,同时根据目的片段大小,在点 样孔中加人DNA分子量标记物,接通电源在8V/em12V/cm,恒压,电泳20min30min 在紫外 凝胶成像仪下观察电泳结果,拍照并记录结果 B.4.6PCR结果判断 当出现下列情况之一,则PCR方法鉴定结果无效,应重新进行试验 -两份平行测试样品的结果不一致; 空白对照或困性对照出现条带， 阳性对照未出现目的片段 B.4.7序列测定及比对 将所得PCR产物进行测序,获得序列后,将所得序列输人核酸序列数据库,按照操作说明,进行同 源性搜索比对,并构建系统发育树,报告菌种种属信息 12
GB/41219?2021 ο [1]KurtzmanC.PFell,Jackw.Theyeasts:ataxonomiestudy[M]KluwerAeademicPub lishers2013 13