胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法

胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法

国家标准 GB/T186532002 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法 Methodsforisolationamdidemtirieationofcampylobaecorfetus 2002-02-19发布 2002-05-01实施 中华 民共，和国 发布 国家质量监昏检验检疫总篇国家标准
GB/T18653-2002 前 言 本标准是依据加拿大国家动物疾病研究所的实验室操作规程,结合本国实际情况制定的,通过大量 试验,证实该方法准确可靠 本标准的附录A是标准的附录,附录B是提示的附录 本标准由农业部提出 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口 本标准起草单位;天津动植物检疫局 本标准主要起草人;秦贞奎、侯艳梅、张碧波
国家标准 GB/T186532002 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法 Methodsforisolationandidentifieationofcammpylobactorfetus 范围 本标准规定了胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法 本标准适用于牛、绵羊、冷冻精液胎儿弯曲杆菌的检验,其他动物可参照使用 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定 2.1设备和材料 2.1.1混合气体[质量比为..5%氧(O)),10%二氧化碳(cO),),86.5%氮(N.)] 2.1.2厌氧培养罐 2? 1.3采样棒及吸球 2 1.42mL注射器,5号针头,20号针头 2？ 1.5灭菌青霉素瓶及生理盐水 22 1.6供常规细菌分离鉴定用的基本设备与材料 2-2培养基和试剂[见附录A(标准的附录] 2.21增菌运输培养基(TEM. 22.2半胱复酸牛心浸膏培养基(CH) 22.3琼脂培养基(M1H) 2.2.4筑基乙酸盐肉汤 22.5相关生化试剂 23胎儿弯曲杆菌的分离鉴定程序见附录B(提示的附录)示意图 2.4分离培养 241样品采集 2.41.1母牛站立或六柱栏保定,用5%来苏儿消毒牛的外阴部.将采样棒的采样端插人阴道,压扁另 -端的吸球,并来回抽动,吸取阴道粘液 取出采样棒后,插人盛有3ml灭菌生理盐水的小瓶中吹吸数 次,再将采样棒放人消毒液中 241.2公牛六柱栏保定,用绳子固定采样侧的后肢,剪短阴简外部的阴毛,用5%的来苏儿消毒公牛 的尿道口,将采样棒的采样蹦插人阴筒内,将另一端的吸球压扁并来回抽动,吸取包皮液 取出采样棒迅 速插人盛有3mL灭菌生理盐水的小瓶中吹吸数次 nmin,用灭菌注射器吸取上清液2mL,分别注人两瓶增菌运输培养基 2.4.1.3样品液静置1min~ 一2 见附录A中A1)中,每瓶1ml 振荡混匀,尽快送至实验室 2.4.1.4取样品做革兰氏染色并做湿涂片镜检 也可用棉拭子蘸取样品液直接涂布于含抗菌素的MH 见附录A中A3)或CH(见附录A中A2)琼脂平板上 已接种样品的增菌运输培养基置37C培养72h 用直径3m的接种环将增菌液分别划线于 2.4.2 两个MH或CH平板培养基上,将平板放置厌氧培养罐中,将罐内空气抽出,达到一5.5kPa时停止,充 2002-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局2002-02-19批准
GB/T186532002 人经0.22m滤膜过滤的混合气体至负压为零,再将气体抽出和充人反复两次 将培养罐在37C培养 72h 以后胎儿弯曲杆菌均需在混合气体条件下培养 2.43观察MH.CH培养基上有无疑为胎儿弯曲杆菌的菌落,如无可弃之 如有.将典型或可疑菌落 划线于MH或cH脉脂平板培养基上培养72h 胎儿弯曲杆菌在MH或CH平板培养基上的菌落特征为;不溶血、半透明光滑、周边整齐、,圆整、直 径为1m左右 2.5竖定 25.1筛选试验 2.5.1.1取典型或可疑纯培养物做革兰氏染色、湿涂片动力观察、氧化酶试验及过氧化氢酶试验(试剂 配方见附录A中A5,A6) 胎儿弯曲杆菌为革兰氏染色阴性,呈螺旋状或“s”状,一些老龄培养物可出现球状或球杆状,不形 成芽胞和荚膜,在菌体的一端或两端有鞭毛,呈特征快速螺旋状穿梭运动 氧化酶试验为阳性 2.5.1.2纯培养平板用后尽快放回混合气体环境中,以备进一步做生化试验用 2.5.2生化试验 2.5.2.1将符合2.5.1.1条的培养物按表1进行生化试验 表1胎儿弯曲杆菌生化反应 生长试验 药敏试验 碗化叙 马尿酸 过氧化氧 氧化酶 菌名 HS 1%甘1%胆3.5%氧 綦刚阴头袍霉素钠水解 酶试验 试验 25 42c 试验 化钠(Nacl酸304g:/片30g/片试验 氨酸 汁 胎儿弯曲杆 菌胎儿亚种 胎儿弯曲杆 性病亚种 注;“十 阳性反应; 阴性反应; “士” 反应不定; “R” 诘抗 “s” 敏感 2.5.2.2所有生化试验管均于混合气体环境中培养3d 带胶盖或螺旋盖的试管,培养时应将试管盖 放松 25.23生长试验;纯培养后的菌接种到2管颈基乙酸肉汤(见附录A中A4)中,分别放43C和25c 温箱培养72h观察结果,肉汤上层出现雾状混浊时,说明细菌已生长 25.24硫化氢(HS)试验;纯培养后的可疑菌种接种于疏基乙酸肉汤中,试管口悬吊一条长×宽为 20mm×6mm的乙酸铅滤纸,观察3d4d,如见滤纸变黑即为产生HS之证 2.5.2.5甘氨酸、氯化钠、胆汁生长试验;可疑菌种分别接种于含1%甘氨酸,3.5%氯化钠、1%胆汁生 长的疏基乙酸肉汤中,37C培养72h,培养基近表面有云雾状生长为阳性 2.5.2.6药物敏感试验;用铂金耳挑取可疑菌落放于1ml灭菌生理盐水试管中,菌液浓度约为3× 个/mlL.,用灭菌】棚拭子蘸取细菌稀释液涂于MH琼脂平板上,然后用锻子把含有30禁唁围酸 10° 和头抱霉素的滤纸片贴在MH血平板上,在混合气体中37C培养24h一72h,量溶菌区,>18mm为 敏感,<14mm为不敏感
GB/T186532002 252.7马尿酸钠水解试验;取48h一72h培养物接种于0.4mL1%马尿酸钠液(见附录A中A7.l) 中制成浓厚菌悬液35C一37C水浴2h,再加人0.2ml菲三酮试剂见附录A中A7.2),混匀后水浴 20min观察结果,变深紫色为阳性,渎紫色或不变色为阴性 可用18h一24h变形杆菌培养物作阳性 对照 2.5.3结果判定 根据2.5.】和2.5.2的结果进行 2.5.3.1凡符合胎儿弯曲杆菌一般特征和生化特性的菌,均判定为胎儿弯曲杆菌 25.3.2过氧化氢酶试验,HS试验、1%胆汁生长试验、3.5%氯化销生长试验和马尿酸水解试验,其 中任何一项不符合胎儿弯曲杆菌特性,均判定为非胎儿弯曲杆菌 2.6报告结果的表示 2.6.1阳性结果;“发现胎儿弯曲杆菌”、“发现胎儿弯曲杆菌胎儿亚种”或“发现胎儿弯曲杆菌性病 亚种” 2.6.2阴性结果;“未发现胎儿弯曲杆菌”
GB/T186532002 A 附 录 标准的附录) 培养基和试剂 增菌运输培养基(transportenrichmentmedium,TEM A1 成牛血清 1000ml 5-氟尿喀吭 0.3g 放线菌削 g 0. 紫酮酸 3mg 多粘菌索B 100000IU 1%煌绿 5ml 将各种成分无菌操作加人到成牛血清中,充分混合后分装于20ml带胶皮塞(能密闭)的玻璃瓶 中,每瓶8ml,然后水浴或在蒸气中加热2min3nmin(无压力),使血清凝固,冷却后用灭菌玻璃棒将 血清凝块捣碎 最后无菌操作充人混合气体[3.5%氧气(O.).10%二氧化碳(CO.).86.5%氮气(N.] 将制备好的TEM培养基保存在4C冰箱中,可使用4个月 A2CH培养基(eysteineheartbloodagar)(含抗菌素 500g 牛心浸液(或牛心粉30g) 胰蛋白陈 ox 右旋糖 0g 氯化钠 5 L-半胱氨酸 1g 琼脂 12g 1000ml 蒸僧水 pH6.97.0 加热溶解各成分后107.9kPa高压15min,培养基冷却至50C55C时,无菌加人 多粘菌索B 2mg 2 新生霉素 mg 20 放线菌削 mg 100m 绵羊血 混匀,倾注平板 放4C水箱备用 A3MH培养基(muellerhintoaga ar含抗菌素 5 牛肉浸膏 g 17.5 酪蛋白水解物 g 1.5 淀粉 g 15 琼脂 g 蒸溜水 1000ml pH7.4士0.2 各成分加热溶解,107.9kPa高压15min,冷却至50C55C时.无菌加人: 杆菌肽 25000lU
GB/T186532002 0mg 放线菌削 1万IU 多粘菌素B 新生霉素 5mg 绵羊血 50ml100ml 混匀,倾注平板 4C冰箱保存 A4硫基乙酸盐肉汤 L-胱氨酸 0.5mg 氯化钠 2.5mg 右旋糖 5.5g 酵母浸膏 5.0g 酪蛋白胰消化物(PancreaticDigestofCasein) 15.0g 疏基乙酸钠 0.5g 燕僧水 1000ml 加热至溶解,调整pH7.2士0.2,5ml试管分装,107.9kPa高压灭菌15min 新制备的培养基(A1A4)均应做无菌检查,并用已知阳性菌和阴性菌进行测试,以保证培养基的 质量 A5氧化酶试剂 1%盐酸二甲苯对苯二胺水溶液,置棕色瓶中现用现配,一10C保存,有效期一周 用于氧化酶试验 A63%过氧化氢(H,o) 30%H.O. 0m 燕僧水 90ml 装于棕色瓶中,有效期为一周 用于触酶试验 马尿酸盐水解试验 A7 A7.11%马尿酸钠 马尿酸钠 1g 燕僧水 00mL A7.2水合苗三酬 苗三酬 3.5g 50m 丙削 50m 丁削
GB/T186532002 B 录 附 (提示的附录) 胎儿弯曲杆菌分离鉴定程序示意图 含抗尚素 MH 革兰氏染色或 或CH培养基 湿涂片镜检 TEM 增菌运输培养基 7c，72h淞合气体环境》 不含抗监素MHH 或CH培养基 72h混合气体环境> 37C 挑选可疑岗落 37c72h淋合气体环境 革兰氏染色、动力、氧化房、过氧化氢酶试验 十 报告阴性结果 生长试 药物敏感试验 3.5% 1% 1% 荟 唉 胆 25c 42 围 股 一项不符 完全符合 报告阳性结果 报告阴性结果 图B