瓜类种传病毒检疫鉴定方法

国家标准 GB/T36781一2018 瓜类种传病毒检疫鉴定方法 Detectionamdidentfieationofcwcurbitseedtransmitedl IviruSes 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36781一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位:厦门出人境检验检疫局、宁夏出人境检验检疫 局、农业科学院郑州果树研究所、检验检疫科学研究院 本标准主要起草人:陈红运、陈青、陈林、廖富荣,方志鹏,黄峰、古勤生张永江、林石明
GB/36781一2018 瓜类种传病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了瓜类作物上5种常见种传病毒 -黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumnbergreenmottle mosaicirs,CGMMV),黄瓜花叶病毒(Cucwmbermosaicurus,CMV),甜瓜坏死斑病毒(Melonee roticsporvirws,MNSV)、南瓜花叶病毒Sguashmosaicirus,SqMV)和小西葫芦黄花叶病毒 Zwcchiniyelowmosaicvirus,ZYMV)的检测方法,规定了马铃薯Y病毒科(Pou/yiridae),烟草花叶 病毒属(Toa orus s)和南方菜豆花叶病毒属(Soben moUirLs )的分子鉴定方法 本标准适用于西瓜(Citrallusuulg 、甜瓜(Cue umi、melo)黄瓜(Cue 4cumissatius),南瓜(Cr rar7s curbitamoschata),瓠瓜(Ldgeariusiceraria)、西葫芦(Cucurbiaepo、笋瓜(Cueurbiama.rima 苦瓜(NMoordicacharantia)和丝瓜(Luffacylindrica)等瓜类作物种子的检疫鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 SN/2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法 原理 血清学特性和基因组特征是检疫鉴定的主要依据 瓜类种传病毒的相关背景资料参见附录A 仪器,试剂及耗材 4.1仪器与用具 酶标仪、洗板机、PCR仪、凝胶成像系统、恒温水浴、低温冰箱、普通冰箱、离心机、电子天平、电泳 仪、电泳槽,微量移液器、研钵等 4.2试剂与耗材 酶联免疫吸附测定(ELIsA)试剂见附录B,RT-PCR检测试剂见附录C 各种规格的吸头、离心 管,酶标版,PR管等， S 检疫与鉴定 5.1抽样 按照SN/T2122的规定执行 5.2制样 将种子播于灭菌土中,待长出3片4片真叶后,将表现症状的植株单独编号,未表现症状的植株
GB/T36781?2018 (10?1)???,????2,?????? ? ?:???? 5.3 5.3.1 ??1 1?? ???? ??? ???? ??? ?(?,?,) ??? С??? ???? ? ??? ???? ? ??? ???? ??? (,?) ?? ??? С??? ???? ??? ?? 5.3.2ELISsA ELISA?BELISA????RT-PCR? ???ELIsA?,??RT-PCR? 5.3.3RT-PCR ?????RNA,???eDNA,PCR??? ,?????,???? ?C 5.3.4/? ???(CMV,CGMMV,MNSV,SqMV,ZYNMV)??,?
GB/36781一2018 行病毒科/属的分子鉴定 马铃薯Y病毒科、烟草花叶病毒属和南方菜豆花叶病毒属的分子鉴定方法 见附录D. 结果判定 6.1特定病毒的结果判定 酶联测定和RT-PCR检测结果均为阳性,判定检出特定的病毒 采用RT-PCR直接检测样品时,扩增出预期大小的条带时,判定检出特定的病毒 注:必要时,可进一步测序验证 6.2病毒科/属的结果判定 样品扩增出预期大小的条带,且测定的序列为相应病毒科/属的序列时,判定检出相应病毒科/属成 员 否则判定未检出 注:必要时,可采用下一代测序技术(NGS)对病毒科/属鉴定结果为阴性的显症植株做进一步分析 结果记录 记录包括;样品来源、,种类,取样人员、原始记录和检测结果等 酶联测定应有酶联板反应的原始数 据,RT-PCR检测应有电泳图片,必要时需附上测序结果 8 样品保存 经检验确定携带病毒的样品应在合适条件下保存,种子保存在4C,病株在一20C或者一80C冰 箱中保存,做好标记和登记
GB/T36781一2018 附 录 A 资料性附录) 瓜类种传病毒特性 病毒种类 瓜类作物上的种传病毒见表A.1 表A.1瓜类作物上的种传病毒 病毒名称 科 属 分布地区 序号 英国、希腊、罗马尼亚、匈牙利、 印度,沙特阿拉伯、丹麦、德国、 黄瓜绿斑驳花叶病毒Cucumber" 植物杆状病毒科 烟草花叶病毒属俄罗斯、保加利亚、捷克、巴西 wrenmlemuiewrw,cGM Virgauiridae Toaouirus 爱尔兰、摩尔多瓦、瑞典、芬兰 MV 韩国,朝鲜,以色列,波兰,日 本 巴基斯坦、 黄瓜花叶病毒(C" 雀麦花叶病毒科 黄瓜花叶病毒属 Ctucunberosaic 广泛分布 vuirs,CMV Bromoiridae Cwcumovirws 甜瓜坏死斑病毒(Melonnecrotie 番茄丛矮病毒科麝香石竹斑驳病毒属日本、美国、希腊、瑞典、意大利、 ,MNs) 突尼斯、局部 Tonbuuszuiridlae Caroirtus spoirus, 南瓜花叶病毒Sgashmosaice 伴生豇豆病毒科 豇豆花叶病毒属 广泛分布 uirus,SMV Secoiridae Cooirs 小西葫芦黄花叶病毒(Zn Zucchini 马铃薯Y病毒科 马铃薯Y病毒属 广泛分布 yellowemosaier4s,ZYMV Pouyirs Po/ywiridae A.2基因组特征 A.2.1马铃薯Y病毒科 马铃薯Y病毒科包括8个病毒属,除了大麦黄花叶病毒属为二分体粒子外,其他7个病毒属均为 单分体粒子 马铃薯Y病毒属(Potyirus)是马铃薯Y病毒科中最大的病毒属,有146种病毒 Poty nm15 uirus病毒粒子为弯曲线状,长度为650nm900 nm,直径11 5nm 基因组为1条正义 ssRNA,长度8.5kb12kb A.2.2烟草花叶病毒属 病毒粒子长直杆状,长度300nm3101 nm,直径18nm 基因组为1条正义ssRNA,长约6.4kb A.2.3豇豆花叶病毒属 病毒粒子为等轴对称二十面体,直径约28nm 二分体基因组,由RNA和RNA2组成 RNA的
GB/36781一2018 5'端连接VPg,3’'端为Poly(A),两端各有1段非编码区 RNA1长5.9kb7.2kb,RNA2长3.5kb 4.5kb A.2.4麝香石竹斑驳病毒属 病毒粒子为等轴对称二十面体,直径约32 nm35nm 单分体基因组,RNA的3'端无Poly(A), 5'端可能有一个甲基化的核苷酸帽子结构 A.2.5黄瓜花叶病毒属 病毒粒子为等轴对称的二十面体,直径约29nm 三分体基因组,每个病毒粒子包裹有单分子的 RNA1或RNA2,或者包裹RNA3和RNA4 每个RNA片段的5'端为甲基化帽子结构,所有RNA片 段的3'端有一个约200t的同源区,3'端无Poly(A),但为tRNA状结构 A.2.6南方菜豆花叶病毒属 病毒粒子为等轴对称二十面体,直径约30nm 基因组为1条正义ssRNA . A.3症状 A.3.1黄瓜绿斑驳花叶病毒 黄瓜;叶片斑驳并凸起,畸形,植株矮化,果实上可产生黄或银色条斑,果实严重受损 西瓜;受侵染叶片轻型叶斑驳,严重时出现痕斑,植株矮化成熟期果实表面出现浓绿色圆斑,果肉 变色和腐烂 甜瓜;茎端新叶出现黄斑,随叶片老化症状减轻 瓠子叶片出现花叶,有绿色突起,脉间黄化,叶脉呈绿带状 A.3.2黄瓜花叶病毒 苗期染病子叶变黄枯萎,幼叶呈深绿与淡绿相间的花叶状,同时发病叶片出现不同程度的皱缩、畸 形 成株染病新叶呈黄绿相间的花叶状,病叶小且皱缩,叶片变厚,严重时叶片反卷;茎部节间缩短,茎 畸形,严重时病株叶片枯萎;瓜条呈现深绿及浅绿相间的花色,表面凹凸不平,瓜条畸形 A.3.3甜瓜坏死斑病毒 被感染的子叶上出现坏死斑,35天后扩展至2mm~3mm 随着植株的生长,叶片上出现系统 性坏死斑点,发病严重时斑点部位坏死 A.3.4南瓜花叶病毒 严重的系统花叶,叶片和果实畸形;系统明脉、,黄色镶脉和黄色斑点 A.3.5小西葫芦黄花叶病毒 褪绿局部斑,系统明脉,黄化,花叶,叶片畸形,矮化.
GB/T36781?2018 ? B 淶??) DAs-EL.ISA B.1? B.1.1 ??塣 B.1.2?? ???塣 B.1.3 pNPP B.1.4PBST?(pH7.4 NaCI 8.0g Na;HPO 1.15? KHPO 0.2g KCI 0.2g Tween-20 0.5ml ?1L B.1.5???pH7.4 NagSO. 1.3g PVPMW2400040000 20.0s g NaN 0.2 g PsT1L4C B1.6?(pH9.6) 1.59 NagCO g NaHco. 2.93g NaN 0.2g ?1L,4C档 B.1.7?????(plH7.4) 2.0g BSA(???)?? PVP(MW2400040000 20,0 NaN 0.2g PBST1L4
GB/36781一2018 B.1.8底物(pNPP)缓冲液(pH9.8) 0.1 MgCI g NaN 0.2g 二乙醇胺 97mL 溶于800mL.水中,用HC调pH值至9.8,用水定容至1L 4C储存 B.2程序 包被抗体 B.2.1 用包被缓冲液将抗体按要求稀释,在酶标板中每孔加100L,37C孵育2h 清空孔中溶液,PBsT 洗涤3次 B.2.2样品制备 待测样品按110(质量;体积)加人抽提缓冲液,用研钵研磨成浆7500尽离心10mim.上清即为 制备好的检测样品 阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行;空白对照为样品抽提缓 冲液 B.2.3加样 根据检测需要设计酶标板,包括2个阴性对照孔、2个阳性对照孔、2个空白对照孔和多个待测样品 孔 每孔加100AL,每个样品设2个重复，4C冰箱孵育过夜 清空孔中溶液,PBST洗涤3次 B.2.4加酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液按要求稀释酶标抗体,每孔加100AlL,37C孵育4h 清空孔中溶液,PBST 洗涤3次 B.2.5加底物 将底物NPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用),每孔加100L 室温避光放 置30nmin~60min B.2.6吸光值测定 阳性对照孔明显变色时,用酶标仪在405nm波长读取吸光值 B,3结果判定 B,3.1对照孔的OD值(缓冲液孔,阴性对照及阳性对照孔),应该在质量控制范围内,即: 缓冲液孔和阴性对照孔的OD值<0.15; 阳性对照OD值/阴性对照OD值>2 同一样品的OD值应基本一致 B.3.2在满足了B.3.1质量要求后,结果原则上可判定如下 样品oD值/阴性对照oD值>2,判定为阳性; 样品oD值/阴性对照oD丽值接近阔值,判定为可疑样品,需重做一次或用RTPCR验证;
GB/T36781一2018 样品OD值/阴性对照OD值<2,判定为阴性 B.3.3若满足不了B.3.1质量要求,则不能进行结果判定 B.3.4使用检测试剂盒时,应根据试剂盒的说明进行结果判定
GB/36781一2018 附录 C 规范性附录 RI-PCR检测 C.1试剂 C.1.1TrizoL裂解液 C.1.2三氯甲烧 c.1.3异丙醇 C.1.475%乙醉 c.1.550×TAE Tris 242g 冰醋酸 52.1lml Na,EDTA2H,O 37.2g 加水定容至1L 用时加水稀释至1×TAE C.2实验步骤 C.2.1总RNA提取 称取0.1g植物组织加液氮研磨成粉末状,迅速将其移人灭菌的1.5mL离心管中,加人1mL的 TrizoL试剂,剧烈振荡摇匀后室温保持5min;4,12000片离心10min,取上清;加人0.2m三氯甲 烧并剧烈振荡混匀;4C,12000片离心10min,取上清;加0.6倍体积的异丙醉,颜倒混匀,室温保持 5min;4C,12000离心10min,弃上清;用75%的乙醇洗涤沉淀,4C,7500片离心2min,弃乙醇; 沉淀于室温下充分干燥后,溶于30L.水(DEPC处理)中,一20C保存备用 注:也可采用等效的试剂盒提取总RNA. C.2.2RT-PCR扩增 c.2.2.1eDNA合成 RT-PCR检测引物见表C1 cDNA合成体系20AL;在0.2ml反应管中加人总RNA6AL,lAL 下游引物204mol/L),水4AL,10mmol!/L.dNTPs1AL,65C水浴5min,取出后立即放在冰上,加 人5×FirstStrandBufer4AL,40U/AlRNaseBlockRibonucleaseInhibitor1AL,0.lmol/LDTT 2L.12C水浴2min,然后再加人200U/LReerseeTanseripaselA,混匀后42C水浴50nmin 70C水浴15min,合成eDNA FirststrandBuffer和ReverseTranseriptase的用量需要依据反转录 酶的品牌进行调整 注，也可采用一步法RT-PCR试剂盒扩增
GB/T36781一2018 表c.1RRT-PCR检测用引物 病毒 引物名称 序列(5'-3' 片段/bp 参考文献 cGMMV-F ATGGCTTACAATCCGATCAC CGMMV 486 陈红运等,2006 CGMMV-R TAAGCTTTc(GAGGTG(GTAGc CMV1-F CG;ACTTAATAAGACGTTAGCAGc CMV CMVI-F TcCcCAATGCTAGTAGAACCTCc 500/600 Yuetal.,2005 CMV-R TGCTCRAYGTCRACATGAAG MNSV-F GTGAAGCTCGCTAARCAGG;C Yakoubietal. MNSV 711 2008a MNSV-R ACRTARAGATCACCRTGGGC CATGGTACAGCAGCTTG;GAAc SF SgMV 597 廖富荣等,2013 GAAGcCACAACAAAAccCAGA sMV-R ZYMV-F GGTTcATGTcCCAcCAAGC ZYMV 605 Yakoubietal.,2008b ZYMV-R ATGTcGAGTATCACATTTcCC 注:CMVI-F与CMV-R检测CMV亚组I的分离物,扩增产物为500bp;CMVl-F与CMV-R检测CMI亚 组l的分离物,扩增产物为600 bp C.2.2.2PCR扩增 PCR反应体系见表c.2 PCR反应参数见表c.3 表C.2PCR反应体系 组分 体积/pL 0×PCRBufferMgCplus) 2.5 dNTP(10mmol/L 1.0 上游引物20molL 0,5 下游引物(204nmol/L) 0.5 Ta酶(5U/AL 0,2 cDNA 2,0 反应体系 25 表c.3rCR反应参数 病毒 参数 95C3min; CGMMV 9530s5345s,72C45s35个循环 72C7min 95C3min; 9530s,4645s,7245s,5个循环; CMV 9530s,5045s7245s,30个循环 min 10
GB/36781一2018 表c.3(续 病毒 参数 5C3min; MNSV 95C30s,50C45s,72C45s,35个循环 727min 95C3min qMV 95C30s,60C45s,72C45s,35个循环; 72 min 95"3min; ZYMV 45s,35个循环; 5仑30s,弱仑4打s.72c 72C7min C.2.3电泳 C.2.3.1制备凝胶 配制1.5%质量:体积)的琼脂糖凝胶 溴化乙锭可直接加人琼脂糖凝胶中(浓度为0.5g/mL). 也可在电泳完成后使用澳化乙锭染色 C.2.3.2电泳 用1L6×加样缓冲液与5L样品混合,然后将其和适合的DNA分子量标准物分别加人到样品 孔中 电泳结束后将琼脂糖凝胶置于紫外透射仪上观察,拍照并保留结果 C.3结果判定 在阴性对照和空白对照无特异性扩增、阳性对照出现预期大小条带的情况下 样品出现与阳性对照大小一致的条带,判定RT-PCR检测结果为阳性 注必要时,可进一步测序验证 -样品未出现与阳性对照大小一致的条带,判定RT-PCR检测结果为阴性 11
GB/T36781一2018 附 录 D 规范性附录) 病毒科/属鉴定方法 试剂 D.1 见C.1 D.2实验步骤 D.2.1总RNA提取 见C.2.1 D.2.2Rr-CR扩增 D.2.2.1cDNA合成 病毒科/属鉴定所用引物见表D.1 cDNA合成见c.2.2.1 表D.1病毒科/属鉴定用引物 科/属 引物名称 序列5'-3’ 片段/p 参考文献 Sprimer GGNAAYAAYAGYGGNCARCC 马铃薯Y病毒科 M4 GTTTTCCCAGTCACGAC 约1700 Chen& Adams,2001 Pofyiridae "M4T GTTTTcccAGTcAcGAc(T) TobRTupl GARTAYsCIGcCIYTICARAc 第1轮PCR *TobRTdo2 GCYTCRAARTTcCA 568 烟草花叶病毒属 TobNup3 GGCGYTGCARACIATHGTITAYCA Dovasetal.,2004 Tobaowirus 第2轮P(CR TobNdo! GTRTTICCIATRAAGTGTACRTC 400 TobNdo4G GCCGATRAAGGTGGTGACRTC 南方菜豆花叶病毒属Sobemo-RdRp-5” CCNTCNAARCCNGGNATGGG 约400 L.ecoqetal.,2011 Sobemoir4s RTCCcCATNG;CDATRCACCA *Sobemo-RdRp3" 注:标记*的引物(M4T,TobRTdo2,Sobemo- ARN 合成 D.2.2.2CR扩增 用于鉴定马铃薯Y病毒科、烟草花叶病毒属、南方菜豆花叶病毒属的PCR反应体系与反应参数分 别见表D2、表D.3,表D.4 12
GB/36781一2018 表D.2马铃薯Y病毒科CR体系 组分 体积/4l 水 38.5 10× RRBufer(MgClplus) 小NTP(10mmol/L.) Sprimer(20mol/L M420mol/1 ruq鹏GU/AL 0.5 cDNA 反应体系 50 95"C3min; 9530s,47 min,72C1min,35个循环; 72C7min 表D.3烟草花叶病毒属CR体系 第l轮PCR 第2轮CR 组分 体积/L 组分 体积/4L 水 35.5 水 34 RBaufer(MgClplus) 10× 10×PCRBuffer(MgClplus NTP(10mmol/L) dNTP(10mmol/L TobRTupl204mol/1 TobNup3204mol/1) 2.5 2.5 TobRTdo220Mmol/1) 2.5 TobNdo420mol/I 2.5 Tu酶(sU/AL) TobNdo4G(20mol/L 0,5 2.5 DNA 0.5 Taq酶(5U/AL 反应体系 50 第1轮PCR产物 50 反应体系 95C3tmin3 95C3min; 5C30s,43C45s,72C45s,5个循环; 95c30s,51c45s,72c 45s,2个循环" 9530s,46C45s,72C45s,35个循环; 9530s,61C45s,7245s,26个循环; 72C7min 72 7min 13
GB/T36781一2018 表D.4南方菜豆花叶病毒属CR体系 组分 体积/4L 水 38.5 10×PCRBufer(MgClplus) dNTP(10mmol/L) Sobemo-RdRp-5’204mol/1L Sobemo-RdRp3'(204mol/L Taq酶(5U/AL 0.5 DNA 50 反应体系 95C3min; 95C30s,55C45s,72C45s,35个循环 72C7min D.2.3电泳 见C.2.3 D.2.4测序 待检样品出现与阳性对照一致的扩增片段时,应对PCR产物进行序列测定和分析 D.3结果判定 阴性对照和空白对照无特异性扩增,相应科/属病毒的阳性对照出现预期大小的条带 样品出现与阳性对照大小一致的条带,且测定的序列为相应病毒科/属的序列,判定检出相应 科/属的病毒 样品出现与阳性对照大小一致的条带,但测定的序列非相应病毒科/属的序列,判定未检出相 应科/属的病毒 样品未出现与阳性对照大小一致的条带,判定未检出相应科/属的病毒 14
GB/36781一2018 参考文献 [1]陈红运,赵文军,程毅,等 辽中地区西瓜花叶病病原的分子鉴定 植物病理学报,2006,36 4):306-309. [[2]廖富荣,叶志红,陈青,等 应用RT-PCR和IC-RT-PCR方法检测南瓜花叶病毒 植物检疫 2013,272):60-64. [3]ChenJ,AdamsMJ.AuniversalPCRprimertodeteetmembersofthePotyiridaeandits usetoexaminethetaxonomiestatusofseveralmembersofthefamily.ArchivesofVirology,2001,l46 4:757-766. [4]DovasCI,EhimiouK,KatisNI.Generiedeteetionanddifferentiationoftobamovirusesby aspotnestedRT-PCR-RFLPusingd-containingprimersalongwithhomologousdG-containin ngprim ers，Journalofvirologicalmethods,2004,117 [5” LecogH,DafallaG,Delecolle Snakemelonasteroidmosaicvirus,atentativenew memberofthegenusSobemovirusinfectingcucurbits PlantDisease,201l,95(2):153-157 [6]YakoubiS,DesbiezC,FakhfakhH,etal.FirstreportofMelonnecroticspotvirusonmelon in Tunisia Plantpathology,2008a,57(2):386-386. YakoubiS,DesbiezC,FakhfakhH,etal.Molecular,biologicalandserologicalvariabilityof ZucchiniyellowmosaicvirusinTunisia.Plant pathoogy y,2008b,576):1146-1154. [[8]Yuc,wuJ,Zhoux.DeteetionandsubgroupingofCucumbermosaievirusisolatesbyTAs ELISAandimmunocaptureRT-PCR.Journalofvirologiealmethods,2005,123(2):155-161.

瓜类种传病毒检疫鉴定方法GB/T36781-2018

背景

瓜类是一类常见的蔬菜作物，在中国有着广泛的栽培和消费群体。而种传病毒是瓜类中常见的病害，在瓜类的生产和流通过程中会对产量和质量造成很大的影响。因此，对种传病毒进行检测和防控具有十分重要的意义。

GB/T36781-2018标准

GB/T36781-2018标准规定了针对种子、幼苗、植株等瓜类样品进行检疫鉴定的技术要求、方法和程序。该标准主要适用于对进口和出口瓜类及其种子进行检疫鉴定，以及对瓜类材料的科学研究。

瓜类种传病毒

瓜类种传病毒是一类通过种子或昆虫媒介传播的病毒病害，在瓜类中比较常见。不同的病毒会导致瓜类不同的症状，如萎蔫、变黄、变形等。因此，在瓜类的生产和流通过程中，对种传病毒进行检测尤其重要。

GB/T36781-2018标准下的鉴定方法

根据GB/T36781-2018标准，对瓜类种传病毒的检疫鉴定应遵循以下步骤：

1. 采集样本：在瓜类幼苗发病初期或叶片上出现斑点、卷曲、变黄等症状时，采集样本。
2. 提取核酸：将样本中的核酸提取出来，可以使用RNA或DNA提取试剂盒。
3. PCR扩增：将提取出的核酸进行PCR扩增，利用引物检测是否存在种传病毒。
4. 结果分析：根据PCR扩增的结果，判断样本中是否存在种传病毒。

总结

GB/T36781-2018标准下的瓜类种传病毒检疫鉴定方法能够有效地提高农业检疫工作者的检测水平，保障农产品质量和安全。在瓜类的生产和流通环节中，建议广泛应用该标准，加强对种传病毒的检测和防控。

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