牛尿中α-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮残留量的测定液相色谱-串联质谱法

牛尿中α-群勃龙、β-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T20761一2006 牛尿中c-群勃龙、卜群勃龙、19-乙烯去甲睾 酮和epi-19-乙烯去甲睾酮残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Methodforthedeterminationofc-trenbolone，B-trenbolone,nortest0sterone andepi-nortestosteroneresiduesinowineurine LC-MS-MSmethod 2007-03-01实施 2006-12-31发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T20761一2006 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录 本标准由秦皇岛出人境检验检疫局提出 本标准由国家质量监督检验检疫总局归口 本标准负责起草单位:秦皇岛出人境检验检疫局、河北出人境检验 检疫局 本标准主要起草人;庞国芳、王凤池、郭春海、艾连峰 本标准系首次发布的国家标准
GB/T20761一2006 牛尿中便-群勃龙、p-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和 epi-19-乙烯去甲睾酮残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了牛尿中Q-群勃龙、3群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮残留量的液相 色谱-串联质谱测定方法， 本标准适用于牛尿中c-群勃龙,}群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮残留量的测定 本标准的方法检出限牛尿中a-群勃龙、}群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮均为 24g/L 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分:总则与定义 (GB/T6379.1一2004,IsO5725-1;1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,ISO5725-2;1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一1992,neqISO3696:1987 原理 试样在pH=5.0条件下加酶水解,经免疫亲和柱净化,用液相色谱-串联质谱测定,外标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 甲醇;色谱纯 4.2乙睛;色谱纯 4.3乙酸.色谱纯 100000unit/ml 各葡萄糖苷酸酶和芳基碗酸醋(gtlucuronidase.andarylsulfhatase) ): 4.5氢氧化钠溶液lmol/L 10只氢氧化钠溶于250ml水中 4.日盐酸游液malL 吸取20.8mL浓盐酸游于水中,定容至250ml. 免疫亲和柱淋洗缓冲储备液和柱贮存缓冲储备液;免疫亲和柱附带 4.8杜柱淋洗缓冲游液,量取1ml储备溶液与19ml水混溶,临用前现配 4.9柱贮存缓冲溶液;量取1m储备溶液与4mL.水混溶,临用前现配 4.10甲醇十水溶液:70+30. 4.11a-群勃龙、,仔群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮标准物质;纯度>98% 4.12标准储备溶液;分别精确称取a-群勃龙、8-群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮标准 物质(4.11)各0.0100g,用乙睛(4.2)溶解并定容至100mL,配制成1004g/mL的标准储备溶液 此
GB/T20761一2006 溶液一18冷冻保存,可使用六个月 4 .13混合标准工作溶液;取标准储备溶液(4.12)各5m置于50m容量瓶中,用乙腊定容至刻度 配制成混合标准工作溶液,浓度为104g/mL,此溶液一18C冷冻保存,可使用三个月 4.14群勃龙/19-乙烯去甲睾酮免疫亲和柱:带有柱淋洗缓冲储备溶液和柱储存缓冲储备溶液,在 2C8C保存 150.45m滤膜 44 仪器和设备 5.1液相色谱-串联质谱仪;配有电喷雾离子源(ESI) 5.2离心机;最大转速5000r/min. 5.3恒温水浴摇床 5.4旋涡混合器 5.5氮气浓缩仪 55.6固相翠取装置 试样的制备与保存 6.1试样的制备 取新鲜牛尿迅速冷冻作为试样备用 6.2试样保存 制备好的试样置于-18C冰柜中避光保存 测定步骤 基质混合标准校准溶液的制备 7.1.1试样的称取 取5个阴性样品,将冷冻尿液融化混匀,取部分样品以转速40001 r/min离心10min 然后,每个 样品分别量取5ml(精确到0.01mL)于15ml具塞离心管中,再分别加人不同量混合标准工作溶液 、l100 4.13),使各被测组分的浓度均为2.5n/mL,5ng/mL.I0ng/ml50ng/mL ng/m8 7.1.2水解 分别将上述离心管溶液,用1nmol/儿 的盐酸(4.6)调节尿样pH值在4.95.1之间,接着加人 0AL葡萄糖苷酸酶和芳基硫酸酯(4.4),摇匀后盖好塞子置于恒温水浴摇床(53)上37C振荡水解 2h.待水解液冷却至室温后,加人4mL柱淋洗缓冲溶液(4.8),用1mol/儿氢氧化纳溶液(4.5)调整尿 样pH值在79之间 7.1.3免疫亲和柱净化 首先将柱贮存缓冲溶液(4.9)过柱,再用15mL柱淋洗缓冲溶液平衡柱子 然后,将水解处理好的 尿样过柱,接着依次用8mL柱淋洗缓冲溶液、5mL水淋洗柱子 最后,用4mL 甲醇十水溶液(4.10) 洗脱分析物并收集于带刻度的试管中(上述过程过柱流浊应<2ml/min) 洗脱液用氮气浓缩仪(5.5 在60cC水浴巾吹至约1mL.用流动相定容至2mL.,旋涡振荡(5.4)混合,过0.45m滤膜(4.15)供 LC-MS-MS测定 注:为确保柱子在下次使用时无残留影响,应继续用10nL甲醇十水溶液(70十30)洗涤柱子 若接着使用此柱、 则重复7.1.3步骤 若不再使用,应用15ml柱贮存缓冲溶液洗涤柱子,最后柱内保留5ml柱贮存缓冲溶 液,2c一8C保存 此柱能重复使用10次左右 7.2试样溶液的制备 将冷冻尿液样品融化混匀,取部分样品以转速4000r r/min离心101 min 然后,量取5mL(精确到
GB/T20761一2006 0.0lmL)于15mL具塞离心管中 按7.1.2和7.1.3操作 7.3空白基质溶液的制备 将阴性冷冻尿液样品融化混匀,取部分样品以转速4000r/min离心10min 然后,量取5ml.(精 确到0.01mL)于15ml具塞离心管中 按7.1.2和7.1.3操作 7.4测定 7.4.1液相色谱条件 色谱柱:InertsilC，54m,150mm×2.1mm(内径)或相当者; a 流动相:0.1%乙酸水溶液十乙睛(62十38); bb 流速;:0.3mL/min; e 色谱柱温度:35C d 进样量:20l 7.4.2质谱条件 离子源;ESI,正模式 a bb 雾化喷嘴压力;0.24MPa; 干燥气流量:9.0L/min; e 干燥气温度:350C; d e 毛细管电压,去簇电压、碰撞电压等电压值应优化至最优灵敏度 检测离子对见表1 表1四种被测物的保留时间母离子和子离子 被测物 保留时间/min 母离子(m/2) 子离子(m/ B群勃龙 6.5 271 253" 199 271 -群勃龙 7.2 199 253" 19-乙烯去甲睾酬 275 25？” 239 i-19-乙烯去甲睾酬 1.4 275 257" 239 ep 定量离子 7.4.3液相色谱-串联质谱测定 7.4.3.1定性测定 每种被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同实验条件下,样品中待测物质的保留时间， 与基质混合标准校准溶液中对应的保留时间偏差在士2.5%之内;且样品谱图中各组分定性离子的相对 丰度与浓度接近的基质混合标准校准溶液谐图中对应的定性离子的相对丰度进行比较,偏差不超过 表2规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许误差 >20~50 >10~20 相对离子丰度 >50 10 允许的相对误差 士20 士25 士30 士50 7.4.3.2定量测定 在仪器最佳工作条件下,对基质混合标准校准溶液进样,以峰面积为纵坐标,基质混合校准溶液浓 度为横坐标绘制标准工作曲线,用标准工作曲线对样品进行定量,样品溶液中待测物的响应值均应在仪 器测定的线性范围内 上述色谱和质谱条件下,标准品选择离子质量色谱图参见图A.1 本标准的添加回收率数据参见附录B 本标准的添加回收率数据参见附录B. 7.5平行试验 按以上步骤,对同一试样进行平行试验测定
GB/T20761一2006 7.6回收率试验 吸取适量混合标准工作溶液,用空白基质溶液(7.3)稀释成所需浓度的标准校准溶液 阴性样品中 添加标准溶液,按7.2操作,测定后计算样品添加的回收率 结果计算 试样中被测组分残留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算 1000 -x量 X= 1000 式中 -试样中被测组分残留量,单位为微克每开(g/L) X 从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); -样品溶液最终定容体积,单位为毫升(mL) V 样品溶液所代表最终试样的体积,单位为毫升(mL) 精密度 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,重复性和再现性的值 以95%的可信度来计算 重复性 在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,被测物的含量范围及重 复性方程见表3 如果差值超过重复性限,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 9.2再现性 在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,被测物的含量范围及再 现性方程见表3 表3四种分析物的含量范围及重复性和再现性方程 被测物名称 含量范围/g/L 重复性限r 再现性限R 卜群勃龙 240 lgr=0.923lgm-0.879 lgR=0.871lgm-0.546 在群勃龙 240 lgr=0.828lgm一0.820 lgR=0,863gm一0,571 19-乙烯去甲睾酮 r=0.711l 一0.831 原R-0.487 240 lg" lgm gm一0,606 epi19-乙烯去甲睾丽 尸=0.708lg朋-0.716 R=0.984lgm一0.881 240 lgr lg 注:m为两次测定结果的算术平均值
GB/T20761一2006 附 录 A 资料性附录 标准物质选择离子LC-MIS-MS图 -群勃龙、?群勃龙、19-乙烯去甲睾酮和epi-19-乙烯去甲睾酮标准品的选择离子LC-MS-Ms图,见 图A.1 lntene x1o° 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 1/min' -群勃龙 -a-群勃龙; -19-乙熔去甲睾酮; -epiF-19-乙希去甲睾酮 图A.1让-群勃龙-卜-群勃龙19-乙端去甲睾酮和ep-19-乙燥去 甲睾酮标准品的选择离子LcC-MS-Ms图 附录 B 资料性附录 回 收率 四种分析物的添加浓度及其平均回收率的试验数据,见表B.1 表B.1四种分析物的添加浓度及其平均回收率的试验数据(n=10 分析物的回收率/% 添加水平/ oasL) 群勃龙 群勃龙 19-乙婚去甲攀酬 epi19-乙婚去甲睾翻 77.5 84.0 74.0 82.5 85.6 79,0 80.8 79.6 77.9 77.5 72.8 77.8 0