GB/T31798-2015
油菜黑胫病菌检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofPlenodomusbiglobosus(Shoemaker&H.Brun)Gruyter,Aveskamp&Verkley
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2015-11-27
- 文件格式PDF
- 文本页数11页
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油菜黑胫病菌检疫鉴定方法
国家标准 GB/T31798一2015 油菜黑胫病菌检疫鉴定方法 DeteetionandidentifieationofPlenodomusbiglobosts (Sh0emaker&H.BrunGruyter,Aveskamp&Verkley 2015-07-03发布 2015-11-27实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T31798一2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
请注意本文件的某些内容可能涉及专利
本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本标准起草单位湖北出人境检验检疫局、检验检疫科学研究院、中华人民共 和国上海出人境检验检疫局、江苏出人境检验检疫局、华中农业大学
本标准主要起草人;赵晖、王振华,曾宪东,易建平、李彬、李国庆,吴品珊、蔡翔
GB/T31798一2015 油菜黑胫病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了油菜黑胫病菌(Plenodomusbiglobous)的检疫鉴定方法
本标准适用于油菜种子、植株及其产品中油菜黑胫病菌的检疫和鉴定
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 仪器设备和主要试剂 3.1仪器设备 生物显微镜、体视显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台,灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝胶成 像系统、电泳仪,培养箱,超低温冰箱、常规冰箱、涡旋振荡器
3.2主要试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂,试验用水符合GB/T6682
3.2.11%次氯酸钠 3.2.2DNA提取试剂:DNA提取试剂盒,异丙醇,无水乙醇
尿素提取液(7mol/LUrea、,50mmol/L Tris-HClpH8.0,62.5mmol/儿LNaCI,1%SDS),蛋白酶K(20mg/mL),苯酚;三氯甲烧:异戊醇 (25;24:1)溶液,3mol/LNaAc(pH5.2 3.2.3PCR试剂:10×PCR缓冲液(含25mmol/LMgSO),Taq酶,dNTPs
3.2.4凝胶电泳试剂;琼脂糖,TAE,Loading缓冲液,EB 3.2.520%V8培养基:V8蔬菜汁(CampbellSoup公司200mL.,CaCO.0.75g，琼脂粉13.0g，蒸溜 水定容至1000mL,调整pH至5.8,121C高压灭菌20min. 3.2.6马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):马铃薯浸粉5.0g,葡萄糖20.0g,氯霉素0.lg,琼脂13.0g,蒸 憎水定容至1000mL,调整pH至5.6,121高压灭菌20min. 病菌的鉴定 4.1症状检查 4.1.1种子症状检查 取样品量1%5%若样品少可适量增大比例)的种子,在解剖镜下挑选皱缩、干瘪、变色、残缺的 种子或有霉变的籽粒或病残体,每份种子样品挑选不少于500粒,用做病原菌的分离
另取1kg种子，
GB/T31798一2015 mm和1.5mtm 用孔径2.5 的网筛过筛,取筛上物、筛下物和种子各1g一2g用于DNA提取
4.1.2植株症状检查 取病变的植株的茎根部和叶部进行检查
主要检查茎根部和叶部
选取叶片上出现圆形或不规则 形.稍凹陷.中部灰白色病斑.部分斑内散生许多小黑点症状的病变部位
植茎则选取不规则形渎褐色 斑,或灰白色病斑、稍凹陷、上生黑色小点,或茎基及根系溃疡、枯萎症状的病变部位(参见附录A
4.2分离培养 种子病原菌的分离培养 4.2. 将挑选的疑带菌种子置于灭菌燕馏水中室温浸泡处理1d,转人一20C下冷冻处理1d1%次氯 酸钠消毒5min~7nmin,无菌水洗涤3次后,用滤纸吸干种子,按25粒/皿置于V8培养基或PDA培养 基上,在20C一25C,12h黑暗12h光照(12h光暗交替)条件下培养,第3天开始观察
4.2.2植株病原菌的分离培养 用解剖刀取植株病健交界处的组织,剪成约0.4cm×0.4cm小段,用1%的次氯酸钠溶液消毒 5min ,无菌水洗涤3次,灭菌滤纸吸干水分后置于V8脂培养基或PDA培养基上,同6.2.1培养观察
4.3 鉴定特征 该病菌在培养基上可良好生长,气生菌丝发达，产跑量大
后期(45小)可见到明显的抱子座和粉红 色的他子说出
气生菌丝呈自色或做黄,后期菌丝上会分溜出饿黄棕色的油状液滴
分生抱子呈长杆 形或梭形,长度在25pm一3.0pm之间,宽度在08wm一1lpm之间
在袍子的两端各有一个透明的 小液滴
PDA培养基会随着菌丝的生长呈黑色或黄色
该病菌在PDA上产生黄褐色色素
4.4CR检测 4.4.1样品DNA提取 取筛上物、筛下物和种子,或植株可疑病变组织各1g~2g,液氮研磨后各取样0.lg0.2g,采用 商业化试剂盒或尿素法提取DNA(参见附录B). 4.4.2CR检测方法 PCR检测方法参见附录C,重复3次
用油菜黑胫病菌(Plen
igobwsus)参照菌株DNA作阳性 对照,用灭菌蒸僧水作空白对照
结果判定 病菌的分离培养形态特征符合4.3中描述,可报告检出油菜黑胫病菌
PCR检测作为筛选和辅助 方法
样品保存与结果记录 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存
对检出油菜黑胫病菌的样品应保存于4C冰箱中,以备复 核
该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理
GB/T31798一2015 6.2 菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为油菜黑胫病菌的菌株,应妥善保存
将菌株接种于V8培养基或PDA 培养基斜面上,20C25培养5d,然后4冰箱保存,或将菌丝块转人20%灭菌甘油并混匀 -80C长期保存
对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理
6.3结果记录与资料保存 完整的试验记录包括:样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并应有试验人员 和审核人员签字
PCR凝胶电泳检测应有电泳结果照片
GB/I31798一2015 附 录A 资料性附录 油菜黑胫病菌相关信息 A.1背景资料 A.1.1油菜黑胫病菌基本信息 中文名;油菜黑胫病菌
学名.Plendowwbiglowus(shoemaker&.H.Brun)Gruyter,.Aveskamp&.Verkley 异名:leptosphaeriabiglobosaShoemaker&.H.Brun 分类地位;真菌界(Fungi),子囊菌门Ascomycota),座囊菌纲(Dothideomycetes),格抱腔菌目 Ple leosporales),小球腔菌科(Leptosphaeriaceae)
根据对油菜的侵染能力不同,分为强致病性菌株和 弱致病性菌株,2001年前均命名为Leptosphaeriamacalans
2001年,Shoemaker和Brun根据传统的 Shoemaker&
Brun
2012年 分类学原则将对油菜弱致病性的菌株定为Leposphaeriaiglobosa Gryter等根据分子和系统发育特征将该菌重新分类命名为PlenodomusbigloosusShoemaker&.H. 35 Brun Gruyter,Aveskamp&.verkley. 传播途径:感病的植株,病残体以及受侵染的种子等植物性材料是远距离传播的主要途径 A.1.2方法原理 根据油菜黑胫病菌在寄主上的为害症状,培养基上生长的菌落、菌丝、分生袍子和分生抱子器形态， 以及PCR特异扩增片段大小等特征进行结果判定
A.1.3寄主范围 该病菌的寄主广泛,主要有如油菜、甘蓝,花椰菜等芸肯属bra ,萝卜属Raphan ,独行菜属 assic， 17s， "屈曲花属Mhr,醉来并属Comn,紫罗兰属MMain，糖井属 Lepidlium,香雪球属Lobularia eroa,葱芥属Aliaria等植物
团朝莽属B Erysimun，
GB/T31798?2015 A.2в???,?? 0um ? -????; ??; ??; -??????? -PDA????; ? ?:?? ?A.1в???,??
GB/I31798一2015 附 录 B 资料性附录 油菜黑胫病菌DNA的提取方法 B.1试剂盒提取DA的方法 B.1.1将植物样品用液氮碾碎
B.1.2按照试剂盒提供的操作步骤处理
B.2尿素法提取菌丝DNA的方法 B.2.1取500Al
尿素提取液(7nmol/L.Urea、50mmol/LTris-HClpH8.0,62.5mmol/LNaCI、1% SDs)与10L20mg/mL蛋白酶K至EP管中,挑取200mg菌丝至EP管,混匀
B.2.2置55C温育30nmin,每隔10min振荡混匀1次,12000r/min离心5min,将上清液移人另一 EP管中,加人等体积的苯盼;三氯甲烧;异戊醉(25;24;1)溶液,颠倒混匀,13000r/min离心 10 mina B.2.3取上清液到另一EP管中,加人等体积的异丙醇和1/10体积的3mol/L
NaAc(pH5.2). -20C放置20min,13000r/min离心10min B.2.4弃上清液,倒置晾干,用70%乙醉洗涤,室温倒置于吸水纸上晾干,溶于20lTE溶液中,加人 RNaseA1g/L)1L,13000r/min离心10min,弃上清液,37水浴30 -20C保存备用
min，"
GB/T31798一2015 附 录c 资料性附录 定性CR方法 C.1CR扩增 C.1.1定性CR选择一 油菜黑胫病菌P.biglobou特异性引物一;5'-GCAAAATGTGCTGcGCTCCAGG3'/5'" ATCAGGGGATTGGTGTCAGCAGTTGA-3'，预期扩增产物约为444bp. 油菜黑胫病菌定性PCR检测反应体系见表C.1
PCR反应程序为95C2min;95C15s,70C30s,72C1min,30个循环,72C10min
C.1.2定性CR选择二 油菜黑胫病菌P.biglohwsus特异性引物二;5'-CATTACCCTTCTATCAGAG3'/5'-GCTGCGT！ CTTCATCGATGC-3',预期扩增产物为234bp. 油菜黑胫病菌定性PCR检测反应体系见表C.1
PCR反应程序为935 min;93C40s,4050s,72C60s,40个循环;72C10min. 表C.1检测油菜黑胫病菌定性CR反应体系 试剂名称 加样量/aL 浓度 2.5 R缓冲液(含25mmoMgsO 10X dNTPs 各2.5mmol/L 0.5 正义引物 204mol/L 1.0 反义引物 20Amol/1 1.0 TagDNA聚合酶 5U/l 0.5 DNA模板 50ng/Al .0 补至25山 ddH.O C.2PCR扩增产物检测 扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶在1×TAE缓冲液中电泳,EB染色后用凝胶成像系统分析 c.3结果判定 PCR扩增产物检测,阳性对照出现一条444bp(定性PCR选择一)或234bp(定性PCR选择二)的 DNA片段,阴性对照和空白对照没有该核酸条带,待检样品如出现444bp(定性PCR选择一)或234p 定性PCR选择二)的DNA片段为检测结果阳性,如未出现444bp(定性PCR选择一)或234bp(定性 PCR选择二)的DNA片段为检测结果阴性
GB/I31798一2015 附 录D 资料性附录 近似种鉴定特征比较 D.1油菜黑胫病菌的鉴定特征 该病菌在培养基上可良好生长,气生菌丝发达,产抱量大
后期(15d)可见到明显的弛子座和粉红 色的袍子溢出
气生菌丝呈白色或微黄,后期菌丝上会分泌出淡黄棕色的油状液滴
分生袍子呈长杆 形或梭形,袍子大小(2.5m一3.04m)×(0.84m~1.1um)
在袍子的两端各有一个透明的小液滴
PDA培养基会随着菌丝的生长呈黄褐色或黄色
该病菌在PDA上产生黄色或黄褐色色素
D.2油菜茎基溃疡病菌的鉴定特征 该病菌在培养基上菌落边缘不整齐、有结节状颗粒点,气生菌丝白色、多而致密,分枝较多,有分隔
挑取见到的菌丝结制片,置于体视显微镜下观察
分生抱子器直径150m225Am,球形至扁球形 褐色至深黑褐色,散生、埋生或半埋生于菌丝中,有空口1个2个,部分分生抱子器从孔口处溢出浅粉 红色胶质状黏液
分生抱子无色透明,椭圆形至纺锤形,两端常见各1个油球,抱子大小(3.3m 6.14m)×1.4 2.4 4Am)
该病菌在PDA上不产生黄色或黄褐色色素
4m D.3近似种鉴定特征的比较 近似种鉴定特征比较见表D.1 表D.1油菜黑胫病菌与油菜茎基溃疡病菌鉴定特征的比较 油菜黑胫病菌 油菜茎基溃疡病菌 项目 Plenodomusiglobosus Pleodlomwslingam leptosphaeriabiglobosa Leptoshaeriamaculans 菌落规则、产生绒毛状白色菌丝,菌丝生长速度 菌落白色平坦,边缘不整齐,菌丝生长速度较慢 较快、气生菌丝发达,分枝较少,培养后期菌丝上 培养特征 气生菌丝白色、短小而致密,分枝较多,分生袍子 分泌出渎黄棕色的油状液滴,子囊抱子萌发速度 器较少,子囊袍子萌发速度慢、萌发芽管短 快,萌发芽管长、产袍量大 袍子大小 2.5Mm一3.0Mm)×(0.8m~1.1Mm) 3.3m一6.14m)×(1.4Am一2.4Am) 色素特征 PDA产生黄色或黄褐色色素 PDA不产生黄色或黄褐色色素
GB/T31798一2015 参 考 文 献 [1]刘泽.农作物病害研究之油菜黑胫病病害.北京:光明日报出版社,2008. ofLe" shoemakerRA,BrunH.TheteleomorphoftheweaklyaggressivesegregateG -eplospha eriamaculas.CanadianJournalofBotany,2001(79):412-419. bhaeriamaculanswith XueB.GoodwinPH.AnmissLPathotrypeidentificationofLepos)" PCRandoligonuclrotideprimers ribosomalinternaltranscribedspacersseguences,Physiological andMolecularPlantPatholo ,1992(41):179-188. logy， [4们]MahukhGSs,HallR,GoodwinPH.DistributionofLeptosphaeriamaculansintwofieldsin southernOntarioasdeterminedbythepolymerasechainreaction，EuropeanJournalofPlant Pathology y,1996(102):569-576 IiuSY,liuZ,FittBDI,etal.ResistancetoLeptoshaeriamaculansphomastemcan- ker)inBrassicnapusoilseedrape)inducedbyL.iglobosuandchemicaldefenceaetivatorsinfield andcontrolledenvironments.PlantPathology,200655):401-412. [6]GruyterJ.de,WwoudenbergJ.H.C,AveskampM.M.etal.RedispositionofPhoma-likeana" morphsinPleosporales.StudiesinMycology,2012(75):1-36.
油菜黑胫病菌检疫鉴定方法GB/T31798-2015详解
油菜是我国重要的油料作物之一，也是蔬菜和饲料的优良来源。然而，油菜种植中常常会出现黑胫病的问题，这不仅影响了油菜的产量和品质，还可能给其他作物带来传染风险。为了保障油菜种植的健康和安全，GB/T31798-2015《油菜黑胫病菌检疫鉴定方法》标准应运而生。
该标准针对油菜中的黑胫病菌进行了检测和鉴定规范，旨在确保油菜的生产和质量。标准要求对油菜样品进行细菌分离、培养、生化和分子鉴定等步骤，最终确定是否存在黑胫病菌。
该标准的执行需要注意以下几个方面：
- 样品的采集和处理必须严格按照标准要求进行，以避免误差和污染。
- 实验室必须具备相应的设备和技术条件，能够确保检测结果的准确性和可靠性。
- 检测结果需要结合样品的来源、生长环境和病情等多方面因素进行综合分析和判断，以避免误判和漏判。
总之，GB/T31798-2015标准对于保护油菜生产和保障人民健康具有重要意义。希望各相关单位和从业人员能够认真贯彻执行该标准，并加强对油菜黑胫病的防控和管理。
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