化学品线蚓繁殖试验

化学品线蚓繁殖试验

国家标准 GB/T35514一2017 化学品线蚓繁殖试验 Chemieals一Enehytraeidreproduetiontest 2017-12-29发布 2018-07-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35514一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准与经济合作与发展组织(OECD)化学品测试导则No.220(2004年)《线蚓繁殖试验>(英文 版)技术性内容一致 本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口 本标准起草单位;广东省微生物研究所、环境保护部固体废物与化学品管理技术中心、沈阳化工研 究院、检验检疫科学研究院、广东中科英海科技有限公司 本标准主要起草人;梅承芳、柳燕贞、曾国驱、刘纯新、林健辉、陈会明、郭琳琳、张静、张宝兰、 李雪君
GB/35514一2017 化学品线蚓繁殖试验 范围 本标准规定了化学品线蚓繁殖试验的术语和定义,受试物所需信息,原理、参比物、仪器设备、试验 系统、试验程序、试验有效性、数据处理与结果报告 本标准适用于评价受试物对土壤中线蚓繁殖量的影响 本标准不适用于挥发性物质,如享利常数或气/水分配系数大于1、或蒸气压超过0.0133Pa 25C)的物质 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T21809化学品蚯蚓急性毒性试验 GB/T21851化学品批平衡法检测吸附/解吸附试验 GB/T27860化学品高效液相色谱法估算土壤和污泥的吸附系数 so11268-2;2012土壤质量污染物对蚯蚓的影响对赤子爱胜蚓/安德爱胜蚓繁殖影响的测 定SoilqualityEffeetsofpolutantsonearthworms一Determinationofeffeetsonreproduetionof Eiseniafetida/Eiseniaandrei 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 产生x%效应的浓度efeetconeentrationforx"%effeet ECc 与对照组相比,在给定的暴露时间内对受试生物产生r%效应的受试物浓度 以每单位试验土壤 干重所含的受试物量表示 3.2 非致死浓度nolethalconcentration LC 在给定的时间内不会造成任何受试生物死亡的最高受试物浓度 以每单位试验土壤干重所含的受 试物量表示 3.3 半数致死浓度medianlethalcomeentration" LCO 在给定的时间内造成50%受试生物死亡的受试物浓度 以每单位试验土壤干重所含的受试物量 表示
GB/T35514一2017 3.4 全部致死浓度totally lethalconcentrati0n LC Coo 在给定的时间内造成100%受试生物死亡的最低受试物浓度 以每单位试验土壤干重所含的受试 物量表示 3.5 LOEC 最低可观察效应浓度 aelret lowestobserved concentration;l 能对受试生物产生统计学意义上的显著效应p<0.05)的最低受试物浓度 以每单位试验土壤干 重所含的受试物量表示 通常所有高于l.OEC的试验浓度都应产生与对照组相比具有统计学意义差 异的毒性效应 确定LOEC时,与上述要求偏离的任何情况都应在报告中进行解释说明 3.6 n0observedeffectconcentration;NOEC 无可观察效应浓度 直接低于L.OEC,且未观察到任何毒性效应的最高受试物浓度 与对照组相比,NOEC对应的受 试物浓度在给定的暴露时间内对受试生物不产生统计学意义上的显著效应力<0.05). 3.7 繁殖率reprduetiorate 在试验期间内每条成蚓所产幼虫的平均数 受试物所需信息 受试物所需信息包括: a 水中溶解度; b)lgK.(土壤水分配系数),试验方法按GB/T21851,GB/T27860; 燕气压; c d 挥发性 在土壤中的其他环境行为,如光解和水解速率等 e 原理 S 将成蚓暴露于混合有不同浓度受试物的人工土壤中,试验可分为两步;当缺乏充分的信息时应首先 开展预试验,暴露两周以致死率作为主要的评价终点 在正式的繁殖试验中,应同时评估亲本繁殖的幼 体量和存活亲本的数量 正式试验的时间为6周 试验开始3周后,应移去成蚓并记录其形态上的变 化 6周后,计算成蚓产茧后孵化得到的子代数量 通过比较含受试物的试验组与空白对照组中线蚓 的繁殖量,确定NOEC和/或EC,如EC、ECm);即采用回归模型估算导致繁殖率下降r%时的受试 物浓度 应使得EC.如EC、EC)包括在试验浓度范围内,以便通过内插法而非外推法得出EC 6 参比物 可定期开展参比物试验,也可在每批试验中同时开展以验证不同时期试验生物的反应未发生显著 、 变化 苯咪氨甲酯可作为参比物,已知该物质可对线蚓的存活和繁殖产生影响 已充分获知毒性数 据的其他化学品也可用作参比物 苯咪氨甲酯制剂,活性成分含量为360g/L(32.18%),已通过比对试验得到验证E门 比对试验中 来咪复甲酣对线蚓繁殖的EC%为12ms士0&mg话性成分ke干重四 若试验组别中包插了阳性参
GB/35514一2017 比物,可采用一个浓度进行试验且该浓度组的平行数应与空白对照组一致 对于苯咪氨甲酯,试验浓度 宜为1.2mg活性成分/kg干重(受试物为液态制剂 仪器设备 试验容器由玻璃或其他化学惰性材料制成,如体积为200ml250mL,直径~6cm的玻璃瓶 试 验容器应带有透明的瓶盖(如玻璃或聚乙烯盖),以便光线透过 瓶盖在减少水分蒸发的同时可允许土 壤和空气之间存在气体交换 除了常规设备外还应包括的仪器设备 干燥箱; aa b 体视显微镜; c pH计和光度计; d 精密天平 控温装置 e fD 控湿装置(若暴露容器有盖子则不必); 培养箱或者装有空调的小房间 8 h 慑子,弯钩、小环; 光照池 试验系统 8.1人工土壤的制备 8.1.1 人工土壤的配方 本试验所需的人工土壤配方如下所示,配制方法按GB/T21809,IsO11268-2(基于干重,l05C烘 干至恒重): 0%的泥炭土,风干后磨碎至所需粒径(粒径范围=2mm n士1 );试验前,宜检查新配制的 a mm 泥炭土是否适用于线蚓的培养; b)20%的高岭土(其中高岭石的含量宜在30%以上); 约0.3%1.0%的碳酸钙(CaCO粉末,分析纯),用来调节初始pH至6.0士0.5,人工土壤中 碳酸钙的添加量主要依据泥炭土的质地/性质而定; d 约70%风干的石英砂(根据CaCO的添加量而定),粒径在501 m一200Mm范围内的石英砂 的含量应大于50% 8.1.2人工土壤的适用性及制备方法 在使用所配制的人工土壤进行正式试验之前,应确定其适合用于线蚓的培养,并且确保能够达到试 验有效性的标准 宜在试验前开展以下方式的检查以确保试验不会因为人工土壤中有机碳含量的降低 而受到影响,例如,将泥炭土的含量降至4%5%,并相应地增加石英砂的含量 若采用该方式降低有 机碳含量,则可能使土壤(有机碳)对受试物的吸附性下降从而导致线蚓对该受试物的可利用性增大 经证实,当采用有机碳含量如2.7%)低于上述标准的田间土壤开展试验时,能够满足试验有效性中 关于白线蚓繁殖量的要求 采用泥炭土含量为5%的人工土壤也可满足上述要求 若使用天然土壤进行其他试验(如高级试验),该土壤的适用性以及试验结果的有效性仍然需要 确认
GB/T35514一2017 组成人工土壤的各干燥组分应至少在试验开始前一周充分混合(如采用实验室用的大型搅拌器) 混匀的土壤应存放至少2d以确保土壤的酸度达到平衡 测定pH时,将土壤与1mol/L KCl或 nmol/L.Cacl 按照15的比例混合(参见附录A 若试验土壤偏酸并超出了规定的酸碱范围 0.01 可通过添加适量CaCO进行调整;若试验土壤偏碱,则可通过添加除CaCO之外的其他组分进行 调整 参照附录B测定人工土壤的最大持水量 在试验开始前1d2d,对干燥的土壤进行预湿润处理、 向土壤中加人足量的去离子水使得土壤含水量约至最终含水量的一半,最终含水量为土壤最大持水量 的40%一60% 试验开始时根据试验设置的处理组(如需要,以及参比物试验组)和对照组的数量将经 过预湿处理的土壤分成若干份 通过添加受试物溶液或去离子水调节土壤的含水量至最大持水量的 40%一60% 试验开始和结束时测定土壤含水量(105C烘干至恒重) 含水量应处于线蚓生长的最适 范围内 可通过手指轻轻挤压土壤的方法来粗略地检查其含水量 若土壤含水量适中,则经过挤压后 手指间余有少量水分(小水滴. 8.2受试生物 8.2.1受试生物的选择 受试生物种宜为白线蚓(Enhyrueusalbidwe),属于环节动物门,寡毛目,线蚓科 白线蚓是线蚓 科中体型最大的种之一,体长最长可达3.5eml刀 白线蚓是世界广布种,常见于海祥,淡水以及陆地、 主要生活在腐烂的有机质(海藻、堆肥)当中,鲜见于草地" 其广泛的生态耐受性和某些形态上的变化 表明其存在不同的类群 其他的线蚓种也可用于试验,例如E.buchhol:i或E. rypiw(参见附录c) 若试脸中使用了其 他线蚓种,应对这些种进行准确鉴定,并在报告中提供选择该受试物种的理论依据 8.2.2受试生物的准备 白线蚓通常作为鱼饵出售 获得白线蚓后应检查其是否受到其他物种通常是更小的物种)污 染g, 若存在污染,应将所有的白线蚓置于培养皿中用水清洗 将体型大的成蚓挑选出来(通过体视 显微镜镜检)作为重新培养用的亲本,其他的蚓虫弃之不用 白线蚓(E.albidus)在多种有机质中均易 于培养(参见附录D) 在33d18C)74d12C)内可发育成熟,生命周期较短 只有当白线蚓在 实验室内培养至少5周(一代)未出现任何问题后,方可将其用于试验 试验应选用成蚓,其环带区具有卵(白点),体长相近(约1cm) 不要求选择同一时期培养的线蚓 若线蚓未在同一类型的土壤中,或未在与最终试验相同的条件下(包括饲喂条件)繁殖培养,则应先 驯养1d3d 选取超过试验所需的大量成蚓对其进行驯养,以发现并弃除受损或其他不适用的个体 在驯养末期,挑选出怀卵和无异常行为表现如试图逃离驯养土壤)的蚓虫用于试验 用精密的子、小 钩或小环将蚓虫轻轻移人装有少量淡水的培养皿中 由于去离子水、去矿物质水或自来水均有可能对 蚓虫造成伤害,因此可参考GB/T21828n中的方法配制淡水 采用体视显微镜对蚓虫进行镜检,弃除 未怀卵的个体 仔细去除可能影响线蚓驯养的瞒虫或跳虫 未用于试验的健康蚓虫可重新放回原基质 中继续驯养 8.3受试物的添加 8.3.1水溶性受试物 采用去离子水配制受试物溶液,配制量应满足一个试验浓度组中所有平行的使用 应采用合适的 水量配制以达到试验含水量的要求,即土壤最大持水量(wHC)的40%一60% 分别将每个浓度的试 验溶液与经过预湿处理的同一批土壤充分混匀,再将混合好的土壤分装人试验容器
GB/35514一2017 8.3.2难溶于水的受试物 对于难溶于水但易溶于有机溶剂的化学品,可将受试物溶解于尽可能少量的溶剂中(如丙酮) 只 可使用挥发性溶剂 将溶剂喷洒在少量石英砂上如2.5g石英砂)或与石英砂混合,再将石英砂放置 在通风橱中至少1h,通过挥发去除有机溶剂 向土壤中添加适量的去离子水达到所需的含水量后,将 石英砂与受试物混合物加人并充分混匀 将最终的土壤混合物分装至试验容器 通常情况下受试物的浓度不应高于100mg/kg干重土壤 但着为了达到某些特殊的试验目的 也可采用更高的浓度进行试验 8.3.3难溶于有机溶剂的受试物 对于难溶于水和有机溶剂的化学品在每个试验器皿中将等量的2.5只精细研磨的石英砂与一定 量的受试物混合以达到试验所需的浓度 添加适量的去离子水达到所需的含水量后,将混合有受试物 的石英砂加人到预湿润的土壤中充分混匀 将混合好后的土壤分装到试验容器中 每个浓度的重复组 和空白对照组采用上述同样的方式处理 试验程序 g.1试验组和对照组的处理 对于每个浓度组,在试验容器中装人相当于20g干重的土壤 不含受试物的空白对照组也同样操 作 向每个试验容器添加食物 将线蚓随机分配每个容器放人10条 使用精密的慑子,小钩或小环 小心地将蚓虫移人试验容器并放置于土壤表面 试验浓度组和对照组的平行数取决于试验设计 将试 验容器随机放人培养箱,且每周随机调换一次容器的摆放位置 若受试物添加过程中使用了溶剂等载体,则应增设一个对照组与各试验组同时进行 该对照组中 石英砂也应喷洒或混合溶剂,且溶剂或者分散剂的浓度应与含受试物试验容器中的溶剂浓度相同 对 于难溶于水和有机溶剂的受试物,其空白对照组也应先分出2.5g石英砂按照同样的程序操作 9.2试验条件 试验条件具体如下 试验温度:20C士2C aa b 光照;为了防止蚓虫从土壤中逃逸,试验应在受控的光-暗周期下进行(最适光周期为l6h光 照:8h黑暗),试验容器放置区域的光照强度应为400lx800lx 湿度:为了检查土壤湿度,应在试验开始时以及此后的每周对试验容器进行称重 质量损失可 通过添加适量的去离子水补充 可在试验培养箱中保持较高的空气湿度(>80%)从而减少 水分的损失 在预试验和正式试验开始及结束时分别测定土壤含水量和pH值 除试验用土壤外,应用同 样的方法额外制备土壤样品用于空白对照及受试物处理组的土壤含水量和pH值测定,但该 土壤样品中不含有蚓虫 仅在试验开始时向上述土壤样品中添加食物以提高微生物的活性 试验过程中不额外添加食物 9.3饲喂 试验用的食物应满足线蚓种群生长繁殖的需要 燕麦片适于作为饲喂食物,使用前应进行高压或 高温灭菌以防止微生物污染 应在放人蚓虫之前向容器内添加食物,将50mg经过研磨的燕麦片与土壤混合 此后,每周添加
GB/T35514一2017 次食物直至21d 第28天不再添加食物,因为这个阶段成虫已被移出,而幼虫几乎无需再额外供给 食物 试验期间饲喂时,每个容器加人25mg研磨后的燕麦片,将燕麦小心地放置于土壤表面以避免 触伤线蚓 为了减少真菌滋生,应用少量的土壤掩盖燕麦片 若观察到食物有剩余,应减少饲喂量 g.4预试验 必要时,可采用5个试验浓虔进行预试验,加;,0.!nmg/kk.l.0mg/kg.0mg/kg.100mg/k租 1000mg/kg(干重土壤) 每个受试物处理组和对照组各设置一个平行 预试验时间为2周 试验结束时以线蚓的死亡率作为评价终点 通过机械刺激蚓虫的前端,若蚓 虫无反应则可判定其死亡并进行记录 除了死亡率,预试验中获得的其他信息也有助于确定正式试验 的浓度范围 因此.对于成虫行为(如钻人土壤的能力受到抑制、静止不动地贴在试验容器的玻璃内壁 上)和形态如出现明显的伤口)上的变化也应与幼虫的出现一并记录在案 后者的测定可参照附录 中描述的方法进行 通过计算受试生物死亡的几何平均值确定LC,m 设置正式试验的浓度范围时,可假设对线蚓繁殖 产生影响的浓度低于LC.的1/10 但该假设仅依据经验而定,在特殊的情况下可能有差异 预试验中 观测到的其他指标如幼虫出现的数量有助于准确确定正式试验中受试物的浓度范围 为了准确计算LC,值,预试验中每个浓度宜至少设置4个平行,同时包括足够数量的试验浓度组， 以便在其中尽量获得至少4个具有统计学意义的显著性差异的平均浓度 试验浓度的数量和对照组的 平行数应尽量接近 g.5正式试验 9.5.1方案 有以下3个正式试验方案可供选择 为了测定NOEC,应至少设置5个呈等比数列的浓度 每个浓度宜设定4个平行,以及8个空 a 白对照 相邻浓度之间的等比系数不应超过1.8 D)为了测定EC，值(如ECw,ECm),应至少设置5个浓度,并确保EEC，值包括在这5个浓度的范 围内,以便通过内插法而非外推法得到EC 每个浓度至少设置4个平行,空白对照也至少设 置4个平行 浓度等比系数可变,例如,在预期的效应浓度范围内该系数可小于或等于1.8,在 较高和较低浓度范围可大于1.8 可采用联合法同时测定NEC和EC 8个处理浓度以等比数列设置,每个处理浓度包括 4个平行,空白对照包括8个平行 相邻浓度间的等比系数不应超过1.8 9.5.2方法 每个试验容器放人10条线蚓 在试验开始时添加食物此后每周添加一次直至21d(包括21d). 第21天以人工的方法仔细地检查土壤样品,观察并记录存活的线蚓数,同时记录受试生物的行为(如钻 人土壤的能力受到抑制、静止不动地贴在试验容器的玻璃内壁上)和形态上的变化如出现明显的伤 口) 从试验容器和土壤中移除所有的成蚓 将含有蚓茧的试验土壤在相同的试验条件下继续培养 3周,仅在第35天饲喂一次(如每个试验容器加人25 mg经研磨的燕麦片 G周后,统计新孵化的劲虫数 尽管可采用湿法提取(不加热)和泽选技术四,但由于土壤面出液 中悬浮的黏土颗粒可引起浑浊,妨碍测定,因此宜使用孟加拉红法检测新孵化的线蚓(参见附录E) 9.6限度试验 若预试验中最高浓度(如1000mg/kg)下未观察到任何抑制效应,则可采用1000mg/kg进行限
GB/35514一2017 度试验 9.7试验方案 试验方案如下(见表1) 表1试验操作步骤 正式试验 时间 预试验 试验前7d或更早 准备人工土壤混合各干燥组分 准备人工土壤(混合各干燥组分 检测人工土壤的pH值; 检测人工土壤的pH值 试验前5d 测定土壤最大持水量 测定土壤最大持水量 筛选线蚓 筛选线蚓 试验前3d~5d 试验前0d -3d 驯养线蚓至少24h 驯养线蚓至少24h 试验前1d 预湿人工土壤并将其分成若干份 预湿人工土壤并将其分成若干份 准备受试物贮备液 准备受试物贮备液; 受试物添加; 受试物添加; 称量受试物,分装至试验容器 称量受试物,分装至试验容器 第0天 混人食物， 混人食物; 放人线蚓; 放人线蚓 测定土壤pH值和水分 测定土壤pH值和水分 检查土壤含水量， 第7天 检查土壤含水量 饲喂 确定成蚓死亡率; 检查土壤含水量; 第14天 估算幼虫数量 饲喂 测定土壤pH值和含水量 观察成蚓行为 移出成蚓; 第21天 确定成蚓死亡率; 测定土壤含水量 饲喂 测定土壤含水量; 第28天 不饲喂 测定土壤含水量; 第35天 饲喂 统计幼虫数量; 第42天 测定土壤pH值和含水量 10试验有效性 对于一个有效的试验,其对照组应满足下列条件 预试验结束时及繁殖试验开始3周后,成蚓的死亡率不应超过20% a b 假定开始试验时每个容器装人10条成蚓,则试验结束时,平均每个容器应至少产出25条 幼虫
GB/T35514一2017 繁殖试验结束时,幼虫产出平均值的变异系数不应高于50% c 若试验不能符合上述有效性标准,除非能够提供继续试验的正当理由,否则应终止试验 继续试验 的理由应在试验报告中阐述 11 数据处理 11.1结果处理 本标准在附录F中给出了相关概述 预试验中,主要的试验终点是死亡率 成蚓行为如钻人土壤的能力受到抑制静止不动地贴在试 验容器的玻璃内壁上)或形态(如出现明显的伤口)上的变化也应与幼虫的出现一并记录在案 通常采 用概率分析[间或逻辑回归计算IC0 但若上述分析方法不适用如少于3个浓度组出现部分死亡),可 使用其他替代方法,包括移动平均法m、修正的Spearman-Karber法[冈或简单内插法(如Lc 和LC 的几何平均值,通过Ic,与Ic乘积的平方根计算获得》. 正式试验的试验终点是繁殖力(即幼虫繁殖数量) 与预试验相同,所有其他的损害效应也应反映 在最终报告中 繁殖试验中对数据进行统计分析时,应计算每个处理组和对照组的平行的算术平均值 和标准偏差 若进行方差分析,假设方差不依赖于浓度,可用单因素方差分析(ANOVA)中得到的合并方差及其 自由度分别替代标准偏差、和自由度df 此时,可使用对照组和处理组的单一方差 这些数据可采用 每个试验容器的结果作为平行,通过相关商业统计软件计算 将空白对照和溶剂对照的数据进行合并 比单独针对其一进行分析更具合理性,前提是应对这两个对照组的数据进行检验并确认其无显著性差 异(检验方法可参考附录F). 进一步的统计分析和推断依赖于各个平行的数据是否为正态分布以及平行数据的方差是否齐性 11.2NoEC的估算 应优先使用有效的试验数据,例如,比对试验中获得的经验信息,或其他关于数据是否近拟正态分 布的历史数据 方差的齐次性(即方差齐性)尤为关键 经验表明方差通常随着平均值的升高而升高 此时进行数据转换可获得方差齐性 但是,这些转化应基于历史数据相关的经验,而非调查数据 对于 具有方差齐性的数据,应采用多重！检验如williams's检验(a )m们,特定情况下可 0.05,单边检验 采用Dunnett's检验n 需要注意的是当平行数不等时,应按照Dume和wihams方法所建议的 对表中的值进行校正 方差较大时,毒性效应未表现出规律性地升高或降低,此时由于与单调性产生 了显著偏差,Dunnett检验更为适用 若存在方差齐性的偏离,则应更严密地检查其对方差可能造成的 影响,以便决定是否采用t检验,而不会导致有效性的显著降低[2到 也可选用以下统计方法,如多重 U检验或根据Hom的Bon Dnferron ni-U检验u;对于存在异方差性但符合单调浓度-效应关系的数据,可 心 采用非参数检验,如Jonel heere-Terpstra的”或shirley检验好8,通常优先采用方差非齐性！检验(参 见附录F). 若进行限度试验,且已具备进行参数检验的前提条件(如正态分布、方差齐性),则可采用配对的 检验或Mann-whitney-U检验[ 1.3c，的估算 在获得适当的浓度-效应关系后,对每个处理的平均值应用回归分析(线性或非线性),计算c 值 将蚓虫生长作为一个连续效应,采用合适的回归模型估算Ec, 对于化数据(死亡/存活及紧 殖的幼虫数)宜采用的函数包括;含有2个4个参数的正态S型曲线函数,logistie或weibull函数,其
GB/35514一2017 中部分函数能够模拟兴奋效应 若采用线性回归分析拟合浓度-效应关系,在将对照组平均值的r%代 人回归分析获得的公式中估算EC，之前,应先通过回归分析找到重要的参数r决定系数)和斜率 根 据Fieler或其他适用的现代统计方法计算95%置信限时 此外,毒性效应也可按照模型参数的一定比例进行建模,模型参数即为对照组的平均效应 上述情 况下,通常可根据概率回归的程序采用正态(logistie,weibull)s型曲线拟合数据时,同时对权重函数 的度量效应进行校正 但若观察到兴奋效应,应采用四参数logistic或weibull函数代替概率分析 按照非线性回归的步骤进行拟合n 若无合适的剂量-效应函数用于拟合试验数据,也可采用其他替 代的方法估算EC，及其置信限,例如移动平均法门和Trit 1mme udspearmanKabher法" 12结果报告 试验报告应至少包括以下内容 受试物 a -物理性质,以及相关的物理-化学特性(例如,水溶性、蒸气压) 根据IUPAC命名法,CAS号、批次、标签、结构式和纯度确定受试物的化学识别信息 样品有效期 b 受试生物 -所用的受试生物;种学名、生物来源以及饲喂条件 试验条件 人工土壤的组分和制备 受试物的添加方法; 试验条件的描述,包括温度、含水量、pH值等; 试验方案和操作步骤的详细描述 d)试验结果 2周后成蚓的死亡率以及预试验结束时幼虫出现的数量; 暴露3周后成蚓的死亡率,并在正式试验结束时完整记录幼虫的各项指标; 任何可观察到的受试生物生理病变及其行为变化 LC、繁殖效应的NOEC和/或EC.如EC、EC)及其置信限(如适用,用于计算所有 数据的拟合模型图谱,以及有助于解释试验结果的观察现象 对于本标准的任何偏离以及试验过程中的特殊现象
GB/T35514一2017 附 录 A 资料性附录) 土壤pH值的测定 用于测定土壤样品pH值的方法主要基于IsO10390时 将一定量的土壤在室温条件下持续干燥至少12h,用1nmol/L分析纯KC溶液或0.01nmol/儿分 析纯CaC1溶液配制成5倍于土壤体积的土壤悬浮液(至少含有5g土壤) 将悬浮液充分震荡5min 振荡后,将悬浮液静置至少2h但最长不超过24h 然后用pH计测定水相的pH,每次测定前应采用 适当的缓冲溶液(如pH4.0和pH7.0)对pH计进行校准 0
GB/35514一2017 附录 B 资料性附录 最大持水量的测定 已证实以下方法适用于本标准详见ISODs11268-2的附录c 使用适当的工具(如螺旋钻采样管等)取一定量(如5g)的试验土壤基质 用一张滤纸覆盖该管底 部,往管中注满水后将其置于水浴的支架上 将该管逐渐没人水中,直至水位没过土壤的顶部 将该管 置于水中约3h 由于土壤毛细作用无法保持住全部被其孔隙所吸收的水分,因此将该管置于一个底 部铺满潮湿且精细石英砂的密闭容器(防止水分蒸发)中约2h,使土壤样品沥干水分 然后对样品称 重,105C烘干至恒重 持水量(wHC)通过式(B.1)计算 D WHC ×100% (B.1 式中: 水饱和基质的质量十采样管质量十滤纸质量 T 皮重(采样管质量十滤纸质量); D 基质干重 11
GB/T35514一2017 录 附 资料性附录) 其他种类线蚓的试验操作 C.1物种的选择 除白线蚓E.albidws)外,其他线蚓种也可用于试验,但是对试验程序和有效性标准都应做出相 应的调整 由于许多线蚓种都可轻易获得,并且能在实验室较好地培养,因此选择白线蚓E albidws)之外的其他线蚓种最重要的标准是其生态相关性以及接近的敏感性 更换受试生物种还需 提供正当的理由 例如,有些国家没有白线蚓或由于检疫限制等原因无法进口白线蚓,则有必要使 用其他的线蚓种 C.2适用的替代性线蚓种 适用的替代性线蚓种包括 Enhyn ;近年来,因其驯养和试验简便,该物种常用于生态毒理学研究 然而 a ytraeuscrypticus: 与白线蚓相比,Enchytr 体型小,操作起来较为困难(特别是在使用染色法的前 aeuscrypticus 期阶段) 到目前为止,尚未有发现E.rypiw存在于田间的确定信息,只有来自蚯蚓驯养 中的描述,因此它的生态学方面的要求仍然未知. Ehytraeu.bchholsi;此名称可能诵盖了一组在形态上难以区分的近缘物种 b 试验时不宜 使用该物种,除非用于试验的个体能够鉴定到种 E.buchholei经常出现在草地和受到干扰 的场所,如路边 Enhyrweuslucuwrious该种最初被称为E.“minutae”,最近才对它有了进一步描述n 它 个靠近St Peter-Ording(德国,Schleswig-Holstein)的草地上首次发现 E 由U.Graefe在 ururiosus体长约为白线蚓的一半,但是均大于本附录中提及的其他线蚓种,这使得它成为白 线蚓的一个较好的替代物种 Enchytraeusbulhosus;迄今为止,有报道表明该物种来源于德国和西班牙的矿质土壤,比较常 d 见,但通常情况下数量并不十分丰富 相对于该属的其他体型较小的种来说,它比较容易辨 别 该物种在室内试验中的行为及对化学品的敏感性等方面的信息尚不清楚,但已发现该物 种较为容易培养 饲喂条件 C.3 上面提及的所有线蚓种均可使用与白线蚓E.albidus)相同的基质进行培养 它们较小的体型意 味着可使用体积较小的培养容器,且当饲喂相同食物时,应调整饲喂量 上述物种的生命周期均短于白 线蚓,因此应增加饲喂的频率 C.4 试验条件 -般情况下,上述各线蚓种的试验条件与白线蚓(E.albidas)的相同,以下除外 可使用更小的容器,但并非必需; a 12
GB/35514一2017 b 可缩短繁殖试验的时间,如将6周改为4周,但并非必需,不应改变预试验的时间 c 考虑到幼虫的体型更小,宜使用染色法进行计数; d)关于“在对照组中每个试验容器的幼虫数”有效性的指标,应改为“50” 13
GB/T35514一2017 附 录 D 资料性附录) 线蚓的驯养条件 线蚓中的白线蚓种及其他线蚓种可用大塑料箱(如30em×60cm×10cm)进行培养,箱里装有由 人工土壤和自然无污染的菜园土按照1:1比例混合的土壤 由于堆肥可能含有毒物质,如重金属,应 避免使用 土壤使用前应去除其中的生物,可采用低温冷冻的方式 可使用仅含有人工土壤的基质,但 其繁殖率可能低于用混合土壤基质培养得到的繁殖率 用于线蚓培养的基质pH值应为6.0士0.5 受试生物应在温度为(15土2)(20士2)C的黑暗环境中进行培养,温度不高于23C 土壤保持 潮湿状态,但不能过于湿润 当用手指轻轻挤压土壤时,若指间出现小水滴则表明土壤的含水量适中 确保培养容器的盖子可允许与大气进行充分的气体交换,以避免缺氧 每周应小心地给土壤松土以利 于通气 线蚓可用燕麦片进行饲喂 燕麦片应贮存在密封的容器中,并且在使用之前进行高压或高温灭菌 处理,以避免感染粉尘瞒如Gly2ybhagussp.，Astigmata，Acarina)或捕食性类[如Hypoaspi )miles,Gama.sida，Acarina] 经过加热处理后,食物变得酥脆,可较为容易地撒落在 Cowmodlaelap 土壤表面 有时,可通过添加维生素、牛奶和鱼肝油来对燕麦片进行补充 其他适用的食物包括面包酵 母和鱼食 -周约饲喂两次 可将适量的燕麦片撒在土壤表面,或在给土壤松土进行通气时,小心地将食物混 人土壤基质 食物的供应量取决于土壤基质中培养的线蚓数量 若添加的食物在一天之内全部消耗完 全 ,则应增加食物的供应量 相反,若在第二次饲喂时即一周后)发现仍有食物残留在土壤表面,则应 减少食物的供应量 应当移走和替换受到真菌污染的食物 培养3个月后,应将线蚓转移至新制备的 基质中 若线蚓满足以下条件,则可认为培养条件是合适的 无逃离土壤基质的意图; a b 可在土壤中快速移动; 体表光亮且未黏附土壤颗粒; d 出现或多或少的白色斑点; 培养过程中出现多个生长阶段的蚓虫 能够持续繁殖 14
GB/35514一2017 录 附 E 资料性附录 受试生物的计数方法 E.1孟加拉红染色法 该方法源于湖泊生态学m,由w.deCoen(比利时,根特大学)首次将其应用于线蚓繁殖试验中的 幼虫计数 RIVM(Bilthoven)开发了一个改良版方法,用甲醛替代乙醇与孟加拉红混合12，3灯 正式试验结束时(如6周后),将试验容器中的土壤转移至一个较浅的容器中 Bellaplast容器或带 有棱纹底部的光照池均适用,后者的底部棱纹可限制线蚓移动,使其一直处于观察视野范围内 用乙醇 每个平行约5mL)将幼虫固定 然后往试验容器中注水至水层高约1em2cm 加人几滴 200AL300L)孟加拉红(1%的乙醇溶液),也可用0.5%的曙红代替,将水与染料仔细混合 12h 后,线蚓将被染成微红并且平铺在基质表面,从而易于计数 在进行线蚓计数前,也可用筛网(筛孔 0.250mm)将基质/酒精混合物洗去 通过该处理,高岭土、泥炭块以及部分石英砂将被洗去,更易于对 染成微红色的线蚓进行观察和计数 使用照明镜头(镜头尺寸至少为100mm×75mm,放大倍数为 )有助于计数 2×3 上述染色技术可将每个容器的计数时间减少至几分钟,使得能在最多两天时间内完成一个试验中 所有容器的计数 E.2湿法提取 湿法提取应在试验结束后立即进行 将每个容器中的土壤放人筛孔约为1mm的塑料筛中,然后 将筛网悬空放置在塑料盆中,盆不能触碰到筛网底部 小心地往塑料盆中注水,直至筛网中的样品完全 没人水中 为了确保线蚓的回收率超过90%,应在20C士2C的条件下提取3d 提取结束时,将筛网 从水中取出,同时将盆中的水(水量较少的除外)慢慢倒出,注意不能干扰盆底部的沉积物 然后轻微晃 动塑料盆使沉积物悬浮于上覆水中 将盆中的水倒人培养皿中,待土壤颗粒沉降后,线蚓即可被识别 然后用软钢锻子将线蚓移至体视显微镜下进行计数 E.3浮选法 .[30] R.Ku uperman在其记录中描述过浮选法 将试验容器中的物质用乙醉固定后,往土壤中注人硅 溶胶(AM-30硅胶,质量分数为30%的水悬浮液)直至液面高于土壤表面10mm15mm 将土壤和 浮选剂充分混合2" min3min后,幼虫将浮在表面并易于被计数 15
GB/T35514一2017 附录 F 资料性附录) 数据统计评估的概括(NoEC的确定 数据统计评估流程见图F.1 参数检验 非参数检验 开始 香 数据 每个处理至少四 无可推荐的统计 否 否 数据转化 个平行? 检验方法 方差是否齐性？? 分布是否正态？ 是 两组对照是否相 是否有额外的溶 两组对照是否相 是否有额外的溶 是 筝? 检验 剂对照组 等?U-检验 加Amn 是 否 将两组对照 排除无溶剂的空 将两组对照的 排除无溶剂的空 数据合并 白对照 的数据合并 白对照 Dumnet's检验 Bonferoni-U-检验 wiliams检验 Jonckheere-Terpsra检验 Shirley检验 Dunn's检验 图F.1数据统计评估流程图 16
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化学品线蚓繁殖试验GB/T35514-2017

化学品是现代工业生产中必不可少的一种物质，广泛应用于各个领域。然而，化学品也会对环境造成影响，其中线虫是环境敏感指标生物之一。

为了评价化学品对线蚓的毒性效应，国家标准GB/T35514-2017制定了化学品线蚓繁殖试验方法。

试验目的

该试验的目的是通过观察化学品对线蚓的繁殖能力和生长发育的影响，评估化学品对土壤生态系统中线蚓的生态风险。

试验对象

试验对象为普通线蚓（Eisenia fetida），这是一种常见的蚯蚓，广泛分布于世界各地。

试验方法

试验过程中需要使用标准土壤，并在试验开始前对土壤进行化学分析，以确定其基本性质。将成熟的线蚓放入含有不同浓度化学品的土壤中，定期观察线蚓的生长发育和繁殖情况，并统计相关数据。

结果解读

通过试验可以得出化学品对线蚓的毒性效应，包括致死浓度、致死时间、半数致死浓度等指标。同时，还可以评估化学品对线蚓的繁殖能力和生长发育的影响，从而推断其对土壤生态系统的影响。

总之，GB/T35514-2017制定的化学品线蚓繁殖试验方法是一种科学、可靠的评估化学品对土壤生态系统影响的方法，具有重要的实际应用价值。

化学品线蚓繁殖试验的相关资料

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