牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法

牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法

国家标准 GB/27642一2011 牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法 BovineindividualandparentalidentifieationsingmiersateliteDNA 2011-12-30发布 2012-04-01实施 国家质量监督检监检疫总局 发布 国家标准花管理委员会国家标准
GB/T27642一2011 目 次 前言 范围 规范性引用文件 术语、定义和缩略语 原理 防污染措施 个体鉴定和亲子鉴定试验步骤 附录A(资料性附录)试剂配制及仪器 附录B(资料性附录)DNA样品的制备 附录c资料性附录)光谱校正和PCR反应、测定及分析 附录D(资料性附录)FA0-IsAG推荐的牛微卫星DNA标记 附录E(资料性附录)个体及亲子鉴定计算方法
GB/T27642一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009的规则进行起草 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口 本标淮起草单位;全国畜牧总站 本标准主要起草人:刘丑生、王志刚、孙飞舟、邱小田、韩旭、于福清、张桂香
GB/T27642一2011 牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法 范围 本标准规定了利用微卫星DNA标记进行牛个体及亲子鉴定的技术规程 本标准适用于普通牛(Boslaurus)个体和亲子鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GA/T383法庭科学DNA实验室检验规范 SN/T1193基因检验实验室技术要求 术语、定义和缩略语 下列术语、定义和缩略语适用于本文件 聚合酶链式反应polymerasechainreaction，CR 以一对寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸(d小NTPs)为原料,在合适的温度、离子条件和耐热 DNA聚合酶催化下,在体外人工合成特异的DNA片段的过程 33 2 microsatelliteDNA 微卫星DNA 亦称短串联重复序列或简单重复序列short tandemrepeats，STRs;simplesequencerepeats， ssRs).以1bp一6bp的短核昔酸序列为基本单位,呈串联重复状散在分布于生物体基因组中 非父排除概率probabilttyofpaternityexelusion,p 通过检测某一个遗传标记,能将不是生父的争议父亲排除的概率 3.4 1,CPE 累积非父排除概率eumulativeprobabilityofpatermityexelusion 通过检测某一遗传标记系统的多个遗传标记,将不是生父的个体否定掉的累计概率 3.5 亲权指数patermityindex,PI 争议父亲提供生父等位基因成为子代生父的概率与随机公畜提供生父基因成为子代生父概率的 比值 3.6 累积亲权指数cummulativepaternityindex.CP 根据某一遗传标记系统中的多个标记,计算多个亲权指数的累积 父子关系相对概率relativechanee ofpatemity,RCP 争议父亲是亲生父亲的相对概率
GB/r27642一2011 原理 4.1个体鉴定原理 某一被检样品与真样品微卫星标记的基因型不同,则判定被检样品与真样品来自不同个体,如果相 同不排除它们来自同一个体,通过对某一遗传标记系统的多个标记所检测,可在一定概率水平上判定被 测样品与真样品是否来自同一 一个体 亲子鉴定原理 根据孟德尔遗传分离定律,在配子细胞形成时,成对的等位基因彼此分离,随机进人配子细胞 双 亲的配子细胞结合形成合子,其发育出来的子代的成对等位基因分别来自父亲和母亲 根据多个标记 计算的鉴定结果在一定概率水平上可以判定争议父亲(母亲)是否为亲生父亲(母亲)(变异情况除外) 防污染措施 按sN/T1193和GA/T383规定的方法执行 个体鉴定和亲子鉴定试验步骤 6.1样品制备 收集血液、组织(耳,肌肉、尾、皮肤等,毛囊或精液等材料 6.2样品DNA的制备 各样品试剂配方、所需的仪器设备参见附录A,具体步骤参见附录B 6.3光谱校正 在实验前进行一次四色荧光素的光谱校正,目的为了校准信号重叠 具体步骤参见C.1 6.4微卫星DNA标记 参见附录D. 6.5PCR反应 6.5.1CR反应体系 参见表C.1 2 6.5. PCR反应程序 参见表C.2 6.5.3PCR产物电泳检测 取适量PCR产物,上样于1%一3%的琼脂糖凝胶中进行电泳,检测本次扩增反应是否成功
GB/T27642一2011 6.6测定及分析 通过分析得到微卫星标记的基因型频率 参见C.3 利用微卫星DNA法进行个体鉴定的概率计算和结果表述 被检样品的基因型与真样品不同,可排除两份样品来源于同一个体变异情况除外) 如果两份样 品的基因型相同时,则按式(I)计算偶合概率,当其值小于该个体所在群体数量的倒数时(5X10 9),认 定两份样品来源于同一个体 偶合概率是一组微卫星标记基因型频率的乘积 ×P PM=P×P×P× -.-- 式中 P偶合概率; 第;个微卫星标记的基因型频率 利用微卫星DNA法进行亲子鉴定认定和排除依据 累积非父排除率>99.73%,父子关系相对概率>99.95%或累积亲权指数>2000,判定争议父亲 为生父;累积非父排除率低于99.73%并且有3个以上标记不符合孟德尔遗传分离规律时,排除亲缘关 系;如果累积非父排除率低于99.73%并且有3个以下的作为不符合孟德尔遗传分离规律时,应适当增 加检测的标记数量 具体计算公式参见附录E
GB/r27642一2011 附录A 资料性附录 试剂配制及仪器 A.1试剂配制 A.1.1血液裂解液见表A.1 表A.1血液裂解液 体积 贮存液浓度 使用浓度 ml 1mol/LTris -HCH8. 10mmol/ 00mmol/ 0.5mol/儿.EDTA(pH8.0) 20 10%SDS 20 100 灭菌双蒸水加至 A.1.2组织DNA及毛囊提取液见表A.2. 表A.2组织NA提取液 体积 贮存液浓度 使用浓度 ml 1mol/L.Tris-HCl(pH8.0 50mmol/1 0.5mol/L EDTA(pH8.0 20 100mol/L 0,5mol/1NaCI 20 100mmol/L sDs 20 2% 0% 灭菌双燕水加至 100 A.1.3精子裂解液见表A.3 表A.3精子裂解液 体积 贮存液浓度 使用浓度 ml nol/儿.Tris-Hc(pH8. 1mol 0 10mmol/ 0.5mol/LEDTA(pH8.0) 10mmol/儿 0.5mol/1NaCI 20 00mmol/1 10%DS 20 2% 1mol/L.DTT(现用现加 0.0039 39Amol/1 灭菌双猴水加至 100
GB/T27642一2011 A.1.4精子洗涤液 取1nmol/L的NaC37.5mL,0.5mol/L的EDTA5nmlL,加双燕水至250ml 高压灭菌备用 A.1.5蛋白酶K贮存液(20mg/m) 200mg蛋白脖K解于10mL灭菌双燕水中,分装,每管1ml -20冻存 A.1.6TE缓冲液(pH8.0) 10mmol/1Tris-HClpH8.0),lmmol/1EDTA(pH8.0) A.1.7电泳缓冲液 1×Tris-乙酸(TAE):0.04mol/LTris-乙酸,0.01mol/LEDTA 0.5×Tris-碉酸(TBE):0.045mol/儿Tris-砌酸,0.01mol/儿EDTA A.1.8澳化乙锭溶液(EB,10mg/mL 用少量双燕水溶解lg澳化乙锭,磁力搅拌数小时以确保其完全溶解,定容至100ml,然后转移到 棕色瓶或铝箔包裹容器中,室温保存 A.1.96×上样缓冲液 0.05%溴酚蓝,0.12%二甲苯青FF,40%质量浓度)蔗糖水溶液; 或0.05%澳盼蓝,0.12%二甲苯青FF,30%体积分数)甘油水溶液 A.1.101mol/I二硫苏糖醇(DTT) 用20ml0,01mol/L乙酸钠溶液(pH5.2)溶解3,09gDTT,过滤除菌后分装成1ml贮存于 20C 注意;DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理 A.1.111mol/LTris(pH8.0) 将121.lgTis游于8o0mL水中,加浓盐酸调pH值至8.0,定容至10o0mL后高压灭菌 12 0.5mol/L EDTA(pH8.0) A 1 l段NaEDTA2H.o,加人800mL水中,再加人N.oH(约20e)调pH值至8.0,定容后 将186.！ 高压灭菌 A.1.1310%SDs(500ml 将50gSDs加人400mL水中.60C加热溶解,定容后过滤灭菌 A.1.14Tris饱和酚 A.1.15酚;三氯甲婉:异戊醇(25:24:1)混合液 A.1.16三氯甲烧;异戊醉(24:1)混合液 A.2仪器 A.2.1遗传分析仪 A.2.2PCR仪 A.2.3低温高速离心机 A.2.4生物分光光度计 A.2.5稳压稳流电泳仪. A.2.6八道电子可调移液器(量程5Al一100AL A.2.7八道电子可调移液器(量程0.2aL10aL) 2.8单道可调移液器(2AL.,10AL,200L,1000AL. 电子天平(量程0.01mg一300mg) A.2. 10 水浴恒温震荡器 普通离心机 A.2.11 A.2.12紫外光检测仪 A.2.13超声波清洗器 A.2.14超纯水器 A.2.15高压灭菌器
GB/r27642一2011 s 附 录 资料性附录 DNA样品的制备 B.1样品预处理 B.1.1从血液中提取基因组DNA B.1.1.1取适量血液加人等体积血样裂解液,加人RNA酶至终浓度为204g/mL,充分混匀于37C 水浴消化1h2h B.1.1.2加人蛋白酶K贮存液至终浓度为1004g/mL,充分混匀,55C水浴消化12h以上至不见粘 稠的团块 B.1.2从组织中提取基因组DNA B.1.2.1取0.3g的组织置于1.5mL离心管中,将其破碎 B.1.2.2晾干后加人500L组织DNA提取液,然后加人RNA酶至终浓度为204g/ml,充分混匀 37C水浴消化1h 加蛋白酶K贮存液至终浓度为150E/ml一2004g/mlL,充分混匀55C水浴消化12h以上 B.1.2.3 至不见有组织块 从毛囊中提取基因组DNA B.1.3 B.1.3.1用灭菌双蒸水洗涤毛囊,剪碎,置于小离心管中 B.1.3.2晾干后加人30Al50l组织DNA提取液,然后加人蛋白酶K至终浓度为2004g/ml,充 分混匀,55C水浴消化12h以上至毛囊完全溶解 B.1.4从精液中提取基因组DA B.1.4.1每一个体取冻精三粒或鲜精0.4mL,置于1.5mL离心管中 B.1.4.2加等量精子洗涤液,4500r/min离心6min,弃上清液 B.1.4.3重复洗涤精子沉淀两次,去掉其中的卵黄甘油等物质 B.1.4.4用0.4mL精子裂解液重悬沉淀 B.1.4.5加人蛋白酶K贮存液至终浓度为1004g/mL.充分混匀.55C水浴消化过夜至少12h B.2样品抽提 B.2.1加人等体积Tris饱和酚,反复颠倒离心管,使两相溶液充分混合形成乳浊液,4C4500r/minm 离心15min;小心吸取上清液转移至另一洁净的离心管中;重复该操作一次 B.2.2加人等体积的酚;三氯甲婉:异戊醇(25:241)混合液,缓慢颠倒离心管,使两相溶液充分 混合,4C4500r/min离心15min B.2.3加人等体积三叙甲婉:异戊醉(24:1)混合液,缓慢颠倒离心管,使两相溶液充分混合,4C 45w/ma离心15m;收类上消至另一离心管中 B.2.4将上清液吸至较大容量的试管中,加人1/10体积3mol/LNaAc溶液(pH5.2)和2.5倍体积的
GB/T27642一2011 预冷无水乙醇,轻轻摇动试管至出现白色絮状DNA沉淀 B.2.5将DNA沉淀转移到1.5mlL离心管中,用75%乙醇洗涤两次 B.2.6将DNA干燥后加人适量TE缓冲液或灭菌双蒸水室温溶解24h B.3样品基因组DNA浓度检测 吸出适量提取的DNA,稀释50倍,用生物分光光度仪检测DNA的浓度,根据测定结果再将DNA 溶液稀释至预定值 较纯DNA样品的A/A比值为1.8左有;若该比值大大低于1.8,说明样品中 含有较多的蛋白质,应进一步纯化 H=AXN×50 ---+-+ B.1 式中 -DNA浓度,单位为微克每毫升(4g/mL) H 稀释倍数 N 对于双链DNA来说,loD=504g/mL B.4样品基因组DNA纯度和质量检测 吸出适量提取的DNA,在琼脂糖凝胶中进行电泳,然后在紫外透视仪下检测DNA质量,如果 DNA条带比较整齐、亮度较高,DNA样品的A/A比值为1.8左右,则说明提取的DNA样品可以 用于牛个体及亲子鉴定
GB/r27642一2011 c 附 录 资料性附录 光谱校正和CR反应、测定及分析 C.1光谱校正的具体步骤 C.1.1将标准品中的4支离心管充分混合离心 C.1.2从4管中各取混合好的标准标记品(内含5FAM,JoOE,NED,ROX)1.25AL,再加195L的高 纯度甲酰胺转移至另一1.5mL的离心管中 C.1.3充分混匀离心 C.1.495C变性5min,4C保存10min C.1.5取10L变性产物加到96孔上样板上,把96孔上样板放到遗传分析仪中 C.1.6毛细管电泳参考条件 毛细管:长度36cm,内壁无涂层; 推荐炉温:60C C.1.7如果校正结果能够达到仪器所要求的参数范围,则预实验通过 标准品测试结果要求Q值> 0.95,C值在48.5之间 C.2CR反应体系及反应程序 表C.1PCR反应体系 单倍反应体系 组 Al P(cRBuffer 0.5 dNTPs(10mmol/L 1.2 AmpliTaqGoldDNA聚合(2.5U/uL) 0.1 11对引物的混合物 1.7 去离子水 0.5 样品基因组DNA 1.0 总体积 5.0 表c.2PCR反应程序 35个40个循环 预变性 最后延伸 加尾 保存 变性 退火 延伸 94c 55~63" 72 72" 25 95C 15minm 45 60s 60min 2h
GB/T27642一2011 C.3测定及分析 C.3.1测定 将PCR产物稀释15倍,从中取1L与11.5L甲酰胺和0.25L分子量内标混合,95C变性 2min5min,立即放4C10min C.3.2分析 以样品峰长度值和分子量内标的峰长度值比较定量 得到各标记的等位基因片段大小计算基因 型频率
GB/r27642一2011 附 录D 资料性附录 FA0-IsAG推荐的牛微卫星DNA标记 表D.1FA0-IsAG推荐的牛微卫星NA标记 等位基因 标记 退火温度 序号 染色体 引物序列(上下游序列均为5'-3' 范围 名称 bp INRA063 ATTTGCACAAGCTAAATCTAACC 18 55一58 167一189 (D18S5 AAAcCACAGAAATGcTTGGAAG INRA005 CAATCTGCATGAAGTATAAATAT 12 55 135149 D12s!) CTTcAGGcATAccCcTACAcc ETH225 GATCACCTTGCCACTATTTCCT 55一65 131159 D9s1 AcATGAcAGcCAGcTGcTAcT IlSTS005 GGAAGCAATGAAATCTATAGCC 10 54一58 176194 D10S25) TGTTcTGTGAGTTTGTAAGC HEL5 GCAGGATCACTTGTTAGGGA 21 52~57 145171 D21S15 AGAcGTTAGT(GTAcCATTAA HELl CAACAGCTATTTAACAAGGA 15 54一57 99~l19 D15s10) AGGcTAcAGTccATGGGATT INRA035 ATCCTTTGCAGCCTCCACATTG 16 55一60 100124 D16s11 TTGTGcTTTATGAcAcTATccG ETH152 TACTCGTAGGGCAGGCTGCCTG 55一60 181一211 D5S1 GAGAccTCAGGGTTGGTGATCcAG INRA023 GAGTAGAGCTACAAGATAAACTT 55 195一225 (D3S1o) TAAcTAcAGGGTG;TTAGATGAAcTc ETH10 GTTCAGGACTGGCCCTGCTAACA 10 55一65 207一231 5S3) CcTcCAGccCACTTrCTcTCT HEL9 CCCATTCAGTCTTCAGAGGT l 52~57 141173 D8S4 CACATcCAT(GTTCTcCACCAc CsSM66 ACACAAATCCTTTCTGCCAGCTGA 12 14 55一65 171一209 D14S31 AATTTAATGCACTGAGGAGCTTGG NRA032 AAACTGTATTCTCTAATAGCTAC 13 1 55~58l60一204 (D11S9 GCAAGACATATCTcCATTCcTTT ETH3 GAACCTGCCTCTCCTGCATTGG 14 19 55一65 103133 (D19s2 AcTCTGccTGTGGcCAAGTAGG BM2113 GCTGCCTTCTACCAAATACCC 15 55一60 122~156 D2S26) CTTccTGAGAGAAGCAAcAcc BM1824 GAGCAAGGTGTTTTTCCAATC 16 55一60 176~197 (D1s34) CATTcTccAAcTGcTTccTTG 10
GB/T27642一2011 表D.1(续) 等位基因 标记 退火温度 序号 引物序列(上下游序列均为5'-3') 染色体 范围 名称 bp HEL13 TAAGGACTTGAGATAAGGAG 17 178一200 52~57 1l1 D11S15) CCATCTACCTCCATCTTAAC INRA037 GATCCTGCTTATATTTAACCAC 112~148 57~58 18 10 D10S12) AAAATTCCATGGAGAGAGAAA BM1818 AGCTGGGAATATAACCAAAGG 566o 248一278 19 23 I23S21) AGTGCTTTCAAGGTCCATGC II.STS006 TGTCTGTATTTCTGCTGTGG 55 277309 20 (7S8) ACACGGAAGCGATCTAAACG CAAGACAGGTGTTTCAATCT MM12 50~55 101~145 D9S20 ATcGACTCTGGGGATGATGT CSRM60 AAGATGTGATcCCAAGAGAGAGGCA 22 55~65 79~115 10 D10S5 AGGACCAGATCGTGAAAGGCATAG ETH185 TGCATGGACAGAGCAGCCTGGC 17 58~67 214一246 23 D17S1 GCACCCCAACGAAAGCTcCCAG HAUT24 CTCTCTGCCTTTGTCCCTGT 2 04~158 52~55 24 I22S26) AATACACTTTAGGAGAAAAATA HAUT27 TTTTATGT'TCAT'T'TTTTGACTGG 53 120~158 25 26 I26S21) AACTGCTGAAATCTCCATCTTA TGLA227 CGAATTCCAAATCTG￥TTAAT'TTGCT 55~56 75105 26 18 D18S1 ACAGACAGAAACTCAATGAAAGCA TGLA126 CTAATTTAGAATGAGAGAGGCTTCT 5558 115131 27 20 D20S1 TTGGTCTCTATTCTCTGAATATTcCC TGLA122 CCCTCCTCCAGGTAAATCAGC 221 5558 136184 28 D21S6 ATGGCAAATAAGTACATAC TGLA53 GCT'T'TCAGAAATAGTTTGCATTCA 55 143~191 29 16 D16S3 ATCTTCACATGATATTACAGCAGA SPSl15 AAAGTGACACAACAGCTTCTCCAG 15 55一60 234258 30 (D15) AGTGTCCTAGTTTGGCTGTG TTCCTCTGAGTCTCTGACAC MCM158 56一6o 112148 31 CCGAGATTGAAATGTAAATGAG ATTGACACTTCAGTAAGTTA MAF45 55~58 122~142 32 CAGACACAACTGAGCAACTAGC GATCCATCCACATTGCTCCA UMNo108 58一67 33 158209 CCAAGCGTCCATCAATTTAC ACCAGCTGATACACAAGTGC UMN0929 174196 34 5558 GGTCAGAGAATGAAACAGAG 11
GB/r27642一2011 附 录 E 资料性附录 个体及亲子鉴定计算方法 E.1个体,母亲和假定父亲的基因型均已知的情况 E.1.1根据单个微卫星DNA标记计算的非父排除概率公式见式(E.1): PE，=1 -(习i)十 1-剧+>"中心 一3 一 E.1 式中 PE 第人个微卫星DNA标记的非父排除概率; -第人个微卫星DNA标记第个等位基因的频率 p 标记数 E.1.2根据k个微卫星DNA标记计算的累积非父排除概率的公式见式(E.2) CPE=1一1一PE)(1一PE)(1一PE)(1一PE E.2 式中: CPE 累积非父排除概率; PE -第人个微卫星DNA标记的非父排除概率 E.2个体和一亲本的基因型已知,而另一亲本基因型未知的情况 E.3 -心十(>-心 PE=1一 3p E.4 CPE=1一1一PE)(1一PE)(1一PE,)(1一PE,) PE、户和CPE同E.1. E.3两个亲本的基因型均未知的情况 PE，=1十4 一8( (心)+(心)(之)+"(之) E.5 PE. E.6 CPE=1-1一PE)(1一PE)(l一PE)(1 PE、户和CPE同E.1 E.4亲权指数(P)和累计亲权指数(CPI PI=P/P E.8 CP1=PI×PI×PI 式中 P1I 亲权指数; 12
GB/T27642一2011 争议父亲提供生父基因的概率; P P -该基因在群体中的随机频率; CPI 累计亲权指数; P1 -第k个标记的亲权指数 E.5父子关系相对机会 RCP=CPI/(CPI十1×100% E.9 式中: RCP 父子关系相对概率; 累计亲权指数 CPI

牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法GB/T27642-2011

GB/T27642-2011是国家标准委员会发布的《农业生物技术 牛个体及亲子鉴定微卫星DNA分析方法》标准，是对牛个体及亲子鉴定微卫星DNA分析方法的规范和要求。

所谓牛个体及亲子鉴定，就是通过对牛的微卫星DNA进行分析，确定它们之间的亲缘关系，以及个体的基因型。这项技术可以被广泛应用于畜牧业，例如饲料改良、繁殖计划和品种改良等领域。

GB/T27642-2011标准中规定了微卫星DNA分析的实验步骤和技术参数。主要包括样品准备、DNA提取、PCR扩增、基因型鉴定和数据分析等环节。

牛个体及亲子鉴定需要进行多重PCR扩增，以保证数据的可靠性和准确性。同时还要注意样品标识、质量控制、反应条件等细节问题。

除了GB/T27642-2011标准外，目前在牛个体及亲子鉴定中普遍使用的方法还包括STR（短串联重复序列）和SNP（单核苷酸多态性）分析等。

总之，牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法GB/T27642-2011是一项非常有用的技术，可以为畜牧业的生产提供科学依据。

牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法的相关资料

和牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法类似的标准

GB/T27642-2011

牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法

2022/10/28 3:29:11 现行