国家标准 GB/T26938一2011 牛胚胎生产技术规程 stamdardforprduectiontechmolosyofboineembryo 2011-09-29发布 2012-02-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/T26938一2011 前言本标准的附录A为规范性附录,附录B,附录C,附录D为资料性附录本标准由农业部提出本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口本标淮起草单位;内蒙古自治区家畜改良工作站本标准主要起草人:高雪峰、张立、包呼格、韩锦龙、李忠书、陈巴特尔、黄春华、包和平、德庆、刘长海
GB/T26938一2011 牛胚胎生产技术规程范围本标准规定了供体牛的选择与饲养管理、超数排卵及配种、牛非手术冲胚及胚胎质量鉴定、胚胎的冷冻与保存等技术规程本标准适用于牛体内胚胎生产技术操作规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB4143牛冷冻精液 GB/T5458液氮生物容器术语和定义下列术语和定义适用于本标准供体牛donor 可用于胚胎生产的母牛供体牛的选择与饲养管理供体牛的选择条件品种优良,符合品种外貌特征,生产性能好 1.2遗传性能稳定.谱系清楚年龄以14月龄至10岁为宜无流产史,产后空怀90d以上,有两次以上正常发情周期 4.1.5体质健壮,生殖器官和繁殖机能正常,无遗传和传染性疾病 4.2供体牛的饲养管理保持饲养环境卫生、温湿度适宜,避免应激反应 4.2. 制定合理的日粮配方 2 4.2. 3 满足清洁卫生的饮水需要 4.2.4超排前8周加强饲养管理,并适量补充维生素A、维生素D,维生素E和微量元素供体牛的超数排卵及配种 5.1超数排卵 5.1.1供体牛的同期发情处理 5.1.1.1药品所用药品见附录A
GB/T26938一2011 5.1.1.2同期发情方法 5.1.1.2.1肌肉注射G法第一次注射:在任意一天第二次注射在第一次注射后第11天第二次注射后24h一96h时观察发情 5.1.1.2.2CIR法选定任意一天放人CIDR(含孕激素阴道栓. 5.1.2超数排卵方法以母牛自然发情、PG法发情或放CIDR之日作为发情周期第0天,在9d13d中的任意一天开始注射FSH,每天早、晚各注射1次,间隔12h连续4d,递减注射放CIDR的供体,在第8次注射FSH 之后,取出CIDR 具体方法参见附录B. 5.1.3重复超数排卵重复超排间隔时间一般为45d一60d,方法同5.1.2 5.1.4供体牛发情鉴定在第8次注射FsH之后,对超数排脚供体牛,每隔6h观察一次,每次0.5h以上以母牛稳定站立接受其他牛爬跨或直肠检查作为发情的准确时间 5.2配种 5.2.1对种公牛的要求谱系清楚,检疫合格,遗传性能稳定,生产性能优良 5.2.2配种所需器材配种所需器材见附录A 人工输精操作要求 5.2.3.1母牛外阴部应经过清洗消毒 5 2 .3.2输精枪应保持无菌 5.2.3. 冷冻精液质量符合GB4143的规定 3 5.2.4配种时间确认发情12h后,进行第一次输精,间隔12h进行第二次输精,每次输精1支一2支,共输精2次3次牛非手术胚胎采集及胚胎质量鉴定 6.1非手术胚胎采集 .1.1非手术胚胎采集所需主要器材 6. 非手术胚胎采集所需主要器材见附录A 6.1.2非手术胚胎采集所需药品非手术冲胚所需药品见附录A 改进的磷酸盐缓冲液的配制 6.1. 3 改进的磷酸盐缓冲液(PBS)配方参见附录C .1.4非手术胚胎采集时间 o 供体牛超排发情后7d士0.5d采集胚胎 6.1.5非手术胚胎采集步骤 6.1.5.1将供体牛稳定,用2%利多卡因在荐椎和第一尾椎结合处或第一尾椎和第二尾椎结合处进行尾椎硬膜外麻醉,利多卡因用量宜每头5mL 6.1.5.2麻醉后将牛尾固定,清除直肠宿便,阴部及外阴清洗消毒 3 6.1.5. 用扩宫棒扩张子宫颈,然后插人宫颈黏液器将黏液抽出,随后把带内芯的冲胚管慢慢插人子
GB/T26938一2011 宫角,当冲胚管到达子宫角弯曲处,拔出内芯5em左右,再把冲胚管往子宫角前端推进,至冲胚管到达子宫角前端1/31/2处 6.1.5.4冲胚管先充一定气体,待确定气囊位置后,再充气至冲胚管固定为宜 6.1.5.5抽出冲胚管内芯 6.1.5.6连接冲胚管 6.1.5.7用50mL注射器每次吸取30mL一40mL冲卵液,夹住三通导管的输出管,将PBs从输人管注人子宫角,然后夹住输人管,使回收液从输出管流到集卵杯(500mL容量),反复冲洗,每个子宫角用 400mL一500mL的PBs溶液 6.1.5.8把集卵杯内的回收液在温室(20C25)下,用集卵漏斗过滤,最后保留10mL左右液体、培养皿中,进行镜检倒人100 mm 6.1.5.9两侧子宫角胚胎采集完成后,将气囊空气放出,冲胚管抽至子宫体,注人青霉素、链霉素等抗菌素或预防子宫炎的药物 6 1.5.10肌肉注射或宫内输人前列腺素或类似物 6 2 胚胎的检出与质量鉴定 6.2.1检胚把盛有回收液的培养皿放在体视显微镜下,在培养皿底划线分区,逐区检查,检出胚胎放人保存液中保存 6.2.2胚胎的发育期鉴定超数排卵后的供体牛在发情后7d士0.5d时,胚胎处于以下发育期;桑糍胚(M)、致密桑棋胚 CM),早期囊胚(EB),囊胚(B),扩张囊胚(EXB) 做好采胚记录供体牛胚胎采集,保存记录表参见附录D 6.2.3胚胎质量鉴定用形态学方法进行胚胎质量鉴定,将胚胎依次分为A,B.c,D四级 A级;透明带完整无缺陷、薄厚均匀,胚龄与发育阶段相一致,卵裂球轮廓清楚,透明度适中,细胞密度大,卵裂球均匀,无游离细胞或很少,变性细胞比例少于10% B级;透明带完整无缺陷、薄厚均匀,发育阶段基本符合胚龄,轮廓清楚,明暗度适中或稍暗或稍浅细胞密度较小,卵裂球较均匀,有小部分游离细胞,变性细胞比例为10%一20% -多半,细胞变 c级;透明带完整或有缺陷,轮咖不清楚,色泽过暗或过读,细胞密度小,突出细胞占一性率为30%40% D级;透明带完整或有缺陷,胚胎发育停滞,变性、卵裂球少而散,为不可用胚胎胚胎的冷冻与保存胚胎的冷冻胚胎冷冻所需器材胚胎冷冻所需器材见附录A 7.1.2胚胎冷冻所需溶液胚胎冷冻所需溶液见附录A 7.1.3胚胎冷冻操作步骤 7.1.3.1胚胎的洗涤 A级、.B级林胎冷冻前在保存液洗涤10次一12次 7.1.3.2胚胎的平衡 min20min 将洗涤后的胚胎放人冷冻液中,室温下平衡15"
GB/T26938一2011 7.1.3.3胚胎的装管将平衡后的胚胎装人0.25m细管,装管顺序;冷冻液(约7cm)一气泡(约0.5cm)一冷冻液加胚胎(约2cm)气泡(约0.5 cm -冷冻液(约3em)(见图1) 乙二醉冷冻液每支细管装1枚胚胎,甘油冷冻液每支细管装1枚5枚胚胎气泡气泡棉塞冷冻液冷冻液十胚胎冷冻液封口处细管标记图1胚胎装管图 7.1.3.4胚胎标记在细管塞上标记胚胎信息,包括供体牛号、发育期、数量、质量以及生产日期等如1枚1级桑樵胚表示为1M,其中M表示发育期，M左侧数字1表示数量,右下角数字1表示质量乙二醇冷冻的胚胎应标记直接移植“DT”符号同时记录在附录D中 7.1.3.5胚胎冷冻程序胚胎保存液洗涤10次12次10%甘油/保存液或1.5nmol/L乙二醇/保存液一平衡 20min装管-一冷冻仪(一5.5C-7.0)平衡5min-一植冰-一平衡5min-一以0.3C/min~ 1o min 0.6C/ /min的速率下降---32C-35C平衡10min-投人液氮 7.2胚胎的保存 7.2.1存放冷冻胚胎的液氮罐符合GB/T5458规定 7.2.2将标记后的冷冻胚胎放人液氮中保存
GB/T26938?2011 ?A 淶?? ???? A.1??顢?? A.1.1?(PG)? A.1.2м?(CIDR) A.1.3(FSH) A.1.4? ?? .2 A ?(5ml,l0ml,20mL),CIDR,?,??,??侫?侫?? ?侫??? .3 ? A. ?(16*20*,?о??,?,??轺??(5ml 10ml,20mL50mL),?100mm35mm,500mL??,? ?? ??? ?λ?(PBS),?,0.1%?2%?,?,ù,ù ?????? A.5??? ?????,0.25m????,?,? ?? A.6??? A.6.1?:0.4%????PBS? A.6.2??:10%?1.5mol/???(0.1mol/L
GB/26938一2011 附录 B 资料性附录 FSH4d注射时间、剂量表B.1 FSHH4d注射时间,剂量发情周期天数第0天第9天第10天第11天第12天第13天第14天 FSH FSH FSH FsH 早 A 1.8ml十发 2.3ml 2.8ml 1.3ml PG0.6mg 情情 FSH FSH FSHH FSH A 晚 AA 2.8ml 2.3ml 1.8ml 1.3ml 注l;本表以FsH总剂量328mg为例(2.8十2.3十1.8+1.3)x2x20=328mg. 注2:FS(每瓶400mg)用20ml生理盐水稀释注3;第五次注射FSH时,同时肌注G0.6mg 注4:AI表示人工授精
GB/T26938一2011 附录 c 资料性附录改进的磷酸盐缓冲液(PBs)配方表c.1改进的磷酸盐缓冲液(PBs)配方成分量 8.00g/L NaC 0.20g/L KCl HP HR Na" 0,(a 12H.O 1.50g/L(2.916g/L) CaCl,(CaCl2H.,O) 0,10g/L(0,132g/L) KH,PO 0.20g/L MgCl.MgCl6H.O) 0.10g/L(0.2133g/L) 丙酮酸钠 0.036g/1 葡萄糖葡萄糖H.O) 1.00g/L(1.10g/L 青霉素 100000U 链霉素 50000U 注，配制说明 1配制PBs溶液的所有成分应是分析纯以上的化学制剂 2配制PBS溶液所用水是电阻值超过18Mn的超纯水 3 配制成的PBS溶液需过滤灭菌,低温冷藏(4 C) 自制现用现配 C5 4配制成的PBS溶液批pH为7.27.6,渗透压为270m(Osm一290m(Osm (5)购买的成品按说明书在有效期内使用
GB/T26938一2011 附录 D 资料性附录供体牛胚胎采集、保存记录表液氮罐提筒号国产/进口冲胚时间畜主供体耳号品种注册号精液编号公畜注册号冷冻日期激素处理:发情日 LH FSH品牌(厂家) 批号孕酮处理预计发情日实际发情日人工授精日第一次第二次第三次技术员时间小筒编号细管编号胚胎数量胚胎质量解冻日期备注黄体卵泡回收冷冻移栓桑樵囊退化未受精卵冷冻液;10%甘油 1.5mol/1.乙二醉冷冻液(直接移植DT

牛胚胎生产技术规程GB/T26938-2011

一、生产流程

牛胚胎生产的主要流程包括以下几个步骤：

1. 供体动物选配。选择体型健康、年龄适中的母牛作为供体动物。
2. 取卵和受精。取出供体动物的卵子，并在离体培养液中进行培养，再用高质量的精子进行受精。
3. 胚胎培养。将受精卵放入培养皿中，在特定的环境下进行培养，直至发育成胚胎。
4. 胚胎移植。将胚胎移植到接受母牛的子宫内，进行妊娠。
5. 分娩与后续管理。待母牛分娩后，需要对幼仔进行照顾和管理，以保证胚胎生产的成功率。

二、操作要点

牛胚胎生产需要严格遵循相关的操作要点，包括以下几个方面：

1. 供体动物的选配应该做到体型健康、年龄适中，并在取卵前对其进行全面检查。
2. 取卵和受精操作需要在无菌的环境下进行，避免细菌等污染物对胚胎质量的影响。
3. 在胚胎培养过程中需要控制好温度、湿度、氧气浓度等因素，以保证胚胎发育的正常。
4. 胚胎移植需要在特定时间内完成，并在移植后对母牛进行严格的观察和护理。

三、检验方法

牛胚胎生产中需要进行多项检验，以确保胚胎的质量和健康性。主要检验项目包括以下几个方面：

1. 卵子质量的检验。主要通过显微镜观察卵子形态、颜色等特征，以判断卵子的质量。
2. 受精率的检验。通过计算受精卵数与总卵子数之比来评估受精率。
3. 胚胎发育情况的检验。主要通过显微镜观察胚胎的发育情况和形态特征，以判断其健康状态。

四、注意事项

1. 牛胚胎生产工作需要在专业人员的指导下进行，避免不必要的失误和损失。

2. 操作过程中需要保持严格的无菌环境，以减少细菌等污染物对胚胎的影响。

3. 牛胚胎生产需要使用高质量的试剂和仪器设备，以确保胚胎的健康性。

4. 在胚胎移植时，需要选择合适的时间和方法，并对母牛进行充分的观察和护理，避免发生不必要的风险。

五、结论

综上所述，牛胚胎生产技术规程GB/T26938-2011是一项重要的标准，它对于保证牛胚胎生产质量和效率具有重要意义。在实际工作中，我们应该严格遵循相关操作要点和检验方法，确保牛胚胎生产的成功率和质量。