常见畜禽动物成分检测方法液相芯片法

常见畜禽动物成分检测方法液相芯片法

国家标准 GB/T35024一2018 常见畜禽动物成分检测方法 液相芯片法 Deteetionmethodofmammalsandpoultryingredients Sspendedbeadarray 2018-05-14发布 2018-12-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35024一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国生物芯片标准化技术委员会(SAC/TC421)提出并归口 本标准起草单位:检验检疫科学研究院、辽宁出人境检验检疫局、中华人民共 和国上海出人境检验检疫局、山东出人境检验检疫局 本标准主要起草人:陈颖、吴亚君、杨艳歌、韩建勋、刘鸣畅、王斌、黄文胜、曹际娟、王!、张舒亚、 高宏伟
GB/35024一2018 常见畜禽动物成分检测方法 液相芯片法 范围 本标准规定了畜禽产品中常见动物物种成分的液相芯片检测方法 本标准适用于肉及加工品、乳皮张、内脏、动物饲料等畜禽产品中哺乳动物和反乌动物成分,和13 种常见肉品或掺杂成分(骆驼、马、驴、耗牛,水牛,狗、猪,马鹿、羊,鸡、鸭、大鼠、小鼠)动物物种成分的定 性检测 方法的最低检出限为(质量百分比):水牛5%,哺乳、反刍、狗、羊、鸡、大鼠、小鼠为1%,骆驼、 托牛、马鹿、猪、马、驴、鸭的最低检测限为0.1% 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T274032008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 SN/T356国境口岸卫生监督食品采样,送样规程 术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1.1 液相芯片技术 sspendedbeadarray 通过液相杂交将偶联有探针的微球与样品中靶基因序列结合,通过流式细胞技术对样品中的多种 目标成分进行同时检测 3.1.2 液相芯片探针 suspendedarrayprobe 固定于微球表面,能与目标成分亲和结合用于探测目标成分信息的核酸或蛋白分子 3.1.3 质控探针 qualityeontrolprobe 用来监控芯片反应是否正常的探针 注:本标准使用的是人工合成的一段寡核苷酸探针(polyTpolyA,5'端氨基标记. 3.1.4 荧光强度中位值medianluoreseneeintensity 液相芯片检测仪检测到的样品荧光信号值,即软件自动读取与样品结合的微球数量,并进行背景值 校正后得到的数值
GB/T35024一2018 3.1.5 eutofrvalue 闻值 判定阳性信号的最低荧光强度中位值 通过实验数据统计分析后得出,要求防止假阳性结果,同时 保证灵敏度需求 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件 lammoniumbromide) CTAB;十六熔基三甲基嗅化铵(cetyltrithyla DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleicaeid dATP;脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinetriphosphate) dCTP;脱氧胞苷三磷酸(deoxyeytidinetriphosphate) dGTP;脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosinetriphosphate dTTP;脱氧胸苷三磷酸(deoxythy" midinetriphosphate EDC;l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐[N-3-dimethylaminodipropylI)-N'-ethylear bodimade EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) MES:2-吗琳乙磺酸[2-(N-n N-morpholino)-ethanesulfonicacid uwvidin-phyeoerythrobilim) SA-PE:链霉亲和素-藻红素(strepte SDS;十二烧基硫酸钠(sodiumdodeeylsulfate) Tag:水生栖热菌(Thermusaguaticu TE;由Tris和EDTA配制而成的缓冲溶液(Tris-EDTAbufersolution) TMAC:四甲基氯化铵(t tetramethylammoniumehloride) Tis;三(羚甲基)氨基甲烧[tris(hydroxymethyl)aminomelhan 方法提要 对样品中的靶基因进行PCR扩增,通过液相杂交将偶联探针的微球与PCR扩增产物结合,采用流 式细胞技术对目标成分进行检测 每一种带有独特色彩编号的微球固定一种探针,特异结合一种目标 核酸序列 该核酸序列连接荧光标记物 单个的微球通过检测通道时被两束不同波长激光检测,一束 激光检测微球的色标编码,另一束激光检测目标核酸序列荧光标记物 检测单一成分时,将该成分 PCR产物与相应微球进行反应;检测多种成分时,可以将各个成分的PCR产物与微球混合物进行反 应 检测实验室需达到GB/T274032008的要求 检测用引物和探针 5 质控探针及检测用哺乳动物通用引物探针,反刍动物通用引物探针,以及13种特异性引物和探针 序列参见附录A中表A.1 6 试剂 6.1TagDNA聚合酶 6.210×PCR缓冲液 6.3dNTPsdATP,dCTP,dGTP,dTTP) 6.4琼脂糖
GB/35024一2018 6.5澳化乙锭 6.6酚 6.7三氯甲熔 6.8异丙醉醇 6.9无水乙醇 6.10异戊脖 6.11分子量标准品(最小片段>20bp最大片段<2000bp. 6.12TE缓冲液(10mmol/几Tris-HCl,pH8.0,1mmol/LEDTA) 6.13电涨缓冲液(10xTBE.,Tiss4g,棚酸27.5g.20mL.0.5malLEDTATieHcl.pH&.0,加水 至1 000mL;50×TAE:Tris242gl00mL0.5mol/EDTApH8.0,冰乙酸,57.1mL,加水至1L) 6. .14加样缓冲液(0.25%澳酚蓝,40%蔗糖水溶液) 6.15非磁性微球(微球直径5.6m,骏基修饰,按比例掺人660nm和730nm两种分类荧光染色每 种荧光有10种浓度,根据比例不同可以把球型基质分类为100种) 6.160.1mol/儿MES溶液 6.17EDC浴液(d10mg/mL. 6.180.02%Tween-20 6.190.1%SDs. 6.20SA-PE溶液 6.21TMAC溶液(5nmol/LTMAC,20%N-月桂酰肌氨酸,1mol/LTris-HCl,pH8.0,0.5mol/I EDTA,pH8.0) 6.22CTAB提取液(20g/1LCTAB,l.4mol/1NaCl,0.1nmol/1Tis-HCl,0.02nmol/LNaEITA,pH8.0) 6.23除另有规定外,所有试剂均为分析纯 实验用水符合GB/T6682中二级水的要求 仪器设备 7.1PCR仪 7.2液相芯片仪 7.3但温箱 7.4离心机离心力15000g 7.5微量移液器:0.5L一10aL.10L~100L,20L一200AL.3200AL1000Ll 7.6核酸蛋白分析仪 7.7天平:感量0,01mg 样品采集与制备 8.1样品采集与前处理 采样,送样要求应符合GB/T14699.1l和sN/T3561的规定 按照8.1一8.2进行前处理,处理后的 样品分成三等份,包括检样,复检样和贮存样 8.2肉、皮张、内脏等 先依次用70%乙醇和ddH,O冲洗2次一3次,洗去外源成分和调料等,控干水分,搅碎,收集到干 净50mL离心管或干净密封袋中,冻存于一20 8.3乳、饲料等 混匀后直接分装到干净50mL离心管或干净密封袋中,根据样品种类贮存于-20C或4C
GB/T35024一2018 9 检验步骤 9.1DNA提取 称取1g2处理好的样品于50ml.离心管中,加人2ml一5ml.cTAB提取液,加人20L 100的20mg/m蛋白酶K，65C温育1h,期间不时震荡混匀,应保证样品自由悬浮于液体中,必 要时再加人适量CTAB提取缓冲液 室温12000离心10min,转移上清至2mL离心管中,加人等 体积的室温酚/三氧甲熔/异戊醉(25:24:1)颠倒混匀,室温12000！转速下离心10mn 转移上清 液至另一灭菌的离心管中,加人等体积的三氯甲婉/异戊醇(24:1),颠倒混匀,室温下12000 《离心 10min;转移上清至干净离心管中;加人等体积的cTAB沉淀液混匀,室温沉淀1h 加人0.8倍体积 的异丙醇或2倍体积一20C冰箱中预冷的无水乙醉混匀,一20C放置30min1h,12000g4C离心 10min,弃上清,用70%乙醇洗涤沉淀一次,12000g4C离心10 min,弃上清,室温下晾干 加人 50L~100L灭菌双蒸水,室温10min,混匀,一20保存 也可用等效DNA提取试剂盒提取模 板DNA 9.2NA定量 取10ALDNA溶液加蒸水稀释至1ml,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260nm和280nm处的吸光值 DNA的浓度按照式(1)计算,当ODo/OD比值在1.72.1之间时 适宜于CR扩增 扩增前将所有样品DNA调至约5ng/aL50ng/aL A×N×50 000 式中 -DNA浓度,单位为纳克每微升(ng/L); A----260nm处的吸光值; N 核酸稀释倍数 g.3PCR扩增 g.3.1PCR体系 反应体系总体积为25AL,其中包含;10×PCR缓冲液2.5Al,2.5mmol/1dNTP2Al,单一待检 目标动物成分的上、下游引物(根据检测目标物种确定)各0.5AL(引物浓度10wmol/L),5U/L Tag DNA聚合酶0.2AL,5LDNA模板(5ng/AL50ng/AL),用灭菌双燕水补足体积至25AL 9.3.2PCR参数 95C预变性10min;95C30s,6030s,72C30s,30个循环(其中哺乳动物40个循环);72C 延伸5min;4保存 9.4液相芯片检测 g.4.1探针与微球偶联 取出微球存储管以最高转速涡旋30s,超声处理15s 选一种微球50Al1.5ml离心管中， g离心2min,弃上清,用50lL0.lmol/LMEs(pH4.5)重悬微球,彻底涡旋使微球分散成均匀 10000 s 的悬浊液状态,加人一种0.5AL预先稀释好的(0.05nmol)探针 制备新鲜的E:DC溶液(10g/mL). 取2.5LEDC至微球中,彻底混匀,室温避光摇动30min,重复此步骤一次 加人1mL0.1%SDs,低 ,小心移除上清再加人1mL.0.02%Twen-20,低速涡旋重悬 速涡旋混匀,12000片离心2min
GB/35024一2018 12000g离心2min,小心移除上清,最后用75LTE缓冲液重悬微球,4C避光保存 g.4.2杂交反应 单微球探针 9.4.2.1 取样品的PCR产物5L于45L的无菌水中,涡旋混匀 将单一成分微球探针涡旋重悬,与PCR 产物反应 反应体系为;微球0.5"L,PCR产物1AL,1.5×TMAC33AL,用1×TE15.5L 调至 min,60C10min 50AL,热反应条件为;95C5 n,4C保存 9.4.2.2多微球探针 取样品的PCR产物5AL于45L的无菌水中,涡旋混匀 将每一种微球探针均涡旋重悬,与PCR 产物反应 反应体系为;每一种微球探针0.5L,每一种PCR产物1L,l.5×TMAC33AL,用1×TE 15.5AL调至50L 热反应条件为;95C5min,60C10min,4C保存 上机检测 9.4.3 将杂交产物转到无菌抽滤板中,抽干,同时记录杂交体系对应孔位置 将A-PE用1×TE稀释到 4ng/L,每孔加人50AL,避光震荡2min,再室温震荡5min 抽干滤孔板,用125ALTE洗三次,用 25ALTE重悬 用矫正液矫正液相芯片仪,将上述处理好的样品上机检测 10质量控制 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照、质控对照、空白对照 分别以目标引物探针对应的动物物 种的肌肉或DNA溶液作为阳性对照,以提取的植物组织(大豆等任一植物)或DNA溶液作为阴性对 照,用质控探针作检测体系的质控对照,用无菌双蒸水作空白对照 对照样品按照9.1步骤提取DNA 也可使用购买的DNA溶液作为阳性或阴性对照 所有样品设3个重复,以荧光强度中位值的平均值 作为样品读数 11 结果判定与表述 11.1结果判定 1.1.1质控探针荧光强度中位值大于或等于空白对照20倍 1.1.2阳性对照荧光强度中位值大于阂值(各成分闵值设定参见附录A中表A.2) 1.1.3阴性对照荧光强度中位值低于闵值 在满足上述结果条件下,如果样品荧光强度中位值大于或等于阔值,判定为阳性;如果低于闯 11.1.4 值,判定为阴性 11.2结果表述 11.2.1样品检测结果阳性,表述为该样品中含有某某成分 样品检测结果阴性，表述为该样品中某某成分含登低于检测线 11.2.2 12 检测过程中防止交叉污染的措施 按照GB/T27403一2008中附录D的规定执行
GB/T35024一2018 附 录 A 资料性附录) 常见畜禽动物成分液相芯片扩增引物探针序列及检测值 表A.1注明了本标准所使用的哺乳动物、反刍动物、骆驼、马、驴,耗牛、水牛,狗、猪、马鹿,羊、鸡、 鸭、大鼠、小鼠成分检测的引物探针序列,以及靶基因名称 表A.2规定了各靶标的检测信号阔值 表A.1引物和探针序列 物种 序列(5'-3' 基因 F:Biotin-CATCCTCATGTGCTATGTCAGTA 线粒体基因 驴 R:GCACGATGTACATAGGGTATTA tRNA-Thr及 Dloop区 PNH.-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTTGAGcTGATATGG;TGTTGTGcGGGG F;iotinrCACccTcATG;TGcTATG;TcAG;TA 线粒体基因 RGCACGATGTACATAGGcCCATT tRNA-Thr及 D-loop区 -TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTCAGGTGGGTATGGTGTTATGTGGGG F;CAGACGGATGGGGCACCAACC growthhormone 猪 R:Biotin-GCCGCATATCTAGGAGTAGATATC (GHgene PNH TTTTTTTTTGGGCTTTGGGGCTTCCGAATGTGAG ATATTCGAAAATCC cytochrommeb 托牛 R;Biotin-CTccTAGGAGGGAGccG;AAGTTTCAc cytbgene P:NH TTTTTCAACGCATTCATTGACCTTCCAGCTcCCAT 线粒体基因 R:Biotin-CTTG;CTTATATGCATGGGGCATA 水牛 tRNA-Pro及 P.NH TTTTTTCGGAGTGGTAAGACCATATGTTGTATGC Dloop区 CGTACAT(GCGAGG F:AACACGTGATATAACCTTATGCGC 马鹿R:Biotin-TATGTCCTATACACTAACTCATGTGC Dloopregion P:NH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGcTAGAAcAcGCATG;TATAAcAGCAc F;AGCcTTcTcTTCAGTcGCAc cytochromeb 骆驼R;IBiotin-TGGGAGGAcATAGccCATGA ceyb)gene P;NH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATCTGCCGAGATGTCAATTACGGCT F:ACACAACTTCTACCACAACcC Fo synthase 羊 R:Biotin-AAACAATGAGGGTAACGAGGG subunit8 ATP8)gene P.NH， TTTTTTTTTTTTACACcGAAACAAAATACTCCTTGAGAAACA FTATTTGGAGCATGAGCC(GGT cytochrome R;iotin-AGTAAAGTAcCG;GGcTGAcC 狗 oxidasesubuunit ICOgene P;NH TTTTGAGcCTcCTcATccGAGccGAA
GB/35024一2018 表A.1续 物种 序列(5'--3' 基因 F:TGccGAGAcGTN AAACTACGG eytochromeb 大鼠R;Biotin-CTcGTccCACcATGG.AGGAAT (cytbgene P;NH-TTTTTTTm TTTTTAcTGATccGATAcCTACACGCCAAcG F;TGTCGAGACGTAAATTACGG cytochromeb 小鼠R:CTCGTCCGACATGAAGGAAT！ (eybgene ”TTTACTAATCCGATATATACACGCAAACG F;CACCATCARCACCCAAAGCTG 线粒体基因 RBiotin-CTTGCTTATATGCATGGG;GCATA 反绉 IRNA-Pro及 P:NH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTcTGTGGTcTGTGTATGGGcGTGTTATGT Dloop区 TGGCTAGTGGTG F:ccTcAGCAGGGTcTTcAcCA growthhormone R;Biotin-TTCAcTTcTcGTAGACNcG 哺乳 GHgene P:NH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAGCCTGGTGTTTGGCACCTCGGA F;CAGGCTCAAACAACCCCCTA cytochromeb 鸡 R:Biotin-GGGCTAGTGTTAGGAATGGGG eybgene P.NH TTTTTTTTTTTACTACTCCTTCAAAGACATTCTGGGCT eytochromeb R;Biotin-GGGCTAGTGCTATGAGGGGGG 鸭 (eytbgene P;NH TTTTTACTTCTcCTTTAAGGACATcCTAGGAT PR:Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT 质控 P;NH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 注:P表示探针,所有探针5'端氨基化修饰,便于与梭基微球进行偶联;F表示正向引物;R表示反向引物;Biotinm 表示生物素标记,便于与荧光报告分子结合 表A.2探针检测阔值 羊 鸡 样品 马 驴 哺乳反气 骆驼 马鹿水牛托牛 数 狗 大鼠小鼠 阔值(荧光值与 l0X 20× 10 15 20x 8X 100×20× 80× 0X 10X 50× 120×130×80× 空白的倍数)

常见畜禽动物成分检测方法液相芯片法GB/T35024-2018

随着人们对食品安全和质量的关注度不断提高，对于畜禽养殖业中畜禽动物成分的检测也愈加重视。而液相芯片法作为一种新兴的高通量、高精度、多参数分析技术，正逐渐在畜禽动物成分检测中得到广泛应用。

液相芯片法原理

液相芯片法是在微流控芯片上通过光电传感器检测样品中化合物的质量浓度，并根据建立的标准曲线计算出各组分的含量。该方法具有灵敏度高、分辨率高、自动化程度高等优点，可以同时检测多个成分。

GB/T35024-2018标准

GB/T35024-2018是我国畜禽产品成分检测的标准，其中包括了液相芯片法的相关规定。根据该标准，在进行畜禽动物成分检测时，应当使用符合要求的实验室设备和试剂，并按照标准程序进行样品处理、仪器操作和数据处理等步骤。

液相芯片法在畜禽动物成分检测中的应用

液相芯片法作为一种高效、快速、准确的分析技术，已经在畜禽养殖业中得到广泛应用。例如，在鸡肉、猪肉、牛肉等畜禽产品中的脂肪、胆固醇、氨基酸、维生素等成分的检测中，都可以采用液相芯片法进行分析。

结论

随着畜禽养殖业的发展，对于畜禽动物成分检测的需求不断增加。液相芯片法作为一种新兴的高效、快速、准确的分析技术，已经在这一领域中得到了广泛应用。通过遵循GB/T35024-2018标准，在畜禽动物成分检测中采用液相芯片法进行分析，将有助于保障畜禽产品的质量和安全。

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