隐孢子虫套式PCR检测方法

隐孢子虫套式PCR检测方法

国家标准 GB/T35942一2018 隐袍子虫套式PCR检测方法 NestedPCRmethodfordeteetionofCryptosporidumspp 2018-02-06发布 2018-09-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35942一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口 本标准起草单位:农业科学院上海兽医研究所、动物卫生与流行病学中心 本标准主要起草人:陈兆国,米荣升、黄燕、刘陆世、王岩
GB/35942一2018 隐袍子虫套式PCR检测方法 范围 本标准规定了隐袍子虫套式PCR检测方法 本标准适用于动物的隐抱子虫感染的检测流行病学调查和出人境检验检疫 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 wS/T2302002临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用 缩略语 下列缩略语适用于本文件 PCR;聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction). PEs;磷酸盐缓冲液(PhosphateBuferedSahine). TAE;Tris-乙酸电泳缓冲液(TrisAcetate-EDTABufer) EB澳化乙锭(EthidiumBromide). BSA;牛血清白蛋白(BovineSerumAIbunmin) 仪器、材料与试剂 4.1仪器 4.1.1PCR基因扩增仪 4.1.2高速台式冷冻离心机 4.1.3低速大容量离心机 4.1.4微量可调移液器:2L、10L、20L,200L、1000L 4.1.5核酸电泳仪 4.1 核酸电泳槽 1.6 4.1.7凝胶成像分析系统 4.1.8生物样品均质研磨仪 4.1.9高压蒸汽灭菌器 4.2材料 4.2.1一次性封口袋 4.2.2棉拭子 4.2.3 -次性PE手套
GB/T35942一2018 4.2.4压舌板或玻棒 4.2.5烧杯;100ml 4.2.6纱布 4.2.7漏斗 4.2.8铁架台 离心管1.5mL2.0mL.I5.0mL,.50.0mL. 4.2.9 4.2.10200LPCR管 4.3试剂 4.3.1磷酸盐缓冲液(PBS)(见附录A 4.3.25%重铬酸钾溶液(见附录A) 4.3.31×TAE(见附录A). 4.3.410mg/mL澳化乙锭(EB)或同类核酸染料 4.3.5土壤基因组DNA提取试剂盒;市售产品 4.3.6水;实验中配制溶液的用水应为燕水或去离子水;PCR用水符合GB/T6682中一级水的 规格 43.7DNA聚合酶:市售产品 4.3.82×PCRBuffer;市售产品 4.3.92.5mmol/IdNTPs(含MgCl:市售产品 4.3.1020mg/ml牛血清白蛋白(BSA). 4.3.11引物(上、下游外引物和内引物浓度分别配成100Am/mL,引物序列见附录B) 4.3.12100bpDNA分子质量标准 4.3.13琼脂糖(电泳级). 4.3.14质控标准卵囊;微小隐抱子虫(Crybtosporidiwmaruwmn)lowa株、贝氏隐抱子虫(C,baileyi、 泰泽隐袍子虫(C.tyz2eri)、安氏隐袍子虫(C.andersoni)或其他种类的隐抱子虫卵囊,浓度为每克粪便 10个卵囊 阴性质控对照为不含隐抱子虫卵囊的去离子水或其他适宜的溶液 5 废弃物处理和防止污染的措施 废弃物处理和检验过程中防止交叉污染的措施,按照wS/T2302002中第6章“污染的预防和控 制”的规定执行(见附录C). 样品的采集、保存和运输 o 6.1样品的采集 用棉拭子从禽类泄殖腔或直接从哺乳动物直肠采集粪便,或用一次性手套采集新鲜粪便约20g,装 人一次性封口袋 采样过程中应戴一次性手套,采样过程中样本间避免交叉污染 每份样品标记样品 编号、名称,动物来源、动物年龄,采样时间,采集单位或畜主姓名及地址 6.2样品的保存和运输 采集的样品在2C~8C条件下保存应不超过72h,长期保存需加人等体积5%重铬酸伊溶液,装 人灭菌容器内4保存 检出的阳性样品,发出报告后30d方可无害化处理 样品运送应放在一个不透水,防泄漏的容器内,保证完全密封 将上述容器置于结实,不透水和防
GB/35942一2018 泄漏的辅助包装中 冷冻剂放在辅助包装周围,使样品保持低温,确保样品在48h内送达实验室 所 有样品应附有一份说明,包括样品提交人、样品来源地、动物种类和年龄、与动物有关的病史、测试要求 以及联系方式等 样品的预处理 7.1穿上防护服,戴上一次性手套 将经高压灭菌或80C100烘烤20min的60目100目铜筛 网置于无菌漏斗中,放置在固定好的铁架台上,漏斗下端置于50mL离心管中 取10g待检样品(若是 成形的粪便应混匀;若粪便是液体,混匀后取10mL)放人烧杯中,加30mlPBS,玻棒或压舌板混匀后 经60目100目铜筛网过滤至离心管中 7.2滤液用移液器吸取1.5ml放人2ml离心管中,一20C保存,用于DNA提取 7.3剩余滤液1500！离心10 min ,弃上清 沉淀加人等体积5%重铬酸钾溶液,装人灭菌容器内4C 保存备用 8 操作程序 8.1DNA抽提 将保存于2ml离心管中的样品以1500离心5min后,弃上清,沉淀用于DNA的提取,按从粪 便、土壤中提取DNA的商品化试剂盒推荐的操作方法进行 8.2套式PCR检测 8.2.1 第一轮PCR扩增 按下列方法配制50ALP(CR扩增反应体系 2×PCRBuffer(含MgCL 25l dNTPMixture(2.5mmol/L) 6L BSA(20g/ml) 1.54L 4mol/L P1-l(100 1AL 1l. P1-2(100Mmol/L DNA聚合酶(1.0U/pL 1儿 AL. DNA模板 PCR用水 12.5AL 第一轮PCR扩增参数:94C预变性3min;94变性45s,55C退火45s,72C延伸1min,35个 循环;72C延伸7min 外引物为P1-1和P1-2见B.1) 阳性对照模板为10个4.3.l4中所列的隐抱 子虫卵囊或适宜的质控隐抱子虫卵囊加人10g不含隐袍子虫卵囊的同种动物新鲜粪便,按照8.1所列 方法提取的,浓度在10'拷贝/pL10拷贝/pL的隐袍子虫基因组DNA样品;阴性对照模板为10g 不含隐抱子虫卵囊的同种动物新鲜粪便按8.1所列方法提取的DNA 8.2.2 第二轮PCR扩增 按下列方法配置50ALPCR扩增反应体系: 2×PCRBulffer(含MgCl, 25L mmol/L dNTPMixture(2.5 6"l BSA(201 1.5 nmg/mL) kL
GB/T35942一2018 P2-l(100 pmol/L) l P2-2(1004mol儿 lAL DNA聚合酶(1.0U/aL l 第一轮PCR扩增产物 2 l PCR用水 12.5l 第二轮PCR扩增参数;94C预变性3min;94C变性45s,60C退火45s,72C延伸1min,35个 循环;72延伸7min 外引物为P2-1和P2-2(见B.2) 阳性对照模板为2L第一轮阳性对照扩增产 物;阴性对照模板为第一轮阴性对照PCR扩增产物 8.3琼脂糖凝胶电泳 用1×TAE缓冲溶液配制1.0%琼脂糖凝胶,取第二轮PCR产物5AL,在1.0%1.2%浓度的琼 脂糖凝胶中以1V/emm~10V/em凝胶的电压下进行电泳,每100ml凝胶中加人54LEB或同类核酸 染料,凝胶成像分析系统观察电泳结果并拍照 结果描述及判定 9 9.1质控标准 阳性对照出现一条大小约为830bp条带,阴性对照无条带时判定为试验有效 9.2结果判定 9.2.1阳性;被检样品泳道出现一条大小约为830bp条带时,判为阳性,必要时进行测序 9.2.2阴性;被检样品没有出现大小约为830bp的带，经重复2次套式PCR检测后仍未出现扩增条带 时,判为阴性 10 对于检测过程中出错或结果出现疑问的处理 对于检测过程中,由于错误操作造成样品处理不当或者DNA提取不当.以及结果出现疑问时,可 用保存于5%重铬酸钾中的样品,充分混匀后取1.5mL重新进行DNA提取和PCR扩增,以验证结果 的可靠性
GB/35942?2018 ? A 淶?? ? A.10.01mwl/Lp7.2λ?(PBs NaH,POH.O 0.39g NaHPO7H.o 1.93g NaCl 8.5g 800nml??,HC?pH?7.2,?1000mL,1.03410Pa ?20min,? A.25%?? ? 5.0g ?100mL1.03410Pa?20min,? A.350TAE? 242 Tris 2g 57.1 nL 100tmL EDTA(0.5mol/L,pH8.0 ??1000 mL,1.03410Pa?20min,????? 1TAE A.410 mg/mL?? ?? 1g ?100mL,С?,???,??,±档
GB/T35942一2018 录 附 B 规范性附录) 引物序列 B.1外引物 P1-1;5'-TTcTAGAGCTAATACATGcG-3' P1-2:5'-CccATTTcCTTcGAAACAGGA-3' B.2内引物 P2-1:5'-GGAAGGGTTGTATTTATAGATAAAG-3 P2-25'-CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA-3'
GB/35942一2018 录 附 C 规范性附录 检测过程中防止交叉污染的措施 制样过程 C.1 制样工具应清洗干净,1.034×10Pa高压下蒸汽灭菌20nmin,一套洁净工具限于一份样品使用 存放样品的容器应该经过清洗、高压,或为一次性灭菌容器 检测过程 C.2 C.2.1PCR实验室应分为样品制备区,前PCR区、PCR区和后PCR区 将模板提取,PCR反应液配 制、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行 实验室的运作应从“洁净区”到“污染 区”单向进行 C.2.2实验过程中,应穿戴实验服和手套,手套要经常更换 各区要有专用实验服，经常清洗 C.2.3各区所有的试剂、器材(尤其是移液器),仪器都应专用,不得带出该区 C.2.4所有溶液,水、耗材和器具要1.034×10Pa高压下蒸汽灭菌20min,避免核酸和/或核酸酶污 染 每种溶液应使用高质量的成分和新蒸僧的双蒸水 在20C~25C贮存的试剂中,可加人0.025% 的叠氮钠 所有试剂应该以大体积配制,然后分装成仅够一次使用的量进行贮存 C.2.5DNA模板或引物的离心管打开之前,要短暂离心,离心管不能用力崩开,以免产生气溶胶 C.2.6前PCR区中,应在PCR操作台中加人PCR反应各组分 C.2.7实验前后,实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA C.2.8可使用dUTP/UG法控制污染

隐孢子虫套式PCR检测方法GB/T35942-2018

一、什么是隐孢子虫？

隐孢子虫（Cryptosporidium）是一种寄生于人体和动物肠道的原生动物。它可以通过进食感染的污染水源、经过粪口途径的人群、家禽和畜牧业动物等途径传播。由于其小巧玲珑的形态，难以被肉眼观察到，因此成为公共卫生领域中备受关注的微生物之一。

二、PCR技术在隐孢子虫检测中的应用

PCR技术（聚合酶链反应技术）被广泛应用于病原菌的检测中，包括隐孢子虫的检测。PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高效性的优点，因此被认为是目前最为可靠的检测方法之一。

三、隐孢子虫套式PCR检测方法GB/T35942-2018

为了规范隐孢子虫的PCR检测方法，国家质量监督检验检疫总局和标准化管理委员会发布了《隐孢子虫DNA检测技术要求及检测方法》（GB/T35942-2018）。该标准规定了样品采集、DNA提取、PCR扩增、结果判定等各个环节的具体要求。

其中，隐孢子虫套式PCR检测方法是一种基于两步PCR反应的检测方法。它包括初步扩增和终末扩增两个步骤。在初步扩增过程中，采用通用引物扩增DNA片段；在终末扩增过程中，通过使用内部引物进行扩增，以提高特异性。该方法不仅适用于水样、食品样品等不同类型的样品，还具有高灵敏度、高特异性的优点。

四、结论

隐孢子虫套式PCR检测方法是一种简单、稳定、可重复性强而且具有高灵敏度和高特异性的检测方法。它在隐孢子虫的检测中发挥着重要作用，对于保障公共卫生安全有着重要意义。

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