国家标准 GB/T36831一2018 松纺锤瘤锈病菌检疫鉴定方法 & DetectioamdidentifieationfCronartiumfsi/formeIHedgeek HuntexCummins 2018-09-17发布 2019-04-01实施国家市场监督管理总局发布币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36831一2018 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本标准起草单位:深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、浙江出人境检验检疫局本标准主要起草人王颖、程颖慧、叶奕优、余道坚、高瑞芳,章桂明,李芳荣、史亚千,李秋枫、刘新娇封立平、陈吴健
GB/36831一2018 松纺锤瘤锈病菌检疫鉴定方法范围本标准规定了松纺锤瘤锈病菌(Cron ronartiumfusiformeHHedgcock& HuntexCummins)的检疫鉴定方法本标准适用于松纺锤瘤锈病菌寄主、转主寄主及其产品中携带松纺锤瘤锈病菌的检疫鉴定术语和定义下列术语和定义适用于本文件 2. 性跑子器pycnia 由担抱子萌发形成的单核菌丝体在侵染寄主时形成的锈菌性器官 2.2 性跑子pycnispure 性袍子器中产生的单核袍子 2.3 锈袍子器aeeia" 由性抱子与受精丝结合或与单核菌丝结合产生的双核次生菌丝组织 2.4 锈抱子 aeciospore 锈抱子器中产生的串生、单胞、双核,黄色、,球形或卵形的袍子 2.5 夏抱子堆uredinium 由双核菌丝产生的成堆的黄色或橙黄色的双核抱子 2.6 夏抱子urediniospore 夏抱子堆内产生的单胞、双核表面有细刺或疣刺的无性袍子 2.7 冬袍子telpure 由双核菌丝产生的厚壁有性抱子在生长后期形成的单胞或多胞的休眠袍子 2.8 冬抱子堆telia 冬抱子聚集在一起形成的组织 2.9 担子basidia 寄主体上的冬袍子萌发形成的组织 2.10 担袍子hstipure 担子横裂四胞,每胞生一小柄,其上着生单胞,无色或稍带黄色的抱子
GB/T36831一2018 基本信息中文名;松纺锤瘤锈病菌英文名;Southernfusiformrust 学名:CronartiumfusiformeHedgcock& HuntexCummins 无性态;PeridermiuumfusiformeJ.CArthur& Kern 分类地位;真菌界Fungi,担子菌门Basidiomycota,柄锈菌亚门Puceniomycotina,柄锈菌纲Pucein iomycetes,柄锈菌目Pucciniales,柱锈菌科Cronartiaceae,柱锈属Cromartium 传播途径:松纺锤瘤锈病菌主要通过气流及感病寄主传播近似种;油松庖锈病菌Cyroariumcoleworioides,北美松庖锈病菌c.coandrae,香蕨柱锈菌 C.compi toniae 苏格兰松庖锈病菌C flaccidum 松纺锤瘤锈病菌的其他信息参见附录A一附录c 方法原理松庖锈病菌的形态学特征及ITS1/ITS4核酸序列比对结果作为检疫鉴定该病菌的主要依据,同时参考病原菌的发生国家和地区、寄主范围及为害症状 5 仪器用具和主要试剂 5.1仪器用具高压灭菌锅、显微镜、体视显微镜、冰箱、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅、样品袋、标签,放大镜,培养皿、载玻片、盖玻片、手术刀、手术剪、锻子、吸管、酒精灯、滤纸等 5.2主要试剂三羚甲基氨基甲烧乙酸缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA),乙酸、乙醉、,引物ITS1/ITS4,PCR缓冲液、Taq聚合酶、dNTPs(dATPdTTPdCTP,dGTP)DNA分子量Marker等分子生物学试剂及基因组提取试剂盒 6 检疫鉴定 6.1症状检查观察松属寄主植物: a 主干和枝条上是否有圆形、纺锤形或不规则的肿瘤,肿瘤表面皮层不规则破裂，且破裂处当年生出新皮层,来年再破裂,皮层完全脱落后,露出浸透松脂的木质部,颜色较深,犹如灼伤; 肿瘤上部枝条或树干日久便枯死或风折,检查在肿瘤裂缝处是否有桔黄色蜜滴溢出,其中混有 b 性袍子肿瘤表皮下是否有黄色瘪状袍子器,含有大量的黄色粉状锈抱子 d 受侵种苗是否出现丛枝
GB/36831一2018 观察栎属等转主寄主植物的叶片,是否出现叶斑及黄色小点,即夏抱子堆,叶的正面相应部分色泽较健康部分稍淡在夏袍子堆中生出许多褐色至暗褐色的毛状物,即冬袍子柱松纺锤瘤锈病菌及其近似种的症状及病原菌特征比较参见附录B 将可疑样品带回实验室作进一步检验,记录样品品种、数量,来源国及取样地点,取样人和取样日期等信息 6.2形态学特征锈袍子器球形至梭形,壁薄,厚度为2个一3个细胞,有犹状突起;锈袍子倒卵形至近球形,大小为 22Mm~284m)×(134m~18m),具有粗糙的疣状隆起,高为l.5m~2.5m 夏袍子堆着生在叶背面,半球形,偶尔有侧丝,透明至棕色;夏袍子卵形至椭圆形,微黄色,大小为(17umm一21um)又 12 15 5Mm)，夏抱子表面有均匀锐利的小刺,长为0.7m1.5Mm 冬袍子堆着生在叶背面,散 2Am 开,呈纤维状栗棕色袍子柱;冬袍子圆柱形至梭形,微黄棕色,大小为(354m704m)×14m~ 27 7m)，壁光滑,有1个或2个萌芽孔松纺锤瘤锈病菌及其近似种的病菌形态鉴定特征参见附录B 和附录c 6.3核酸序列比对 6.3.1引物采用ITs1/ITs进行扩增,引物序列为 ITS1:5'-TCCGTAGGTGAAcCTGCGG3' TS4:5'-TCcTccGCTTATTGATATGC-3 6.3.2DNA提取取病原菌袍子提取DNA(参见附录D) 6.3.3PCR反应 PCR反应体系总体积304L,包含:缓冲液3.0L;10mmol/1L.dNTP0.5AL;Taq聚合酶2.5U;引 1min.53C1min. 物各05l(ce0mal/L);DNA摸板1儿反应程序.94C预变性2mm;9!c1 72C延伸1.5min,30个循环;72C延伸10min 扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中电泳,EB染色后凝胶成像,如有目标片段大小的单带出现,扩增产物进行序列测定将测序获得的序列与NCB网站GenBank中相关序列进行同源性比对分析结果判定病害症状符合6.1,而且病菌的形态学特征符合6.2,ITs序列比对结果与6.3描述相符,判定为松纺锤瘤锈病菌样品保存与处理松纺锤瘤锈病的样品或病组织及玻片标本,核酸等需保存至少6个月,以备复验,谈判和仲裁保
GB/T36831一2018 存期满后,样品经高温高压灭菌或其他适当的方式进行除害处理实验室记录保存妥善保存检测报告包括症状、病菌等图文资料检测报告注明检测日期、方法、结果等,并有实验人员和审核人员签名
GB/36831?2018 ? ?? ???????Χ A.1???Cronartiumfusiforme???Χ A.1.1? ,?ī硢?,?,??????,? ???Σй A.1.2Χ :?Pin4sarmandii,?P.banksiana,?P.caribaea,P.chihuahana P.clausa,??P.contorta,P.densiflora,?P.echinata,?P.elliotti,к P P khasya,?.leiohylavar.chihuahana,P.luchensis,βPma.soni halepensis alustri,Ponderoa, ana.,??P mugo, binaster,? radliata,? P P pungens rigida, ,?? P resinosa serotin P.silestris ?Ptaizeanensis,Pteocote P tabuulaefor'is taedla Pthunbergii, uirginiana, y4717n7e7.57 ?:Quereusacuta, agrifolia,Q.alba, ctiss1a Q.alien,?Q.bicolor chrysolepis,?Q.coccifera,? boreal7S Q.coccinea engelmanni, Q dentata,? dougkasi,?Q.dumosd Qfabri, glauca,? Alandwlifera,? Q Q falecata, garya71 griffithii,Q ile ,? a ib7 ?Q.kelogxi?Q..laurif Q ma.rima, lia,Qla.sitaica coruick nacrocaba, ariladic 7 ? 71o7ngolica 71o7nta7na 1rs71qe neO QnigraQ pelunculata,?Q hellos, ???? reticulata, brno1deS rbra Q semecarpifolia,?Q.serratc stellata,?Q.tinnctoria,Q.tomentosa,? weluima toae Q uirginiana urticaefolia??Qvariabilis wis/iceniη?Rhuschinensis,Casaneabwngeana,?C.crenata,C.dentata,? Q henryi, ,c ,?C.satiua,?Castanopsiscuspidata, Collissina bumila Pasania Cyelohalapsis4kauca??Fuguja/onica??Lihowrpwsdensi/wrus densiflora ??Cronartiumcomnandrae???Χ A.2.1 ? ? A.2.2Χ ;?P.altenuata,??.ban/k siana,СP.contorta,?С? contorta
GB/T36831?2018 .latifolia,?? .eehinala,??.ellioi,P.glabra,??.jeffreyi,?? Var P mugo,??P.migra,P.pinaster,P.ponderoa,Ppungens,? P ,,Prigida,P.serotina, ,??P?.sy(yestris,? , resinosa taedla P. uirginiae ?:Conandraumbellata,Geocaulonliuidwmn ?Cronartiwmcomponiae???Χ A.3.1? ? A.3.2Χ ;?P?banksiana,С?.contorta.,??ehinata???wuo, Ppwndrwa,?P.resioxa?.rigida,???.sykesris,? col -? pi eri,P.desi/lora,??.jefreyi?Pmurieata,??Pnigra ,P pungen.,P.radaa,P.aeda.,P?wrginiana ? naster ?:?Comptoniaperegr grina,÷Myricagale? A.4??Cronartiumcoleosporioides???Χ A.4.1? ??Σ?ī A.4.2Χ ;?P.banksiana,СP.contorta,?СP.contortavar.latifoliaP contortavarmurrayana,P.couleri,Pengelmanni,?Pjeffreyi?P monlezumae,Ppondlerosavarscopulorum ?:Caxtillejasp.,οScrophulariaceae A.5???Cronarliumlaecidwm???Χ A.5.1? ,,?,??????й ????? A.5.2Χ ;??P.syeestrisP.pinaster,ɡP.pinea,кP.halepensis ?.tabuli/formis,P.densi/lowra? ?:Asclepiasspp.?Impatiensspp?Paeoniaspp.
GB/36831一2018 附录B 资料性附录松纺锤瘤锈病菌及其近似种的症状及病原菌特征松纺锤瘤锈病菌及其近似种的症状及病原菌特征见表B.1 表B.1松纺锤瘤锈病菌及其近似种的症状及病原菌特征病原菌症状锈袍子夏抱子冬袍子病菌侵染主茎和枝条形成纺锤形或不锈袍子倒卵形至近球|夏袍子卵形至椭圆形冬抱子圆柱形至梭形,微黄棕规则形的瘤肿在形,具有粗糙的犹状隆微黄色,有均匀锐利的色壁光滑,有1个或2个萌芽 fwsi/forne" 转主寄主植物的叶起,大小为224m 小刺,大小为(17Am 孔,大小为(35Mm704m)× 124nm 部出现叶斑及黄色28m×13m21 Hm 14am274m 小点受侵种苗常18Mm 15m 出现丛枝病菌侵染枝干形成溃疡斑,溃扬部位流锈抱子梨形或长梨形.夏抱子椭圆形或倒卵顶端的冬抱子柱短椭圆形,末出松脂,并出现橙红通常上端尖,也称泪珠形,壁透明,表面刺状，端的圆形或短截形,壁透明在色的锈袍子器形,壁有疣状突起,大小萌芽孔不明显,大小为浅黄色至金色,光滑,大小为 coandrae" 转主寄主叶部和茎 31 ×l(284m一654m)×84m 为(32Hm一87 4m)×20 Am Mm 部出现淡黄色的斑 15Mm~26m) 16Hm~234m 184m) 点,斑点处着生毛发状褐色冬袍子堆顶端的冬袍子短椭圆形，下端病菌侵染主茎和枝锈抱子宽椭圆形或卵夏袍子椭圆形或倒卵的更长,圆柱形至纺锤形,末条,形成纺锤形肿形,通常上端尖,壁有疣形,壁透明,表面刺状，端的圆形或短截形,壁透明大病斑长是宽的状突起,大小为(23m萌芽孔不明显,大小为 cobtoniae 光滑,浅黄色至金色,大小为 4倍.常环割较小的33pm)×16ml20m一36gm)x (25 一75m)×(9m 4m一茎和枝条 244m 13m~214m 18nm) 病菌侵染寄主植物夏抱子椭圆形、倒卵形顶端的冬抱子短椭圆形,下端锈抱袍子长卵形或倒卵的茎和枝条,形成终或近球形,壁透明,表面的更长,末端的圆形或短截形,壁有拢状突起,大小 C.colewsporioides年长形溃疡斑,长宽刺状,萌芽孔不明显,大形,壁无色透明,光滑,大小为为(21mm354m)X 304m604m)×(74m 比超过10倍,常环小为(17 1Am29mX 14m~234mm) 刚小茎和枝条 13Hm~224m 184m 顶端的冬抱子短椭圆形,下端锈抱子球形至卵椭圆夏抱子椭圆形至倒卵的较长,接近圆柱形,未端圆病菌侵染松树植物形,壁透明,有犹状突形,壁透明,具小倒刺，形或者截短形,壁透明,光滑 laccium 的主茎和枝条形成起,大小为21Am 萌芽孔不明显,大小为浅黄色至金黄色,顶端特别是 36m) 14Am 18 树脂状溃疡斑 30m)×抱子的顶点处较厚,大小为 Am 1lm20m (20m64Am)×104m 24Mm 164m)
GB/T36831?2018 ? C ??) ???????? ?????????C.1 ?1a)??????R-h)????????ij)~k) ?? ?2:a)c)ClemsonUniversity;e)USDAForestServiee;d)Di)Robertl.Anderson;jk)羵 ?AAAntonopoulos ?3:)??5400;k)?2250 ?c.1???????
GB/36831一2018 附录 D 资料性附录 DNA提取方法 DNA提取方法如下将盖玻片切割成1mm×1mm的小块,75%乙醇浸泡1h,去离子水冲洗3遍,湿热灭菌备用; a 在解剖镜下挑取5个~100个锈菌抱子,置于上述玻片上,此上加盖另一玻片,用锁子轻压,直 b 至看见抱子压裂: 取Genomiphi裂解缓冲液3L于PCR管中,将上述两片玻片同时移人加了裂解缓冲液的 PCR管中,65C温浴10min 加人1AL中和缓冲液终止反应; d 加人1AL酶、4L无菌水、llL反应缓冲液、14l扩增混合液,30C温育2h; e 65温浴10min 加20LTE溶解DNA g 该核酸制备也可采用各实验室建立的方法
GB/T36831?2018 1]http://nt.arsgrin.gov/fungaldatabases/index.cfm [2 EPPOquarantinepest.Cronariumfusiforme,PreparedbyCABlandEPPOfortheEUun- derContract90/399003. C.M.1.1977Cronartiumfusiforme.DistributionMapsofPlantDiseasesNo.475:1-2 edition2).CABInter 1ternationalWallingfordUK C4AAAntonopou Doulos Chapman1976MorphologyofCronartiumfusiformeAeeios pores:ALightandScanningElectronMicroscopicStudyBotanicalGazette137(3);285-289 [5 Cannon,P,F.2007.Cronartiumquercuum.IMIDescriptionsofFungiandBacteriaNo.1724. CABInternationalEuropeEgham,UK [6 I.M.I.1996.Cronartiumquercuum.DistuibMapsP1.Dis708:l-4. [7 MordueJ.E.M.andGibson,I.A.S.1978.Cronartiumcoleosorioiles.C.M.l.Descript pathog.FungiBact.57712. [[8]AndrewsE.A.HarrisonM.D.1959CronartiumcomandraeinWyomingP1.Dis.Reporter 43:418-419. [[9]MordueJ.E.M.andGibson,I.A.s.1978.Cromartiumcomandrae.c.M.I.Deserijpt. PathogFungiBact.578:1-2. [[1o]MordueJ.E.M.andGibson,I.A.s.1978.Cromartiumcomptoniae.c.M.I.Deseript. PathogFungiBact.579:1-2. 0

松纺锤瘤锈病菌检疫鉴定方法GB/T36831-2018

松纺锤瘤锈病是一种常见的松树病害，主要由褐毛壳菌属（Melampsora）真菌引起。该病害在湿润环境下易于发生和传播，严重影响了全球松树的生长和利用。

为了控制该病害的传播和确保松树林木的健康，国家发布了新的标准：松纺锤瘤锈病菌检疫鉴定方法GB/T36831-2018。这一标准详细描述了松纺锤瘤锈病的检测方法，旨在确保对该病害的快速、准确鉴定和有效控制。

病原学特征

松纺锤瘤锈病的病原是褐毛壳菌属真菌，一般为两型孢子表现。夏孢子具有长椭圆形，上部带角隆起，下部略尖，有2-3个穗。秋孢子则呈现棒状或长卵圆形，不具穗突起。在实验室中，通常使用显微镜观察这些菌丝和孢子来进行鉴定。

检测方法

松纺锤瘤锈病菌检疫鉴定方法GB/T36831-2018主要包括以下内容：

样品采集：根据被检松树叶片或其他组织的生长情况选择合适的样品；
样品处理：将样品放入含有适当抑菌剂的培养基中，通过培养来提取菌株；
形态学鉴定：观察样品中的真菌形态学特征，如孢子大小、形状和穗的数量等；
分子生物学鉴定：通过PCR扩增和序列比对等技术来确定菌株的种属。

以上检测方法都需要经过专业人员的操作，并在实验室环境下进行。如果检测结果为阳性，则需要立即采取相应控制措施以遏制病害的传播。

结论

松纺锤瘤锈病是一种严重的森林病害，对松树的健康造成了很大危害。因此，在保护森林资源的过程中，对该病害进行及时、准确的检测和鉴定至关重要。松纺锤瘤锈病菌检疫鉴定方法GB/T36831-2018的发布，为该病害的检测和鉴定提供了更加科学、标准的方法。我们应当积极推广这一标准，并落实相关措施，为保护森林资源做出自己的贡献。