生化制品中还原糖的测定柱前衍生高效液相色谱法

生化制品中还原糖的测定柱前衍生高效液相色谱法

国家标准 GB/T40980一2021 生化制品中还原糖的测定 柱前衍生高效液相色谱法 Determinationofredueingsugarinbhioehemiealproduets- High-performaneeliquidehroatvgraphywithpre-eolumnderivatizationm 2021-11-26发布 2022-06-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花警理委员会国家标准
GB/T40980一2021 前 言 本文件按照GB/T1.1一2020<标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 本文件由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口 本文件起草单位;测试技术研究院生物研究所、深圳市分析测试协会、甘肃中商食品质量检验 检测有限公司、西华大学、电子科技大学、青岛科技大学、测试技术研究院 本文件主要起草人:刘明东、许洋、管驰、杨锐陈鹏、黄玉坤、蒋子敬、周鑫魁、马丽侠、程玉华、钱茬文、 吴微、杨杰、王力均,叶德萍、陈凯、张简、张永勤、洪霞、周李华
GB/T40980一2021 生化制品中还原糖的测定 柱前衍生高效液相色谱法 范围 本文件规定了采用柱前衍生高效液相色谱法测定生化制品中D甘露糖、D核糖、L-鼠李糖、D半乳 糖、L-阿拉伯醛糖、D木糖、L-岩藻糖、D葡萄糖、D麦芽糖、D乳糖10种还原糖的测定方法 本文件适用于含糖胃蛋白酶、静脉注射用人免疫球蛋白、狂犬病人免疫球蛋白、改良Y培养基、葡 萄糖肉汤培养基、缓冲动力-硝酸盐、木糖-明胶培养基等生化制品中的甘露糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、阿 拉伯糖、木糖、岩藻糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖含量测定 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 其中注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 原理 样品中的还原糖经沸水提取,提取液与1-苯基-3-甲基-5-毗哗啾酮(PMP)在碱性条件下反应,生成 糖衍生物,经液相色谱分离紫外检测器测定,色谱保留时间定性、外标法定量 5 试剂或材料 除特殊说明外,本方法所用试剂除流动相为色谱纯外均为分析纯,试验用水均为GB/T6682规定 的 -级水 5.1磷酸二氢钾(KHPO. 5.2氢氧化钠(NaOH). 5.3亚铁化钾[KFe(CN)3H,O] 5.4乙酸锌[Zn(CH,coO)2H.O] 5.51-苯基-3-甲基-5-毗哗啾酮(CHN.O,PMP 5.6盐酸(HCI 5.7三氯甲婉(CHCl) 5.8甲醇(CH,OH). 5.9乙睛(CHCN):色谱纯
GB/T40980一202 5.10三乙胺(C,HN 5.11正己婉(C,H,). 5.12亚铁氮化钾溶液(106g/L);称取106.0只亚铁氮化钾,用水溶解并稀释至1000 mL 5.13乙酸锌溶液(220g/L);称取220.0g乙酸锌,用水稀释至1000mL 5.140.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-毗哗咻酮(PMP)衍生溶液;称取87.1gPMP衍生化试剂,加甲醇溶 解并定容至1000 m 5.151.0mol/LNaOH溶液;称取40.0g氢氧化钠,加人水中溶解并稀释至1000 mlL0 5.161.0mol/儿HC浒液 取83.2mL浓盐酸，缓慢加人约800ml水中,冷却后加水定容 至1000mL 5.17糖标准品:D甘露糖(CAs:3458-28-4)、D核糖(CAS;50-69-1)、L-鼠李糖(CAs10030-85-0)、,D 半乳糖(CAs;59-23-4),L阿拉伯醛糖(CAS5328-37-0),D木糖(CAS;31178-70-8),L-岩藻糖(CAS 2438-80-4),D葡萄糖(CAs:50-99-7)、D麦芽糖CAS;3458-28-4)、D乳糖(CAS;63-42-3)，纯度 均>99% 5.18混合标准储备液;分别称取100mg标准物质(精确至0.1mg),用水溶解并定容至100mL,配制 成质量浓度约为10004g/mL的混合标准储备液,冷藏保存 5.19标准工作溶液的配制;分别取0.05mL.0.10ml0.20mL0.5ml、1ml2mL混合标准储备液 定容至10mL容量瓶，配制成5根/mL.I0/ml、320E/mL,50闪g/mL.I00g/'mL和2004g/ml 标准溶液浓度系列 5.20微孔过滤膜;孔径0.45Am 6 仪器设备 6.1高效液相色谱仪;配紫外检测器(UV)或二极管阵列检测器(DAD. 6.2分析天平:感量0.01mg和0.0001g 6.3超声波提取器;功率250W,工作频率40kHz 6.4离心机:最大转速15000r/min. 6.5酸度计;精度为0.01个pH单位,pH值测定范围为0~14 6.6数显恒温水浴锅:精确度到0.1C. 6.7涡旋混匀器 6.8电动粉碎机 分析步骤 7.1样品制备 取有代表性的样品至少50g固体样品液体样品混匀直接待用)用电动粉碎机粉碎(过孔径为 0.3mm 的筛),混匀后装人洁净的盛样容器内,作为试样,室温密封储存 7.2样品前处理 7.2.1固体样品前处理 称取样品5g(精确到0.001g)于50ml离心管中,加人20ml.水,在沸水浴中提取30min,超声提 取10min;样液冷却后,加人正己烧5ml,涡旋2min,于5000r/min离心5min,弃去正己婉层,将水 层清液倒人50mL容量瓶中;向固体残渣中加人10ml.水,涡旋2min,于5000r/min离心3min,水
GB/T40980一2021 层合并于上述50mL.容量瓶中,加人5ml亚铁化钾溶液,5ml乙酸锌溶液,用水定容,混匀,离心取 上清液,经0.45m滤膜过滤后待用 7.2.2含油脂及蛋白类液体样品前处理 称取样品5g(精确到0.001g)于50mL离心管中,加人20ml水,在沸水浴中提取15min,超声提 取10min,样液冷却后,加人3ml亚铁氰化钾溶液,3ml乙酸锌溶液,用水定容至40mL,充分振摇离 心管,于5000r/min离心5min;取部分澄清水层,加人正己5mL,振摇或涡旋2min,于5000r/min 离心5nmin 取水层清液,经0.454m滤膜过滤后待用 7.2.3不含油脂及蛋白类液体样品前处理 称取样品5g(精确到0.001g)于50mL离心管中,加水至40mL,在沸水浴中提取15min,超声提 取10nmin,样液羚却后,转移至50mL容量瓶中定容,取水层清液经0.45Am滤膜过滤后待用 7.3试样衍生 分别吸取试样和不同浓度的标准工作溶液0.4ml于15mL具塞试管中,加人1.0mol/LNaOH 溶液0.2ml,0.5mol/L PMP衍生溶液1.0mlL,在70C恒温水浴中反应60min;冷却至室温,加人 .0mol/L.HCl溶液0.2ml,摇匀后,氮气吹干;加人2ml蒸僧水复溶,再加人2mL三氯甲熔,充分涡 旋后静置或离心,弃去下层有机层,重复此操作三次,取上层水相过0.45Mm滤膜后进人液相色谱分析 7.4仪器色谱参考条件 仪器色谱参考条件如下: 色谱柱;C色谱柱,250mm×4.6mm,3.04m,或同等性能的色谱柱; aa 流动相:A相为含20mmol/IKH,PO(三乙胺调节pH值至7.8土0.1)水溶液,B相为乙睛 b 梯度条件见表1; 流量:l.0mL/mins c d) 柱温:35C; 检测器波长;2501 nm; ee fD 进样量:10AL 表1 梯度洗脱参考条件 时间/min 流量/mL/min) 流动相A/% 流动相B/% 1.0 84 16 35 1.0 78 22 20 8o 1.0 40 2o 8o 1,0 50 1.0 84 16 7.5标准曲线的制作 以标准工作溶液中目标还原糖的浓度为横坐标,以响应值为纵坐标,绘制标准工作曲线 0种还原糖标准品色谱图见附录A中图A.1 7.6样品的测定 将待测样品液上机测定,记录色谱图,根据保留时间定性,记录峰面积,根据标准曲线计算待测样品
GB/T40980一2021 液中糖的浓度 8 分析结果计算与表示 试样中还原糖含量按照式(1)计算 _exvxKxIxI"n X nn 式中 X -样品中还原糖的含量,单位为克每一百克g/100g); -从标准工作曲线上得到的被测组分溶液质量浓度,单位为微克每毫升(4g/mL); -样品溶液定容体积,单位为毫升(mL) K -样品稀释倍数; n 所称试样的质量,单位为克(g) 计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示,结果保留三位有效数字 9 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%. 10其他 本方法测定10种糖标准品的参考检出限和定量限见表2 表210种糖标准品检出限和定量限 序号 化合物 检出限/(4g/mL 定量限/(4g/ml 0.234 0.702 甘露糖 0.723 核糖 0.24n 0.237 0.711 鼠李桃 乳糖 0.451 1.353 麦芽糖 0.454 1.362 葡葡棚 0.214 0.642 半乳糖 0.323 0.969 0.21o 0.630 木糖 9 0.193 0.579 阿拉伯糖 0.954 10 岩藻桃 0.318
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生化制品中还原糖的测定柱前衍生高效液相色谱法GB/T40980-2021

引言：

还原糖是一类重要的生化分子，常见于多种生物体中，具有重要的生理和代谢作用。因此，对还原糖的测定在生物学、医学、食品科学等领域有着广泛的应用。目前，已经开发出了多种测定还原糖的方法，但是在生化制品中测定还原糖的方法比较少，并且存在一定的局限性。

GB/T40980-2021是一项新近发布的标准，提出了针对生化制品中还原糖的测定方法。该方法利用柱前衍生技术和高效液相色谱法实现了对还原糖的快速准确检测。下面将详细介绍该方法的操作流程和优点。

操作流程：

1. 样品处理

将待测样品加入离心管中，加入等体积的甲醇，振荡混匀后离心10min，取上清液过滤，即可得到待测样品。

2. 衍生化反应

将待测样品取出一定量，加入1%甲氧基三甲基硅烷（TMS）溶液并充分混匀，静置30min使其进行羟甲基化反应。然后加入0.1mol/L盐酸，混匀后再加入1%对氨基苯甲酸酯（PAP）溶液，充分混匀，并静置30min，使其进行酯化反应。反应结束后，加入5%碳酸氢钠溶液中和反应液，用乙酸乙腈溶解后即可得到衍生化样品。

3. 色谱条件

柱：Inertsil ODS-3（4.6mm×150mm，5μm）

移液器：SIL-30AC

检测器：UV

流速：1.0 mL/min

柱温：30℃

波长：254nm

4. 数据处理

将样品注入液相色谱仪，在标准曲线的条件下进行检测。将检测到的峰面积代入标准曲线计算还原糖的含量。

优点：

该方法采用了柱前衍生技术和高效液相色谱法，具有灵敏度高、分离度好、重现性好等优点，能够有效地应用于生化制品中还原糖的测定。同时，该方法操作简单、时间短、成本低、易于操作和推广，适用性强，能够满足生产、科研等领域的需要。

结论：

本文介绍了基于GB/T40980-2021标准的生化制品中还原糖的测定方法。该方法采用了柱前衍生技术和高效液相色谱法，具有灵敏度高、分离度好、重现性好等特点，且操作简单、时间短、成本低、易于操作和推广，适用性强。因此，该方法可应用于生产、科研等领域中对还原糖含量的快速准确检测。

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