GB/T38579-2020
生物产品中光合细菌测定
Determinationofphotosyntheticbacteriainbiologicproducts
- 中国标准分类号（CCS）A21
- 国际标准分类号（ICS）07.080
- 实施日期2020-03-31
- 文件格式PDF
- 文本页数16页
- 文件大小918.76KB
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生物产品中光合细菌测定
国家标准 GB/T38579一2020 生物产品中光合细菌测定 Determinationofphotosynthetiebaeteriainbiologieproduets 2020-03-31发布 2020-03-31实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/38579一2020 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由标准化研究院提出并归口 本标准起草单位;湖南农业大学、标准化研究院、江汉大学,北京工商大学,武汉明了生物科技 有限公司、北京萨姆伯科技有限公司
本标准主要起草人;周辉、马爱进、彭海、贾英民、田云,郝帅
GB/38579一2020 生物产品中光合细菌测定 范围 本标准规定了生物产品中光合细菌的测定方法
本标准适用于生物产品中深红红螺菌(Rhodosirillumrubrum、黄褐红螺菌(Rhodushirillum fuluum )、沼泽红假单胞菌(Rhodopeue domonasalusris)、荚膜红细菌Rhodohactercapsulal4s)和球 形红细菌(Rhwdohwceryphaeroides)的测定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件
3.1 生物产品biologieproduets 利用生物技术获得的产品
注本标准中的生物产品特指含光合细菌的产品
3.2 光合细菌photosynthetiebaecteria 具有原始光能合成体系的原核生物,能在厌氧条件下进行不放氧光合作用细菌的总称
注，专指不产氧光合细菌,尤其是紫色非硫细幽类
属于变形菌门(Pm0 )变形菌纲(Aphapote roteobacteria)G obacteria)红 螺菌目(Rhodospirilales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、红杆菌目Rhoobacerales),包括深红红螺菌、黄褐红螺菌、沼泽 红假单胞菌,荚膜红细菌和球形红细菌等
3.3 多核苷酸多态性mwliplenueleo uidlepmbmaphism;.MnNP" -段核苷酸区域内多个核苷酸引起的序列多态性
原理 将待分离的样品进行稀释后,接种于选择性培养基中由单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌 落
根据平板的菌落数及挑取菌落的生理生化、MNP鉴定结果,对生物产品中的光合细菌进行计数 试剂或材料 本方法所用试剂均为分析纯,除特殊说明外,实验用水均为GB/T6882规定的二级水
GB/T38579一2020 5.1AT培养基;参见附录A中A.1
5.2光合细菌分离琼脂;参见A.2.
5.3磷酸盐缓冲液;参见A.3
5.4革兰氏染色液:参见A.4 5.5多重PCR扩增与文库构建试剂盒
5.6高通量测序试剂盒
5.7引物;见附录B
6 仪器设备 6.1光照恒温培养箱:照度不小于2000lx,30C士1C
6.2天平;精度为0.001迟 6.3高通量测序仪
6.4抽滤瓶
6.5均质器,无菌均质袋,均质杯 6.6水相滤膜;微孔径0.22m
微需氧培养罐;能维持1%氧浓度的透明培养容器装置
6.7 6.8无菌锥形瓶:容量250ml500mL
6.9螺口试管;容量13mL
6.10无菌培养皿;直径90mm
6.11显微镜;最低100×
样品 7.1采样原则 样品的采集应遵循随机性、代表性的原则
采样过程应遵循无菌操作程序,防止一切可能的外来 污染
7.2采样方法 7.2.1应在同一批次产品中采集样品,每件样品的采集量应满足微生物指标检验的要求，一般不少于 500g(ml)
7.2.2独立包装不大于500g的固体产品或不大于500mL的液态产品,取完整包装
7.2.3独立包装大于500mL的液态产品,应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体,使其达到均匀后采集 适量样品,放人无菌采样容器内作为一件样品
独立包装大于500《的固体产品,应用无菌采样器从同一包装的不同部位分别采取适量样品,放 7.2.4 人同一个无菌采样容器内作为一件样品
7.3采集样品的贮存和运输 7.3.1应尽快将样品运往实验室检验
应在运输过程中保持样品完整
7.3.2 7.3.3应在接近原有贮存温度条件下贮存样品,或采取必要措施防止样品中微生物数量的变化
GB/38579一2020 试验步骤 8.1样品的稀释 8.1.1固体样品:称取25g样品置于盛有225ml
磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内,8000r/min 10000r/min均质1min~2min,或放人盛有225mL稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打 lmin一2min,制成1:10的样品匀液
8.1.2液体样品;取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶瓶内预置适当数量的无 菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:10的样品匀液
8.1.3取1:10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注人盛有9m磷酸缓冲液的无菌试管中,振摇试管或换 用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1:100样品匀液
依次稀释,制备10倍系列稀释样品 匀液
mL光合细菌分离琼脂培养基倾注平m,待培养基冷却凝固后,根据对样品中光 8.1.4将15ml20 合细菌数量的估计,选择8.1.3中2个3个连续的适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),每 个稀释度接种2个无菌平皿.,准确吸取1mL均匀涂布于分离培养基上 8.1.5待8.1.4中接种物完全被培养基吸收后,将5ml 10ml冷却至46C以下的光合细菌分离琼 脂培养基倒人平皿中,并转动平皿使其完全覆盖住下层的培养基
8.2培养 待琼脂凝固后,将平皿翻转置于微需氧培养罐中30C士1C光照培养5d
8.3菌落计数 8.3.1可用肉眼观察,记录稀释倍数和相应的棕红色菌落数量
菌落计数以菌落形成单位colony ormingumits.CFU)表示
8.3.2选取菌落数在30300之间,无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数
低于30CFU的平板记录 具体菌落数,大于300CFU的可记录为多不可计
每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数
8.3.3其中一个平板有较大片状菌落生长时,不宜采用,应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的 菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代 表一个平板菌落数
8.3.4当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,将每条单链作为一个菌落计数
8.4光合细菌的鉴定 8.4.1菌落挑选和纯培养 挑取计数平板上5个(小于5个全选)菌落大、红色、棕色或黄色、表面光滑、质地柔软、边缘整齐的 菌落分别接种于光合细菌分离琼脂平板,置微需氧培养罐中,30C士1光照培养2d~3d
8.4.2MINP法鉴定 8.4.2.1DNA提取 提取纯培养中单菌落基因组DNA,将其进行纯化
提取与纯化的DNA溶液在260nm与230nm 处的吸光度值的比值大于2.0;在260nm与280nm处的吸光度值的比值介于1.7与1.9之间;DNA电 泳主带明显,无明显降解;无明显RNA残留
GB/T38579一2020 8.4.2.2多重CR扩增与文库构建 按多重PCR扩增与文库构建试剂盒的说明书进行DNA质控、多重PCR扩增、文库构建与纯化,且 多重PCR的扩增循环数不高于20个
8.4.2.3高通量测序 按高通量测序试剂盒和高通量测序仪的操作说明进行高通量测序与测序质控
高通量测序的平均覆盖倍数设置为700倍以上,测序长度大于标记引物在参考基因组上的扩增 长度 8.4.2.4实验数据质量控制 利用光合细菌鉴定软件将样品的测序数据比对到参考基因组的标记位点上,统计标记位点的平均 覆盖倍数C
当C<500时,判定样品的测序数据量不足,从8.4.2.2或之前的步骤开始重新实验
当C>500时,判定测序数据合格
8.4.2.5结果判定 利用光合细菌鉴定软件统计光合细菌的检出标记的数目N,并输出判定结论
若N=0,判定结论为“传测菌落不存在该光合细的”" 着N=1或N=2,判定结论为"待测菌落中可能存在该光合细菌” 若N>3,判定结论为“待测菌落中存在该光合细菌”
对于判定结论为“待测菌落中可能存在该光合细菌”的样品
8.4.2.6防污染措施 样品准备、核酸提取,多重PCR扩增与高通量测序应在规定的区域内进行操作且保持实验室通风 良好
不同区域的仪器和设备应专用
8.4.3形态学鉴定 挑取纯培养物,进行染色镜检,紫色非硫细菌形态特征见附录C中的C.1
8.4.4碳源利用试验 将纯培养物分别接种于含有不同碳源的AT培养基中,30C士1C光照培养3d5d
紫色非硫 细菌中代表属种的生理生化鉴定特征见附录C
8.5试验数据处理 8.5.1菌落的计算方法 每个平板中光合细菌菌落的计算见式(1) 云xe 式中: -每块平板上的光合细菌菌落数 a -挑取后经证实为光合细菌的菌落数; 挑取平板上用于验证的菌落数;
GB/38579一2020 平板上的所有特征菌落数
8.5.2菌落总数的计算方法 8.5.2.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平 均值乘以相应稀释倍数,作为每克(毫升)样品中菌落总数结果
8.5.2.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按式(2)计算 N n十0.ln) 式中: -样品中某一种光合细菌的活菌数; 习c -平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和 第一稀释度(低稀释倍数)平板个数; n -第二稀释度(高稀释倍数)平板个数; 刀a 稀释因子(第一稀释度. 8.5.2.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU,应对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可 记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算
8.5.2.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数 计算
8.5.2.5若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,以小于1乘以最低稀释倍数计算
8.5.2.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU~300CFU之间,其中一部分小于30CFU或大于 300CFU时,以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算
8.6菌落总数报告 8.6.1若N为0,则以小于1乘以最低稀释倍数报告
8.6.2菌落数小于100CFU时,按“四舍五人”原则修约,以整数报告
8.6.3菌落数大于或等于100cFU时,第3位数字采用“四舍五人"原则修约后,取前2位数字,后面用 0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按“四舍五人”原则修约后,采用两位有效数字
8.6.4若所有平板上为蔓延菌落而无法计数,报告菌落蔓延
8.6.5若空白对照上有菌落生长,此次检测结果无效
8.6.6称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告
GB/T38579一2020 附录 A 资料性附录 培养基 A.1AT培养基 A.1.1基础培养基 成分 碳源 10mmol/1 NaHCO 1.0 g KH.PO. 1.0" NHCIl 1.0g MgCl6H.O 0.5" CaCl2H.o 0.1 NaCI 1.0g Na.SO. 0.5 g 1000 蒸水 mL A.1.2微量元素添加液 A.1.2.1成分 FeCl,4H.O 1.8" CoCl,6H.O 250mg NiCl
6H.O 10mg CuCl5H.O 10 mg MnCl
4H.O 70mg ZnCl 100mg 500 H,BO mg Na,MoO2H.o 30mg NaSeO5H.O 10mg A.1.2.2制法 上述成分分别溶解到约900mL水中,用1mol/L盐酸调节pH为23,定容至1L A.13维生素添加液 A.1.3.1成分 对-氨基苯甲酸 20mg 10 生物素 mg 100mL 蒸僧水
GB/38579一2020 A.1.3.2制法 经0.22m水相滤膜过滤,保存在无菌容器中,冷藏保存
A.1.4抗坏血酸添加液 A.1.4.1成分 5.0 抗坏血酸 g 蒸水 100nmL A.1.4.2制法 经0.22Mm水相滤膜过滤,保存在无菌容器中,冷藏避光保存 A.1.5Ar培养基制法 临用前,1000mlA.1.1基础培养基添加1ml微量元素添加液、1mL维生素添加液和10mL抗 坏血股蒂加液,调节pH6.9士01.培养某经0.2闪m水相谁顾过速,分装到13mL.灭菌纵口试管中,每 管装液12mL A.2光合细菌分离琼脂 A.2.1基础培养基 A.2.1.1成分 CIH.COO)Na
3H.(O 3.0 g NaHcO 1.0 g 2.0g 母膏 KHPO3H.O 0.5g NH,C1 1.0g MgC6H.O 0,2g NaCI 5.0 " Fe-EDTA溶液 1.0mL 琼脂粉 15g 1000mL 蒸僧水 A.2.1.2乙二胺四乙酸铁钠溶液 FesO7H.O 557mg Na,-EDTA 745mg 蒸水 100ml A.2.2基础培养基制法 除琼脂外,将其余成分游解于蒸细水中,pH69,加人琼脂,加热游解,定量分装适宜容器,121 C高 压灭菌15min.
GB/T38579一2020 A.2.3光合细菌分离琼脂制法 临用前,将基础培养基融化,保温于46C水浴,l000ml基础培养基中加人5ml抗坏血酸添加 液
摇匀后备用
A.3磷酸盐缓冲稀释液 A.3.1贮存液 A.3.1.1成分 磷酸二氢钾 34.0g" 蒸水 500ml A.3.1.2制法 用大约175AL.1mol/I氢氧化钾溶液调节pH至7.2,用燕僧水稀释至1000mL
后贮存于冰 箱中 A.3.2稀释液 用蒸憎水稀释1.25mL贮存液至1000mL,分装于适宜容器中,121笔高压灭菌15min
革兰氏染色法 A.4 A.4.1结晶紫染色液 A.4.1.1成分 结晶紫 1.0g 20mL 95%乙醇 1%草酸铵水溶液 80mlL A.4.1.2制法 将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合
A.4.2革兰氏碘液 A.4.2.1成分 碘 1.0g 碘化钾 2.0g 300mL 蒸僧水 A.4.2.2制法 将碘与碘化钾先行混合,加人蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸溜水至300mL
A.4.3复染液 A.4.3.1成分 0.25g 沙黄
GB/38579?2020 10mL 95% 90ml ? A.4.3.2? ???,???? A.4.4?? A.4.4.1?????,μ?????,??1min,?? A.4.4.2μ???,1min,?? μ95%?,?30s,??;???,?,?? A.4.4.3 ?,?10s A.44.4??,μ????,?1min,??,,? A.4.4.5;??,???
GB/T38579一2020 附 录 B 规范性附录) MNP标记引物 MNP标记引物见表B.1
表B.1MNP标记引物 名称 标记位点编号 引物类别 引物序列(5'-3'端 正向引物 GATGGGCGTCAAGGTCGA 沼泽红假单胞菌 反向引物 ACCGGCTTCGGCATGAA 正向引物 ATcAAGATcAAccAcGAGAcccN 沼泽红假单胞菌 GAGAcGTGGATCAGGCcTTc 反向引物 CGGGTGC'T(GATGATGC'TGT 正向引物 沼泽红假单胞菌 AcGccGTcGGTGCTTAAA 反向引物 正向引物 TCTTGCcGACCACGATcG 沼泽红假单胞菌 反向引物 CGACCGAAGTCGAGGTCAAG 正向引物 GGCGAAATCGTCGCCTG 沼泽红假单胞菌 GAGCAcGcTTTGGAcGAAc 反向引物 正向引物 ATcAAcGcCTTcAccAAccc 沼泽红假单胞菌 C(G(G;ACcCGGATcGATcTTG 反向引物 正向引物 GGCACGCTGTTCACCTTc 沼泽红假单胞菌 反向引物 CTTGATGTcGCCCTTGGC 正向引物 TAACGGCTGGCATTCATCGTTTA 沼泽红假单胞菌 反向引物 TGATACTGGAAGTCTTGAGTATGGCA 正向引物 ccTGcTcGTcGGTcTTcATG 沼泽红假单胞菌 CG;GTTGAACTCGCAGcTGAT 反间引物 AAGTGGTGCTGGTcGGC 正向引物 10 沼泽红假单胞菌 反向引物 CGAGAACACCTGGCTCTTCTTG 正向引物 CGGCACTTcCATGCcGA 沼泽红假单胞菌 1l 反向引物 G;TCAAC'TTcCGiAAGAGiCCGiC 正向引物 GGGAAATTGGAATGGGCGAAGAT 12 荚膜红细菌 GGTcGATCAGcGTG CTGAA 反向引物 GGAAGcGcG;TcT;TTcAAATAc 正向引物 13 荚膜红细菌 TcGATGACCTTcCAGTTGATGAATTC 反向引物 正向引物 ATGCGGGAACGCGCAGATA 荚膜红细菌 14 反向引物 ATGGTCGGAGCGAGAGGAT 10
GB/38579一2020 表B.1续 引物类别 引物序列(6'-3'端) 名称 标记位点编号 正向引物 cGcGcAATAcTACATGAAccAc 15 荚膜红细菌 CCATGcCcAGACGTTCTTTcTT 反向引物 TAGcGCACCACATccTcG; 正向引物 16 荚膜红细菌 反向引物 ATCCCGG:TGGCGGTGAAGA 正向引物 CTGATCTTTGACGCCTGCG 17 荚膜红细菌 反向引物 AGGTGAATGCCCAG;CGC 正向引物 TTGACCACCTGCACCAGCAT 18 荚膜红细菌 ccATG 反向引物 AGcATGAccAcGATc CG;G;TcTGGGCAAGAccTA 正向引物 荚膜红细菌 19 GCTTGCCCAGATAGGTcGA 反向引物 正向引物 GCGATGCT(GCGCAAGAAC 荚膜红细菌 20 反向引物 GTCGGCCTTCACCACCAGAC 正向引物 GCCTGCAAGCGCAAGATC 21l 荚膜红细菌 反向引物 CCGATCATCACCACTTCAAGC 正向引物 GcGGcATcTTTGccGAA 荚膜红细菌 22 GcGAcGATATTG;GGCAGc 反向引物 TCGATCTGGTCGAGGcCCA 正向引物 23 球形红细菌 反向引物 ACATGGCGACGCCCATG 正向引物 TCCAGTCCTcGAAGGTGCT 球形红细菌 24 反向引物 CATAGCCGAGGTAGCCGT 正向引物 CGACATGCGGTTGTTCTCGA 25 球形红细菌 反向引物 GTGATCGTGGATGGCTGGT AcccGGATccAGAccTTcG 正向引物 球形红细菌 26 GCAGGATCAcccGGATcTe 反向引物 TTGCCCATGCCGAGGATCG 正向引物 球形红细菌 27 反向引物 GCTTGCACAGGATGGCC 正向引物 GCGTCGATCAG;GTCCATCT 28 球形红细菌 反向引物 ATCGCCGTCGATGACGGGA 正向引物 GcTTcGGcGATc CGGCTT 球形红细菌 29 TTCAcTAcGGcCAcCAGAcc 反向引物 GATGGCcGTTcCCGTCcTA 正向引物 30 球形红细菌 反向引物 GCAGCCATTTCTTCGACGA 正向引物 CGGTGAACTCGAACGGGA 球形红细菌 3l 反向引物 CATCAAGAACGiAGATGCTGGiAC 1
GB/T38579一2020 表B.1续 引物序列(5'-;'端) 名称 标记位点编号 引物类别 正向引物 GGTGCAGGAGGTGATCG 32 球形红细菌 cGACATGGGcGAGATcGT 反向引物 TGCAACATGCTGTTCC(GC'TA 正向引物 球形红细菌 33 反向引物 GATGTcGTcGGCCTCGAA 12
GB/38579?2020 ? C 淶?? ?? c.1???C.1 c.1??? ? ? ? ?? ?? ? ? λ λ? ?? λ? ? ? ? ? ?C.2 C.2? ? ? ? ? pH7.0 ? 37 ? ? ?;??С90%,??? C.3???C.3 c.3??? ? ??? ? ??? pH7.0 37 ? ?:??С90%??? C.4?C.4 13
GB/T38579?2020 C.4? ? ? ? ? pH5.5 37 ? ?? ? ? ???С90%?-?? C.5??C.5 c.5?? ? ?? ? ?? pHH5.5 ?洼 25 ? ?? ? ? ?:??С90%,??? κ?C.6 c.6κ? ? κ? ? κ? pH6.0 ?洼 25 ? ? ?? ? ?:??С90%???? 14
生物产品中光合细菌测定GB/T38579-2020
传统的光合细菌检测方法主要包括计数法和培养法，但这些方法需要较长时间，并且存在误差。随着科技的不断进步，新型的光合细菌测定方法逐渐得到了广泛应用。其中，光合细菌测定法是一种利用细菌的光合能力来诱导电流产生的技术。其原理是将待检样品与光合细菌接种混合后，在一定的光照条件下，通过电化学方法测定样品中产生的电流强度，从而间接反映出样品中的光合细菌数量。
光合细菌测定法具有操作简便、快速、准确度高等特点，已经被广泛应用于食品、水产品、饮料等多个领域。其中，《生物产品中光合细菌测定GB/T38579-2020》标准规定了生物产品中光合细菌测定方法及相关参数的要求和指导原则。
该标准要求在实验室环境下使用专业的光合细菌测定仪进行检测，并且要对仪器进行严格的校正和验证，以确保测试结果的准确性。在符合上述条件的情况下，使用光合细菌测定法检测生物产品中的光合细菌效果尤为显著。
总之，光合细菌测定法作为一种新型、高效、精准的检测方法，在生物产品中光合细菌测定中具有广阔的应用前景。相信随着技术的不断发展，它将能够更好地服务于生物产品质量与安全的保障。
