猪肉制品中植物成分定性PCR检测方法

猪肉制品中植物成分定性PCR检测方法

国家标准 GB/T23815一2009 猪肉制品中植物成分定性PCR检测方法 Protocolofthepolymerasechainreaetionfordetectingplanteomponentsinmeat 2009-05-27发布 2009-09-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T23815一2009 猪肉制品中植物成分定性PCR检测方法 范围 本标准规定了猪肉制品中植物成分的定性CR检测方法 本标准适用于由猪肉制成的半成品和成品中植物成分的定性检测 本标准的检出限为0.5ng植物DNA 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一2008,ISO3696:1987,MOD) GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 术语和定义 GB/T19495.1确立的术语和定义适用于本标准 防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行 抽样和制样 按照GB/T19495.7规定的方法执行 测定方法 6 原理 样品经过提取DNA后,针对植物特异基因的序列设计引物,通过PCR技术,特异性扩增植物基因 的DNA片段,根据PCR扩增结果,判断该样品中是否含有植物成分 6.2试剂和材料 除另有规定外,所用试剂为分析纯或生化试剂,水为按照GB/T6682规定的一级水 6.2.1引物;检测猪肉制品内源和外源基因的引物及其信息见表1 表1猪肉制品内、外源基因所需的引物信息 PCR产物大小 检测基因 引物序列 基因性质 适用范围 bp 正:5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG3’ 猪肉制品 tRNAL.eu 193 植物叶绿体 反;5'-TTcCATTGAGTcTcTccAccT-3" 5’-AAGTTAGAGATCG;GGAGCCTAA-3” 264 猪内源线粒体基因猪肉制品 mitochondrion 5'-AAGGTGACAATAGGTAGTCC-3’
GB/T23815一2009 .2. 琼脂糖;电泳纯 6 6 .2. .3 Tris饱和酚 6.2.4三氯甲炕 6.2.5冰乙股 .2. 6 无水乙醉 R27师发林 6.2.8异丙醉 6.2.9氢氧化钠(NaoH). 6.2.10盐酸(HCl). a.21三粹甲基复慕甲枕(Tio) 6.2.12乙二胺四乙酸钠盐(NaEDTA. 6.2.13蔗糖 6.2.14溴酚蓝 6.2.15乙酸钠(NaAe). 6.2.16苯盼十三氯甲烧十异戊醉(25十24十1,体积比) 6.2.17三叙甲梳十异度醉(24十1,体积比. 6.2.18乙酸钠溶液:3mol/I乙酸钠溶液,乙酸调节pH为5.2 6.2.19 TAE电泳缓冲液，取50×TAE(242g Tris,57.1ml冰乙酸,100ml0.5mol/L 1× NaEDTA,用 Hcl或NaoH调节pH至8.0,定容至1L)按比例稀释 6.2.20TE缓冲液;Tris0.01nmol/L,NaEDTA0.001mol/L,用Hc或Na(oH调节pH至8.o 6. .2.21PCR试剂盒:Taq酶,dNTPs,10×XBuffer,氯化镁(MgCl.) 6.2.22上样缓冲液;0.25%澳酚蓝,40%(质量浓度)蔗糖溶液 6. .2.23澳化乙锭溶液;lmg/mL .2.2470%乙醇 6. 6 .2.25等效DNA提取试剂盒 6.2.26DNA分子质量标准品(50bp) 6. .3 主要仪器 6 3.1PCR热循环仪 .3.2电泳仪 6 6 .3.3凝胶成像系统 .3.4离心机:12000r/min 6. 6. .3. 5 涡旋振荡器 6. .3. .6 分析天平;0.1g 6 .3.7微量可调移液器;0.5L,2Al,10L,20AL,100L,200L,l000l 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 6. .3. 8 6.4检测步骤 6.4.1模板NA的提取 6.4.1.1对照 阳性对照:猪基因组DNA,植物基因组DNA 阴性对照:已知以不含该基因的样品提取的DNA; 空白对照:双蒸水(ddH.O. 6.4.1.2提取步骤 样品DNA提取时设双平行; a
GB/T23815一2009 D)将样品粉碎,取适量样品放人2.0m离心管,加人400LTE缓冲液(6.2.20),于65C水浴 中溶解10min,上下颠倒混匀; 加人与溶液等体积苯十三氧甲婉十异戊醉(25十24+1)(G.2.16),摇晃混匀10min: c d 12000 r/min蜜温离心10nmin,将上清液转移至另一干净的1.5mL离心管中 加人上清液等体积三氯甲婉十异戊醇(24十1)(6.2.17),摇晃混匀10min 12000r/min室温离心10min ,小心吸取上清液; 加人上清液1/10体积乙酸钠溶液(6.2.18)、2倍2.5倍体积经一20C预冷的无水乙醇 (6.2.6),颠倒混匀后一20C静置1h;或加人等体积异丙醇(6.2.8),混匀后室温静置10min; h 12000r/min室温离心10min ,弃去上清液 70%乙醇(6.2.24)洗涤沉淀2次3次,干燥DNA: 50L.0.1XTE(6.2.20)溶解沉淀，4C保存 也可以用等效DNA提取试剂盒(6.2.25)提取DNNA,按试剂盒操作说明书指示进行操作 6.4.2DNA质量的测定 样品中提取的DNA质量的测定用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计(6.3.8)进行测定 取适量DNNA溶液加TE缓冲液(6.2.20)进行稀释,用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 2600mm和280nm处的吸光值A.和Am DNA的浓度按式(1)计算 c=A×N×50/1000 式中 -DNA浓度,4g/L -260nmm处的吸光值; 核酸稀释倍数 N 当An/A比值在1.4以上时,可用于PCR扩增,1.7~2.0之间时,PCR扩增效果好 6.4.3PCR扩增 6.4.3.1PCR反应体系 检测肉制品内,外源基因的PCR反应体系见表2 每个反应体系应设置两个平行反应 同时设置 阳性对照、阴性对照和空白对照 表2PCR反应体系 加人PCR反应体系的体积/ 试剂名称 贮备液浓度 l 10×PCRBuffer 2.5 2,5 MgC 25mmol/I dNTP 2.5mmol/L 2.0 正:0.25 Primers 20pmol/AL 反;0.25 Tag 5U/Al 0.15 Template o.lg/L一0.2g/AL ddH.O 补足反应体系总体积为25
GB/T23815一2009 6.4.3.2PCR反应循环参数 见表3 表3各基因检测PCR反应条件 扩增 基因 变性 循环数 后延伸 94C/30s 植物叶绿体 94C/5nmin 60/30s 35 72C/5minm tRNALeu基因 72C/30s 94C/30s 35 猪内源基因 94C/5min 54C/30s 72/5minn 72/30s 6.4.4PCR扩增产物电泳检测 将适量的琼脂糖(6.2.2)加人1×TAE缓冲液(6.2.19)中,配制成浓度为2%质量浓度)的溶液， 加热溶解,然后加人溴化乙锭溶液(6.2.23)至终浓度0.54g/ /mL,混匀,稍适冷却后,倒人电泳板上,插 上梳板,室温下凝固后,放人盛1×TAE缓冲液的电泳槽中,轻轻垂直向上拔去梳板 在每个泳道中加 人适量的PCR产物与上样缓冲液(6.2.22)的混合液(10Al一20ALPCR产物与上样缓冲液2L混 合),其中一个泳道中加人DNA分子质量标准品(6.2.26)5L,接通电源电泳,按2V/cm的电压电泳 至溴酚蓝迁移至3c cm一5cm处结束 凝胶成像仪观察并分析记录 6.4.5结果分析 6.4.51内源基因的检测 用针对猪内源基因设计的引物对样品DNA提取液进行PCR测试,以猪肉DNA为阳性对照,阳性 对照和待测样品均应被扩增出264p的CR产物 如未见有该PCR扩增产物,则说明DNA提取质 量有问题,或DNA提取液中有抑制PCR反应的因子存在,应重新提取DNA,直到扩增出该PCR产物 植物基因的检测 6.4.5.2 对样品DNA提取液进行植物特异基因的PCR测试,以植物DNA作为阳性对照,如果阴性对照和 空白对照未出现扩增条带,阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带(扩增片段大小为193bp). ,应进一步进行确证实验,依据确证实验的结果最终报 则可初步判定待测样品中含有可疑的植物成分 告;如果待测样品未出现PCR扩增产物,则可断定待测样品中不含有植物成分 6.4.6确证实验 当PCR检测结果为阳性时,可通过实时荧光PCR方法或其他方法(如测序比对,序列参见附录A 进行确证试验; 推荐实时荧光PCR探针序列5'-GCAATccTGAGcCAAATcC3’ 结果表述 7.1植物特异基因片段得到扩增,且扩增片段大小与预期片段大小一致,表明样品中检测出植物成分 结果表述为“样品中检测出植物成分,阴性对照、阳性对照及空白对照检测结果正常” 7.2猪内源基因片段得到扩增.且扩增片段大小与预期片段大小一致,而植物特异基因片段未得到扩 增,或扩增片段大小与预期片段大小不一致,表明样品中未检测出植物成分，结果表述为“样品中未检测 出植物成分,阴性对照、阳性对照及空白对照检测结果正常”
GB/T23815?2009 ?A ?? ? A.1??tRNAL.eu?(193bp CGAAATcGGTAGACGCTACGGACTTAATTGGATTGAGCcTTAGTATGGAA ACTTACTAAGTGATAACTTTCAAATTCAGAGAAACCCAGGAATTAAAAAT GGGCAATcCTGAGCCAAATcCTCTTCTcCTTTCCAAGAACAAACAGGGGT TCAGAAAGcGAAAAAGGGGGATAGGTGCAGAGACTcAATGGAA .2 mitoehondrion?(264bp) A. AAGTTAGAGATcGGGAGcCTAAATCTcCCCTCAATGGTATGcCACAACTA GATACATcCCACATGATTCATTACAATTACATCAATAATTATAACATTATT TATTTTATTCCAACTAAAAATCTCAAACTACTCATACCCAGCAAGcCcCAG AATCAATTGAACTCAAAACTCAAAAACATAGCAcccCTTGAGAAATAAAA TGAACGAAAATCTATTTGCCTCTTTTATTGCCCCCACGATAATAGGACTA CCTATTGTCACCTT