GB/T35524-2017
化学品浮萍生长抑制试验
Chemicals—Lemnasp.growthinhibitiontest
- 中国标准分类号（CCS）A80
- 国际标准分类号（ICS）13.300;11.100
- 实施日期2018-07-01
- 文件格式PDF
- 文本页数18页
- 文件大小1.41M
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化学品浮萍生长抑制试验
国家标准 GB/T35524一2017 化学品浮萍生长抑制试验 Chemieals一Lemnasp.growthinhibitiontest 2017-12-29发布 2018-07-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35524一2017 化学品浮萍生长抑制试验 范围 本标准规定了化学品浮萍生长抑制试验的术语和定义、受试物所需信息、原理、参比物、仪器设备、 试验系统、试验程序,质量控制、数据与报告
本标准适用于测试化学品对淡水水生生物浮萍属(Lemna)的毒性
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
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GB/T21801化学品快速生物降解性呼吸计量法试验 GB/T21802化学品快速生物降解性改进的MITI试验I GB/T21803化学品快速生物降解性D0C消减试验 化学品快速生物降解性密闭瓶法试验 GB/T21831 化学品水溶解度试验 T GB 21845 化学品分配系数(正辛醉-水高效液相色谱法试验 GB 21852 21853化学品分配系数(正辛醇-水)摇瓶法试验 GB 化学品与pH有关的水解作用试验 GB 21855 21856 化学品快速生物降解性二氧化碳产生试验 GB GB/T21857化学品快生物降解性改进的oECD筛选试验 GB/T22052用液体蒸气压力计测定液体的蒸气压力和温度关系及初始分解温度的方法 GB/T22228工业用化学品固体及液体的蒸气压在10-'Pa至10'Pa范围内的测定静态法 GB/T22229工业用化学品固体及液体的蒸气压在10-Pa至1Pa范围内的测定蒸气压平 衡法 OECD化学品测试导则No.104燕气压(VapourPressure) 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件
3.1 生物量biomass 个种群中存在的活体材料的干重,本标准中表示浮萍数量的替代指标,如叶状体数或总叶面积等 代表性测量值
3.2 变色chlorosis 叶状体组织变黄
3.3 克隆 clone 生物体由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体
GB/T35524一2017 3.4 克隆体colony 相互连接的叶状体(2片4片)集合,有时也表述为“植株” 3.5 效应浓度efreetconeentration EC 在一定暴露期内,浮萍生长率或生长量受到抑制达到r%(如,50%)的受试物浓度
为明确标识来 自生长率或生长量的EC值,用“E,C"表示生长率,用“E,C"表示生长量,后面接测量变量,如E,c(叶状 体数) 3.6 流水式flow-through 试验期间,试验溶液持续更换
3.7 叶状体frond 浮萍的单个“叶状结构”,是具有繁殖能力的最小单位
3.8 突起gibb0sity 叶状体表观出现瘤状物和肿胀
3.9 生长growth 试验期间测量变量如,叶状体数、叶面积或干重、湿重)的增加 3.10 生长率growth rate 试验期间生物量的对数增长
3.11 最低可观察效应浓度lowestobservedleffteetconeentration;LoEC 试验期间,与对照组相比,观察到的生长效应差异具有统计学意义(力<0.05)的最低试验浓度
所 有高于LOEC的浓度组的毒性效应均需等于或高于LOEC观察到的效应
3.12 测量变量 meaSurementariablesS 采用一种或几种不同效应变化来表述试验终点的变量
注:此标准可采用的测量变量为叶状体数、总叶面积、湿重和干重 3.13 单一培养 m0n0culture 同一个植物物种的培养
3.14 坏死 necr0sis 叶状体组织死亡(如,发白或被水浸没)
3.15 moohserederfetcomentratiom;NoEc 无可观察效应浓度 仅低于最低可观察效应浓度的试验浓度
与对照组相比,观察到的生长效应差异无统计学意义 p>0.05).
GB/35524一2017 3.16 表型phenotype 由生物体的基因与环境相互作用后产生的可观察到的特征
3.17 variable 效应变量response 由测量变量推导的毒性评估变量 注;此标准采用的效应变量为生长率和生长量,可由叶状体数、叶面积,湿重或干重等测量变量推导而来
3.18 半静态试验semistatie(renewal)test 以定期更换试验溶液的方式进行试验
3.19 静态试验statietest 试验期间试验溶液不更换进行试验
3.20 试验终点testendpoint 根据试验目的因受试物导致的相对于对照改变的一般因素
本准则中指对生长的抑制情况,可由 基于一个或多个测量变量反应计算的不同效应变量来表达
3.21 试验介质testmedium 试验植物可在含有受试物的合成培养基中生长，一般受试物可溶解于该培养基中 3.22 生长量yielal 试验结束时的生物量减去试验开始时的生物量
受试物所需信息 受试物所需信息包括 水中溶解度(GB/T21845); a b) 燕气压(GB/T22052,GB/T22228,GB/T22229和OECD化学品测试导则NO.104) 结构式; c 纯度 d 在试验条件(水中,光照、温度等)条件下的稳定性; e 水解离常数(pKa)值(GB/T21855); 在试验介质中灵敏度足够高的定量分析方法 g 正辛醇-水的分配系数(P)(GB/T21852和GB/T21853); h 快速生物降解试验结果(GB/T21803GB/T21856,GB/T21802,GB/T21831,GB/T21857 和GB/T21801. 5 原理 在规定条件下,将处于指数生长期的浮萍暴露于不同浓度的受试物中,以7天为试验周期,通过测 定所选变量(如,叶状体数、总叶面积、干重或湿重),定量化评价受试物对浮萍生长产生的相关效应
基 本的测试变量是叶状体数,由于一些物质对其他变量的影响可能比叶状体数大,应同时从总叶面积、干
GB/T35524一2017 重或湿重中选择至少一个变量进行测定
为定量受试物相关效应,通过比较受试物组与对照组的特定 生长率或生长量,从而得到指定生长效应的抑制率为r%如,50%)时的受试物浓度,表示为EC,如 EC s0 试验终点指标为生长抑制,表示为试验期间测量变量(平均特定生长率)的对数增长
根据一系列 浓度的平均特定生长率,计算获得特定生长抑制百分率r%如,50%)并表示为E,C,如,E,Cm)
额外的效应变量是生长量,定义为试验结束时的量减去试验开始时的量
根据一系列浓度中的生 长量,计算获得生长量抑制百分率.工%(如,50%)并表示为E,C,如,E,C). 此外,可通过适当的统计方法,得到LOEC和NOEC
6 参比物 通常使用3,5-二氧苯酚作为参比物
定期测试参比物对浮萍生长的影响,每年至少2次;若试验频 率很低,则可在化学品测试时同时进行
采用青萍(Lemnamior)进行参比试验Steinberg培养基,参 见表B.1l),7天E,C叶状体数)值应在2.2mg/L3.8mg/L之间
测试金属化合物时,应采用氯化 钾作为参比物(Steinberg培养基和APHA培养基,参见表B.1和表B.4),7天E,C(叶状体数)值应在 5.5g/儿L10g/儿L之间
如使用稀脉浮萍(Lena.aeuimoetialis)进行参比物试验时,应建立实验室内 部质量控制范围
仪器设备 仪器设备包括 试验容器:;由玻璃和其他化学惰性材料制成
根据需要选择一定容积的试验容器,为避免叶状 a 体重叠生长,试验容器口径应足够宽
推荐每个容器高度不低于20mm,体积不小于100mL
可使用玻璃烧杯、结晶皿或玻璃培养皿
为减少溶液挥发以及避免污染,试验容器应有容器 盖,并容许必要的空气交换; b 照度计;球面照度计或普通照度计(精确至1lx); 培养设备;人工气候箱或光照培养箱
建议使用温度范围为24C土2C且连续光照,光谱范 c 1700 围为400nm nm,光照强度在6500lx~10000lx范围内; d 测定总叶面积的设备(如,体视镜等); pH计精确至pH0.01; e fD 分析天平(精确至0.0001g): 适用于流水式的连续分配和稀释系统(如,计量泵、稀释仪等
8 8 试验系统 8.1试验生物 8.1.1试验物种 本标准推荐试验生物为青萍(Le )和稀脉浮萍(Le -emaaeguinoctialis)
物种特征参见 e1na1i7nor 附录A
8.1.2试验生物的获得 试验植株可以从物种保存单位、其他实验室或野外采集获得,且应在报告中说明其品系和/或来源
GB/35524一2017 如从野外采集,采集地应无明显污染,试验开始前植株应至少在试验用培养基中培养8周
如从其他实 验室或物种保存单位获得,原植株应至少在相同条件下培养3周
为免受诸如绿藻和原生动物等其他生物的污染,应进行单一培养
健康的L. 植株由2片 mio 5片叶组成的无性繁殖群构成
8.1.3试验生物的选择 试验植株的质量和均一性对试验结果有重要影响
应选择新鲜,快迷生长、无可见损伤或变色的植 株进行试验
出现大量的、至少有两片叶状体的植株表明培养基质量良好,而大量单叶植株的出现表明 试验生物处于环境胁迫状态(如营养匮乏),此类植株不能用于试验
8.2浮萍培养基 青萍和稀脉浮萍均可使用改进的Steinberg培养基
青萍还可使用改进的SIS(wedishStandard 培养基(参见表B.3)
在测试金属化合物时,应采用改进的APHA培养基(参见表B.4)作为试验用培 养基,并以青萍作为试验生物
相关培养基的成分和配制方法参见附录B
8.3浮萍的储备培养 8.3.1储备培养可通过降低光照和温度(410)来减少培养和维持的频率
浮萍的生长培养基 与试验培养基相同,而储备培养可用其他营养更丰富的培养基
使用无菌操作,定期将新鲜,淡绿色植 使用化学法 株移人装有新培养基容器中
在推荐的低温条件下,两次转接的时间最长可间隔3个月
清洗(酸洗)后灭菌的玻璃培养容器,无菌操作
当储备培养中出现污染,例如真菌或绿藻,应采取措施 清除污染生物
可通过表面灭菌清除绿藻和其他大多数污染生物;取出被污染的植株,剪掉根部;放人 清水中剧烈震荡30、后,浸人0.5%<体积分数)次氯酸钠液中5nmin;用无菌水浸洗处理后的植株,转人 新的培养基中
这种处理将导致大量叶状体死亡,但存活的植株通常无污染,可以用于新的接种培养
8.3.2至少在试验开始前7天,选择足量的克隆体转人新鲜无菌培养基中,并在试验条件下培养7天 10天
8.4试验溶液 8.4.1通常将受试物直接溶解于培养基中配制试验母液,稀释母液配制成不同浓度的试验溶液 8.4.2在试验条件下,受试物的最高试验浓度不应超过其水溶解度
浮萍漂浮在液面上,因此可能会 暴露于在水-气界面上聚集的受试物(如,难溶于水或疏水物质,表面活性剂)
在这种情况下,暴露将不 仅来自于试验溶液还来自于聚集的受试物,此时暴露浓度将高于受试物的水溶解度
8.4.3对于低水溶性受试物,为了将其精确添加到培养基中并促进其分散和溶解,可能有必要制备浓 缩母液或使用有机溶剂和分散剂将受试物分散
应尽量避免使用此类物质,且所用的助溶剂或分散剂 应对植物无毒性如,丙酮或二甲基酰胺)
所有受试物组和对照组均应使用相同浓度(不得超过 00L/L的溶剂或分散剂,且在报告中说明所用浓度
8.4.4当需要控制试验溶液的pH值时(如受试物为金属或易水解物质),推荐在生长培养基中加人缓 冲液
当pH缓冲液可能与受试物反应,并影响其毒性时,应谨慎考虑
9 试验程序 g.1暴露条件 应在符合下列暴露条件的环境中进行试验 持续时间:7天
a
GB/T35524一2017 b 接种量;随机选择含有2片一4片可见叶状体的克隆体从储备培养皿转接人试验容器中,每个 试验容器中应包含9片12片叶状体,且各试验容器中的叶状体数和克隆体数应相同
试验容器分配:为减少不同空间位置的光照和温度差异产生的影响,应在培养箱中随机摆放试 验容器
可在每次观察后随机分布试验容器
d 光照;连续光照
光谱范围为400nm700nm 时,光照强度应在6500lx10000lx范围 内
整个试验区域选择的光强差异不应超过士15%
测定光的方法,尤其是传感器的类型,会 影响测定值
球形传感器(从测定平面上面和下面的各个角度感应光)和余弦传感器(从测定 平面的上面的各个角度感应光)优于单向传感器,因为多点光源能够给出较高的读数
e 温度;24C士2C
pH:试验期间,对照组pH值的升高应小于1.5
如果pH值偏离超过1.5,但仍然满足试验有 效性时,不能判定试验无效
如受试物为不稳定物质或金属时,应格外注意pH值的波动
试验方式.在试验之前,应根据受试物在水中的化学稳定性确定合适的试验方式,从而选定所 需的试验容器和装置
如前期稳定性试验表明受试物浓度在试验期间无法维持稳定(即实测 浓度低于初始实测浓度的80%)推荐采用半静态试验
试验期间受试物组和对照组试验浴 液应至少更换2次(如,第3天和第5天)
更新溶液的频率应取决于受试物的稳定性;极不稳 定或挥发性物质则应增加更新频率,尽可能维持浓度稳定
有些情况下,需采用流水式试验
9.2试验设计 试验的浓度设计应考虑下列要素
进行预试验用以确定正式试验所需浓度范围
正式试验至少应按几何级数设置5个浓度组 a 浓度间隔系数应不超过3.2
但如浓度-效应曲线比较平坦,可用较大间隔系数
当浓度设置 少于5个时,应给出理由
每个试验组至少设置3个平行
如预试验结果表明受试物在100mg/1或试验条件下最大溶解度时无毒性效应,可直接进行 b 限度试验
限度试验包括1个对照组和！个受试物组(100mg/L或最大溶解度),各试验组平 行数翻倍
应对暴露浓度进行化学分析
采用合适的统计方法比较对照组与受试物组的 差异
对照;对照组(包括溶剂对照)平行数应至少与受试物组相等,最好为受试物组平行数的两倍
如使用助溶剂或分散剂该溶剂对照组的浓度应与受试物组使用的浓度相同
如试验目的为计算C.,试验浓度应涵盖EC，值以保证适当的置信水平
例如,如估算ECn 最高浓度应大于C值
如试验目的为评价LOEc/NOEC,最低试验浓度应足够低(与对照组相比生长差异无统计学 意义)
同时,最高试验浓度应足够高(与对照组相比生长差异有统计学意义),除非最高试验 浓度为100mg/或受试物在试验条件下最大溶解度
fD 如不要求获得NOEC,试验设计可增加浓度组数量,减少各浓度组的平行数
但对照组平行应 至少为3个
9.3测定与分析 试验期间,各参数测定与分析的频率要求如下 a 静态试验中,在试验开始和试验结束时测定所有试验组的pH值
半静态试验中,在每次更换 溶液时测定新旧溶液的pH值
b 测定生长室、培养箱或培养房间的光照强度时,测定点与光源的距离应该与叶状体与光源的距 离相等,即测定点与叶状体处于同一水平
试验期间至少测定1次
至少每天记录1次未接 种浮萍的容器中培养基的温度
GB/35524一2017 试验期间应定期测定受试物的浓度
静态试验至少在试验开始和结束时测定浓度
c 半静态试验中,如受试物的初始实测浓度无法维持在配制浓度的土20%范围内,应在每次更新 d 时分析新旧溶液中受试物的浓度
但如有证据证明初始浓度可重复并且稳定即维持在初始 实测浓度的80%120%范围内),可只对最高浓度和最低浓度进行化学分析
所有情况下 旧溶液中只需测定各试验组其中1个平行的试验溶液(或各平行的混合液)
流水式试验中,取样方式与半静态试验相似
包括试验开始、期间和试验结束时取样测定
应 每天检查稀释水和受试物或受试物母液的流速
如果整个试验期间受试物浓度一直维持在配制浓度或初始实测浓度的士20%范围内,可采用 配制浓度或初始实测浓度分析结果
如果变化超过配制浓度或初始实测浓度的士20%,应采 用试验期间实测浓度的几何平均值分析结果
g.4观察 9.4.1叶状体 试验开始时,记录各试验容器内的叶状体数量,确保突起和明显可见的叶状体均已计数
在试验开 始、结束及试验期间至少每3天一次即7天试验期间至少2次)对试验容器中正常及异常的浮萍叶状 体数进行测定
并记录植株生长的改变,如叶状体大小,外观、坏死,变色或肿胀、繁殖群落解体或丧失 浮力,以及根长和形态
试验培养基的显著特征(如,不溶物的存在、藻类的生长)也应记录
9.4.2其他测量变量 除了叶状体数的测定,还需要评价受试物对下列一个或多个测量变量的影响:总叶面积、干重、湿 重
总叶面积的优点是可在试验开始、期间及结束时进行测量
干重或湿重可在试验开始时测量具有 代表性的接种样本,然后在试验结束对各试验组的植株进行测量
优先测定总叶面积,其次是干重,最 后是湿重
总叶面积:总叶面积可通过图像分析进行测量
用照相机将试验容器和植株的轮廓拍下(如， 将容器放人灯箱中),并将影像数字化
通过与已知面积的平面形状校准,总叶面积即可被测 量
应排除试验容器边缘造成的干扰
另一个可选的较繁琐的方法是将试验容器和植株影印 下来,剪下叶状体轮廓,用叶面积分析仪或坐标纸测量面积
其他技术(如,叶状体轮廓的剪纸 面积与单位面积的重量比)也适用 b 干重:每个试验容器中的所有浮萍群落(包括根的碎片)收集起来后用蒸溜水或去离子水漂洗
吸干多余水后在60C烘干至恒重
精度应至少达到0.1mg 湿重:将所有浮萍群落转移到预先称重的聚苯乙烯(或其他惰性材料)圆底管,管底有小孔 1mm)
然后在室温下3000r/min离心10min
再对离心后装有植株的圆底管进行称重 减去空管的重量即为湿重
10质量控制 对照组叶状体数量的倍增时间应在2.5天(60h)内,相当于7天内大约增加7倍,即平均特定生长 率为0.275d" 11 数据与报告 11.1数据处理 11.1.1倍增时间 计算对照组叶状体数的倍增时间T),见式(1):
GB/T35524一2017 Ta=In2/" 式中 -对照组平均特定生长率
11.1.2平均特定生长率 此变量的计算基于对照组和受试物组叶状体数及其他测量变量总叶面积、干重或湿重)在指定时 间段的对数增长
应计算各受试物组和对照组在整个试验周期的平均特定生长率,包括平均值和变异 系数
此外,可通过各时间段生长率来评价受试物在整个暴露周期中产生的效应(如,对数转化后的生 长曲线)
各时间段生长率和平均特定生长率之间的差异可说明偏离指数生长,此时应密切检查生长曲 线
上述情况,可采用在同一时间段,比较抑制率最高的受试物组与对照组的特定生长率
平均特定生 长率见式(2): ln(N,)-ln(N, 一 式中 -从i时点到时点的平均特定生长率; 一 时点的生物量; N 时点的生物量; N -从i到的时间间隔
需要计算所有受试物组和对照组各平行的平均特定生长率的平均值及变异系数
11.1.3平均特定生长率抑制百分率(1, 见式(3). 4一" ×100% I，= 式中 平均特定生长率抑制率; 对照组"的平均值; 从 受试物组的平均值
T 11.1.4生长量及其抑制百分率(I, 生长量为叶状体数及其他变量总叶面积、干重或湿重)在试验结束时与试验开始时的差值
对干 重或湿重而言,起始生物量通过测定与试验接种相同批次的植株来实现
各组的生长量抑制百分率 I,)计算见式(4): b
一b) ×100% b 式中: 生长量抑制百分率; -对照组试验结束时生物量与初始生物量之差; b
b -受试物组试验结束时生物量与初始生物量之差
11.2浓度-效应曲线绘制 以受试物浓度的对数值为横坐标,相应变量的平均抑制率(1，或1,)为纵坐标,作回归曲线,即为浓 度-效应曲线
GB/35524一2017 11.3EC
估算 由于受试物对叶状体数和其他测量变量的影响不同,应同时估算平均特定生长率(E,C,)和生长量 E,C,)的C，值(如,ECa),其中每个EC，值应包含基于叶状体数和另一个变量总叶面积、干重或湿 重)计算的值
因此,某个抑制水平的毒性参数应包括四个EC值;E,C,(叶状体数)、E,C,总叶面 积、干重或湿重)、E.,c.叶状体数)和E.,c,(总叶面积、干重或湿重
11.4统计程序 试验数据可采用以下几种方法统计分析: 通过回归分析得到量化的浓度-效应关系
对线性转化后的数据进行加权线性回归如,probit 法或logit法或weibul法),但非线性回归更佳,能更好处理不规则数据和偏离平滑分布的数 据
接近零或100%抑制的不规则数据可能通过转化被放大,从而干扰分析
需要注意的是， 采用probit,logit或weibul转化的标准分析方法原本用于计数资料(如死亡率或存活率),应 通过调整才对生长率或生长量数据适用
b 对每个效应变量,用浓度-效应关系获取EC，值及其95%置信限(如可能)的点估计值
应通 过绘图或用统计学方法对数据回归模型的拟合优度进行评估
回归分析不能使用各受试物组 的组平均值,而应使用单个平行的效应值
如果现有的回归模型/方法不适合这些数据,EC值和置信限也可由线性内插法获取
可通过方差分析(ANOVA)进行平均值的比较,得到LOEC及NOEC
各受试物组与对照组 的均值比较应采用合适的多重比较法或趋势检验,建议用Dunnett's或wiliam'、检验法
还应进行方差齐性的检验,可采用作图法或正式的检验如,l.evene's或Bartlett's检验法. 如方差不齐,可对数据进行对数转化修正
如果方差极为不齐且无法转化修正,可考虑采用 stepdownJonkheere趋势检验
由回归法点估计得到的EC，值优于NOEC
对于浮萍试验,还没有确定适合的r值
然而 0%20%范围比较合适(根据效应变量的不同,最好EC和EC都能报告
11.5试验报告 11.5.1受试物 受试物信息应包含以下内容 物理性质及相关理化特性、包括水溶解度; a b)化学识别数据如,CAs号),包括纯度(杂质)
11.5.2 试验生物 学名,克隆如可知)和来源
11.5.3试验条件 试验条件信息应包含以下内容 a 试验方式;静态,半静态或流水; b 试验开始日期和试验周期; 试验培养基; c d 试验设计:试验容器和盖子、试验溶液体积、试验开始时各试验容器的克隆体数和叶状体数 试验浓度设置:配制浓度或实测浓度、每个浓度所设平行数
GB/T35524一2017 母液和试验溶液的制备方法,包括任何助溶剂或分散剂的使用; f 试验期间的温度; 8 h)光源,光强及其均一性; 试验溶液的pH值; j 受试物浓度及其定量分析方法(方法验证、标准差或置信限); k 叶状体数和其他测量变量(如,干重、湿重或总叶面积)的测定方法 D 所有对本标准的偏离
11.5.4试验结果 试验结果应包含以下内容 原始数据;每次观察和分析时各受试物组和对照组叶状体数和其他测量变量的数值 a b 各测量变量的平均值和标准差; 各试验组的生长曲线(推荐进行测量值的对数转化); c d 对照组叶状体数倍增时间/生长率; 各受试物组平行间的效应变量,平均值和平行间的变异系数; 浓度-效应曲线 估计效应变量的毒性终点(如,C、EC、EC及相应的置信限);如计算,列出LOEC和/或 g NOEcC及其统计方法; 如使用ANOvA,检出效应的大小(如最小显著性差异); h 各受试物组的生长刺激现象 i) )任何植物毒性效应及试验溶液的可观察现象
1.5.5结果讨论 描述试验过程中的所有偏离,并对偏离是否影响试验结果进行讨论
0
GB/35524一2017 附 录 A 资料性附录 本标准推荐的物种 我国目前已发现的浮萍属中包括青萍(Lemnaminor)、稀脉浮萍(Lemnaaequinoctialis)和三叉浮 萍(Lemnatrisulca)3个种
青萍是OECD和美国环境保护署推荐的试验物种,稀脉浮萍在我国分布广 泛，,经验证同样适用于本标准
两种浮萍的生物学表型和分布特征如下: 青萍为漂浮的绿色、卵状、扁平叶状体,长1.5mm一3mm,全缘,具3脉,1个4个聚在一起,叶状 体基部无柄，上表面沿中脉明显具乳头状凸起;根长0.5cm一3.5em，基部具根鞘但无翅,根冠先端圆
通常生于静水水面,如湖边,池塘,沟渠,水稻田等处,或水流缓慢的溪流中,喜温带海洋性气候
从海平 面到28o0m海拔均有
世界大部分地区有分布 稀脉浮萍为漂浮的绿色、卵状、扁平叶状体,长1.5mm一3mm,全缘,具3脉,1个4个聚在一起 叶状体基部无柄,上表面先端及节部明显具乳头状凸起;根长0.5cm一3cm，基部具翅状根鞘,根冠先 端尖
通常生于静水水面,如池塘、沟渠、水稻田等处,喜温暖气候
从海平面到2800m海拔均有分 布
世界广布,在我国有记录分布于安徽,福建、广东、贵州,河北、河南、湖北、江苏、江西,辽宁、青海 上海、陕西、,山东、山西、台湾、云南,浙江
11
GB/T35524一2017 附录 B 资料性附录) 本标准推荐的浮萍培养基 B.1Steinberg培养基(Iso20079) B.1.1Steinber培养基的制备 Steinberg培养基各组分浓度及制备方法如下 改进的Steinberg培养基在1sO20079中仅用于青萍,但对稀脉浮萍也能达到很好的培养 a 效果
应使用分析纯试剂和去离子水制备培养基
b 由贮备液或培养基最大浓度没有沉淀析出的10倍浓缩培养基制备生长培养基
表B.1稳定pH的steinberg培养基(根据Altenburge改进)中各成分的浓度 浓度 常量成分 mmol/ mg/1 350.00 3.46 KNO Ca(NO.4H.o 295.,00 1.25 KHPO 90,00 0.66 KHPO 12.60 0.072 MgSO
7H.O 100,00 0.41 浓度 微量成分 4mol/L 4g/ H,BO. 120.00 1.94 ZnSO7H,O 180.00 0.63 NagMo(O2H.O 44.00 0.l8 MnC4H.O 180,00 0.91 2.81 FeCl6H.O 760.00 EDTADisodiumdihydrate 1500,00 4.03 B.1.2改进的steinberg培养基的终浓度培养基的制备 改进的Steinberg培养基的制备 贮备液1,2和3各20ml(见表B.2)加人900ml去离子水以防产生沉淀
a b 加贮备液4、5、6、7和8各1.0mL(见表B.2 调pH值至5.5士0.2(加最小量的Na(OH或HCl调节)
c d 加水至1000mL 12
GB/35524一2017 如果贮备液是无菌的,加人适当的水则不需再灭菌
如果最终培养基已灭菌,贮备液8应在高 压灭菌(121'C20nmin)后加人
B.1.3用于中间储存的10倍浓度改进的Steinberg培养基制备 0倍浓度改进的Steinberg培养基的制备 贮备液1、,2和3各20ml(见表B.2)加人30mL去离子水以防产生沉淀 加贮备液4、5,6、7和8各1.0nmL见表B.2)
b 加水至100ml
c d 如果贮备液是无菌的,加人适当的水则不需再灭菌
如果最终培养基已灭菌,贮备液8应在高 压灭菌(121"c20min)后加人
培养基pH值(最终浓度)应为5.5士0.2
表B.2贮备液各组分浓度 常量成分(50倍浓度 浓度/(g/L 贮备液1 KNO 17.50 KHPO 4.5 K.HPO 0.63 贮备液2;MgSo
7H.o 5.00 贮备液3;Ca(NO.)4H.O 14.75 微量成分(1000倍浓度 浓度/mg/1) 贮备液4:H,BO 120.0 贮备液5;Znso7Ho 180.0 贮备液6:NaMoO2H.o 44.0 贮备液7;MnCl4H.O 180.0 贮备液8: FeCl6H.O 760.00 EDTADisodiumdihydrate 1500.00 注1:贮备液2,3直接添加,贮备液4一7根据浓度需要分别添加混合
注2;为达到更长保存期,贮备液在121C20min条件下高压灭菌或过无菌滤膜(0.2m),建议贮备液8过无菌 滤膜(0.2um)
B.2swedishStandard(SIS)浮萍生长培养基 SIS浮萍生长培养基贮备液的制备 贮备液1一5在12115min条件下高压灭菌或过无菌滤膜(0.2m. a b)贮备液6(贮备液7可选)只能过无菌滤膜(0.2m) 13
GB/T35524一2017 灭菌后的贮备液应保存在阴凉避光条件下
贮备液15有效期为6个月,贮备液6(贮备液" 可选)有效期为1个月
SIS浮萍生长培养基终浓度的制备 配制1LSIS培养基,先加人900mL去离子水
a 加人10mL贮备液1
b 各加人5mlL贮备液2、贮备液3和贮备液4
加人1mL贮备液5
d 加人5ml贮备液6
fD 加人1ml贮备液7(可选),对于某些受试物可能需要添加贮备液7(MOPSbuffer) 调pH值至6.5士0.2(加0.1mol/L或1mol/L的NaOH或HCI)后添加去离子水至1L 日 表B.3SwedlishsStandard(sIs)浮萍生长培养基各组分浓度 贮备液 营养盐 贮备液浓度/g/L 培养基浓度/mg/L NaNO. 8.50 85 1.34 13. KHP(O 15 75 Mgso7H.O CaCl2H.o 7.2 36 Na,CO. 4.0 20 HBO 1.0 1.00 MnC4H.O 0.20 0.20 NagMo(O2H.O 0.010 0.010 ZnSO7H.O 0.050 0.050 CuSO
5H.O 0,0050 0.0050 0.01o Co(No);6H.o 0.0l0 FeC6H.O 0.17 0.84 Nag-DTA2H.O 0.28 l.4 MOPS(buffer) 490 490 B.3改进的APHHA培养基 在测试金属化合物时,应采用APHA培养基作为试验用培养基,但应用Steinberg培养基进行浮萍 预培养
试验前先将浮萍在APHA培养基中驯养16h一24h,时间不宜过长,否则对浮萍生长产生负 面影响
14
GB/35524一2017 表B.4改进的APHA培养基各组分浓度 财备液 成分 备液浓度/g/I 培养基浓度/mg/L NaNO. 25.5 255 KC 1.01 10.1 NaHco. 15.0 150 KHPO 1.04 10.4 CaClg2H,(O 4.41 44.1 MnC4H.O 0.4149 4.l49 MgCl
6H.O 12.17 121.7 FeCl6H.O 0.16 1,6 14,7 147 Mgso7H.o HBO. 0.186 1.86 NaMoO2H.O 0,00726 0.0726 ZnC 0.00327 0.0327 CuC 9.0×10 9.0×10" 0.0078 CoC 0,00078 为防止沉淀,将贮备液2酸化至pH2.0,并避光保存
分别将贮备液1、2,3各10mL加人970mL去离子水中,即可得到1L培养基,充分曝气至少 h~2h
如要制备更大体积的培养基(>4L),则要曝气过夜,以稳定pHH值
测试前用最少量的 NaOH或HCl溶液将培养基pH值调至8.3土0.1,无需灭菌
GB/T35524一2017 参 考 文 献 GrowthInhibitionTest.Par" [1]OECDGidelines forthetestingf chemieals，221Lemnasp. is:OECD，Adopted23March2006. [2]《化学品测试方法》编委会《化学品测试方法-生物系统效应卷》221浮萍生长抑制试验,2013 [3]IsO20079:2005waterqualityDeterminationofthetoxiceffectofwaterconstituents andwastewateronduckweedLemmino wthinhibitiontest Duckweedgro U.S.EnvironmentalProtectionAgencyEcologicalEffectsTestGuidelines，OCSPP850. 4400AquaticPlantToxicityTestUsin Tiers &I.EPA712-C-008.OfficeofChem ingLensPp." icalSafetyandPollutionPrevention，2012. 5 [51 M.Pattard， Rombke，andTMoserChapter RangeofReferenceTestsinAquatic Tests，In:H.MoserandJ.RombkeEds,)，EcotoxicologicalCharacterizationofWaste:Resultsand ExperiencesofanInternationalRingTest.Springer，NewYork，2009， .pp.61-70. [C6OECDSeriesonTestingandAssessmentNumber23.GuidanceDocumentonAquaticTox icityTestingofDifficultSubstancesandMixtures，Paris:O)ECD，2000.
化学品浮萍生长抑制试验GB/T35524-2017
一、引言
浮萍是一种常见的水生植物，它们在自然环境中起到了很重要的作用。但是，在某些情况下，浮萍的过度生长会对水体造成不利影响。为了控制浮萍的生长，人们尝试使用化学品进行处理。
二、化学品在浮萍生长抑制中的应用
化学品可以通过干扰浮萍的代谢过程来达到生长抑制的目的。例如，可以使用除草剂等化学品来杀死浮萍。此外，一些特定的化学品也可以抑制浮萍的生长而不会对其造成直接的伤害。
三、试验规范
为了确保化学品在浮萍生长抑制方面的安全性和有效性，国家制定了相关的试验规范。其中，GB/T35524-2017为化学品浮萍生长抑制试验规范。
该规范主要包括以下内容：
- 试验前的准备工作
- 试验方法和步骤
- 试验数据处理和分析
- 报告编写要求等
通过遵循这些规范，可以确保试验过程的科学性和可靠性。
四、结论
化学品在浮萍生长抑制方面有着广泛的应用前景。但是，在使用化学品进行处理时，一定要遵循相关的规范，以保证其安全性和有效性。
