金、银纳米颗粒材料生物效应的透射电子显微镜检测方法

金、银纳米颗粒材料生物效应的透射电子显微镜检测方法

国家标准 GB/T34168一2017 金、银纳米颗粒材料生物效应的 透射电子显微镜检测方法 Testmethodofgoldandsilvernanopartielematerialsbologiealefleethy ransmissioneleetronmicroscope 2017-09-07发布 2018-08-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/34168一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国微束分析标准化技术委员会(SAC/TC38)提出并归口 本标准起草单位:人民解放军第二军医大学、国家纳米科学中心 本标准主要起草人:杨勇骥、汤莹、葛广路、王孝平
GB/T34168一2017 引 言 金银纳米颗粒材料的广泛应用是否会对生物系统造成危害目前还不清楚 造成此种情况的主要 原因,一是对金、银纳米颗粒材料的生物效应不明确,包括;是否能进人生物体,如何进人生物体,进人生 物体后是否影响生物体的功能;二是对金、银纳米颗粒材料的测试缺乏统一的技术及测试标准,难以明 确金、银纳米颗粒的真正尺寸;三是金、银纳米颗粒材料对生物体的安全性效应测试也无标准可寻,造成 纳米材料对生物体安全性的不明确 因此,建立这三方面的研究体系是纳米材料在生命科学研究及应 用的关键,准确地检测金、银纳米颗粒材料对细胞超微结构的影响是研究金、银纳米颗粒材料生物效应 的重要基础 IN
GB/34168一2017 金、银纳米颗粒材料生物效应的 透射电子显微镜检测方法 范围 本标准规定了用透射电子显微镜(以下简称透射电镜)检测含有金,银纳米颗粒材料的生物试样超 微结构的技术和规范 本标准规定的各项准则,主要适用于透射电子显微镜对金、银纳米材料的生物效应检测分析 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 2.1 edamdsilernapartele 金、银纳米颗粒 尺度小于100nm的Au、Ag颗粒 2.2 金、银纳米颗粒团聚体goldandsilvernanopartielecoacerate 处于团聚态的Au,Ag纳米颗粒 2.3 生物效应biologicaleffeet 生命过程因纳米材料的介人而产生的生理功能生化功能及形态结构的变化 2.4 生物效应检测biolneiteallerettest 采用生物学,物理学、化学,毒理学与医学等领域的实验技术对纳米材料的生物效应进行检验测量 2.5 生物薄试样thinbiologicalsample 生物薄试样是指制备成适宜于透射电镜观察的生物试样,厚度通常为100nm以下 基本原理 金、银纳米颗粒的表面理化特性使其在常态下处于团聚态,而团聚的金、银纳米颗粒材料尺度并不 全是纳米级,需采用物理或化学法将其分散成具有纳米尺度的颗粒 经分散后的金、银纳米颗粒与生物 体接触,进行其生物效应研究 与金、银纳米颗粒接触后的生物体,需采用生物组织或细胞的超微结构 制样方法,将其制成生物薄试样,然后在透射电镜下检测金、银纳米颗粒作用于生物体后引发的细胞及 细胞器的超微结构变化,以确定金、银纳米颗粒的生物效应 仪器设备,试剂和环境条件 4.1仪器设备 4.1.1透射电子显微镜
GB/T34168一2017 4.1.2X射线能谱仪 4.1.3超薄切片机 4.1.4涡旋振荡仪 4.1.5超声波清洗仪 4.1.6制刀机 4.1.7玻璃刀或钻石刀 4.1.8恒温烘箱(30C一70C. 4.2试剂 4.2.1戊二醛 4.2.2多聚甲醛 42.3磷酸缓冲液 424四氧化饿 4.25乙醉(分析纯》 426丙啊(分析纯) 4.2.7环氧树脂 4.2.8醋酸双氧铀 4.2.9枸橡酸铅 4.3环境条件 4.3.1透射电镜,x射线能谱仪 4.3.1.1电源电压及颗率应稳定(220士22)V,(50士1)Hz 4.3.1.2电镜室相对湿度小于60% 4.3.1.3电镜室温度(20士5)C 4.3.1.4具备仪器专用地线,接地电阻值参照仪器说明书的要求 4.3.2超薄切片机 4.3.2.1切片室应为超薄切片专用房间 4.3.2.2切片室相对湿度小于60% 4.3.2.3切片室温度(20士5)C 4.3.2.4电源电压(220士22)V 试样制备 5 5.1金、银纳米颗粒团聚体分散 根据生物效应检测的要求,将金,银纳米颗粒材料与细胞培养基或0.9%(9g/L)生理盐水(NaCl水 溶液)按所需的比例充分混和,涡旋振荡3nmin后,再放人超声波清洗仪中分散 注建议分散的条件;水温25C一30C;超声波功率300w;频率(40士4)kHa;超声分散3次,每次时间1o min 5.2金、银纳米颗粒 5.2.1将已分散,不同浓度的金、银纳米颗粒悬液滴在覆有支持膜(一般用火棉胶或For rmvar 膜)的透 射电镜专用载网上,也可用微栅
GB/34168一2017 5.2.2将滴有金、银纳米颗粒悬液的电镜专用载网放人恒温烘箱中,60C烘烤2h 5.3含有金、银纳米颗粒的生物组织(简称生物组织 5.3.1取材:将生物组织在固定液(4C)中迅速切成小于1mm的小块 5.3.2前固定:将1mm的生物组织浸泡在20倍体积、4C的2%或3%(体积分数)戊二醛固定液中 固定1h一4h 配制戊二醛固定液可参考附录A 5.3.3漂洗用磷酸缓冲液充分漂洗 配制磷酸缓冲液可参考附录B 5.3.4后固定:将1 的生物组织浸泡在1%(10g/L)俄酸固定液中,4C固定2h 配置四氧化俄 mm 固定液可参考附录C 5.3.5脱水;用乙醇和丙酮梯度脱水 建议乙醇和丙酮梯度脱水的顺序为:30%、50%、70%,90%(体 积分数)乙醇各一次;90%体积分数)丙酮1次;l100%(体积分数)丙酮3次;每次10min15min 5.3.6浸透与包埋;在按比例配制好的环氧树脂Epon812包埋剂中浸透后,在胶囊(或硅胶包埋板)内 进行包埋 建议浸透顺序为,丙酮包埋剂(浸透时间):l:1(1h2);l:2(12h);纯包埋剂(1h). 环氧树脂Epon812包埋剂配制比例可参考附录D的表D.1 5.3.7聚合;在恒温烘箱内按以下顺序进行聚合,37C保持12h;60保持36h,形成包埋块 5.3.8 修块与定位;包埋块在进行超薄切片之前,将分析部位修成易于超薄切片的形状 nm100nm 5.3.9超薄切片:采用超薄切片机将已修好的包埋块切成超薄切片,厚度一般要求在501 染色;采用醋酸双氧铀和柠檬酸铅对超薄切片进行双重金属染色后待检 5.3.10 5.3.11用于X射线能谱仪分析的生物薄试样,不能进行染色 注，生物组织;通过呼吸道吸人,消化道挺人或注射 ,植人、细胞培养等方法使金,银纳米颗粒进人生物细胞或组织 计、 5.4含有金、银纳米颗粒的培养细胞 5.4.1前固定;用橡皮刮将细胞从培养皿底部刮下或采用胰酶消化下来,低速离心800g,5min)成小 团块,弃上清液,沿管壁加人2%(体积分数)戊二醛和2%20g/L)多聚甲醛混合固定液,吹散,放人 4c冰箱1h4h 5.4.2细胞凝块:将细胞用磷酸缓冲液漂洗3次,每次5min,离心后加人血浆,使细胞与血浆混匀后离 心 ,弃上清,沿管壁加人3%戊二醛固定液,放人4C冰箱12h,形成细胞凝块,然后将细胞凝块切成小 于1mm的小块 5.4.3用磷酸缓冲液充分漂洗 5.4.4后固定;将充分漂洗后的细胞团块浸没于1%(10g/L)饿酸,放人4C冰箱2 5.4.5脱水(同5.3.5). 5.4.6浸透与包埋(同5.3.6) 5.4.7聚合(同5.3.7) 修块(同5.3.8) 5.4.8 5.4.9超薄切片(同5.3.9) 5.4.10染色(同5.3.10) 5.4.11用于x射线能谱仪分析的生物薄试样,不能进行染色 测量方法 6.1测量前的准备 6.1.1透射电镜准备工作 6.1.1.1开机,抽真空至电镜正常工作所需的高真空后再稳定30min以上
GB/T34168一2017 6.1.1.2选择测试生物薄试样所需的加速电压,建议检测生物薄试样所需的加速电压选择在60kV 120kV之间 6.1.1.3调节电子枪的灯丝电流,使束流处于稳定饱和状态 6.1.1.4对电子光学系统进行对中调整,尽可能消除聚光镜象散和物镜象散,使透射电镜处于最佳工作 状态 6.1.2X射线能谱仪准备工作 参照GB/T18873. 6.2测量步骤 6.2.1金、银纳米颗粒 6.2.1.1将已分散及干燥的金或银纳米颗粒薄试样放人透射电镜 6.2.1.2在低倍(3000倍一4000倍)下寻找合适的试样部位,要求被分析试样区无破损、无污染 6.2.1.3在高倍(30000倍50000倍左右)时观察金、银纳米颗粒的分散情况,测量金、银纳米颗粒的 尺寸并记录图像 6.2.2含有金、银纳米颗粒的生物薄试样 在低倍(小于4000倍)下寻找合适的生物薄试样部位,要求被分析试样区无破损,无污染、无 6.2.2.1 震颤条纹 将确定的试样区置于透射电镜的观察中心 6.2.2.2 6.2.2.3逐步增加放大倍数(一般放大倍数在10000倍一30000倍即可,少数需放大30000倍以上). 寻找细胞内外,细胞器内外有无金,银纳米颗粒 6.2.2.4分析金、银纳米颗粒分布的位置,建议采用x射线能谱仪分析对金、银纳米颗粒进行定性分 析,分析方法可参考GB/T18873 6.2.2.5注意区分样品制备过程中引人的污染颗粒物和金、银纳米颗粒，无法判别时,必须采用x射 线能谱仪分析对污染颗粒及金、银纳米颗粒进行定性鉴别分析,分析方法可参考GB/T18873 6.2.2.6消像散,聚焦后记录图像 检测报告 分析结果报告可参照GB/T27025,应包括以下信息: 分析报告的唯一编号; a 试样名称; b 送样人姓名,单位和地址; c 试样的接收日期 d 分析仪器及其工作条件; 分析结果和必要的说明: 检测人签字; 8 h 分析报告负责人的签字; 分析报告的页码 发布分析报告的实验室名称和地址; j k 分析报告的日期
GB/34168?2017 ? A ?? ??? 2.0%???(??,pH7.3) A.1 ?0.2mol/L??(pH7.350mL,?25%???8mL,?? 100mL?? A.23.0%?????,pH7.3) ?0.2mol/L??(pH7.3)50mL,?25%???12mL,?? 100ml?? ?:???á
GB/T34168?2017 ? B ??) ?? B.10.2mol/L??(Sorense?) A?0.2nmol/L?? NaH,POH,O 27.60g NaH,PO2HO 31.21g ??1000mL,? B?0.2mol/?? Na,HPO2H,O 35.61g 71.64g Naa.HPO12HO ??1000mL,? B.1?A?B??,pH B.10.2mol/1???ο pH A?/ml B?/ml 7.0 39 61 33 67 7.1 7.2 28 72 7.3 23 7 19 7.4 81 16 7.5 84 B.20.1mol/L?? ?0.2mol/??100ml,??100mL,,pH
GB/34168一2017 录 附 C 资料性附录 四氧化锻固定液配制 C.1配制2%四氧化锻贮存液 将装有四氧化锻的安瓶(共2g)洗净,用玻璃划割器刻痕,再用双燕水冲洗几次,放人洁净棕色广口 玻璃瓶内,加100mL双蒸水,用洁净玻璃棒捣破安瓶 然后用封口膜将广口玻璃封口,贴上标签,置于 干燥器中,4C保存备用 C.2配制1%四氧化锻固定液(磷酸缓冲液,pH7.3) 等量0.2mol/L磷酸缓冲液(pH7.3)与2%四氧化饿贮存液混合,现配现用
GB/T34168一2017 附 录 D 资料性附录) 环氧树脂Epon812包埋剂配制 环氧树脂Epon812包埋剂配制参见表D.1 表D.1环氧树脂Epon812包埋剂配制比例参考表 Epon812 MNA DDSA DMP-30 总量 0.l6ml 5g 3g 2g 10ml. 10g 6g 4g 0.32ml. 20ml 15g 9g 6g 0,48ml 30ml 注1:环氧树脂Epon812包埋剂配置顺序;DDSA MNA -Epon812 IDMP30 注2;DDsA是十二婉基琥珀酸f(Dodecenylsuccinicanhydtride)的简称 它是一种可得到软性包埋块的长链脂 肪族分子 MNA是甲基内次甲基二甲腹酥(MethylNadlicanhydhnid)的简称,又称六甲酸肝 它有两个链环,能获得较硬的 包埋块 DMP30是2,4,6-三(二甲基氮基甲基)苯盼[2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)pheo]的简称 它能加速固化 过程
GB/34168一2017 参考文献 [1]GB/T18873生物薄试样的透射电子显微镜-X射线能谱定量分析通则 [[2]GB/T27025检测和校准实验室能力的通用要求

金、银纳米颗粒材料生物效应的透射电子显微镜检测方法GB/T34168-2017

随着金、银纳米颗粒应用的广泛，它们的生物效应问题也越来越受到关注。近年来，透射电子显微镜成为研究金、银纳米颗粒生物效应的重要手段之一。

透射电子显微镜是利用高能电子束穿透样品而产生影像的一种显微镜。对于金、银纳米颗粒等纳米材料，透射电子显微镜可以观测其形貌、晶体结构以及分布情况等信息。同时，透射电子显微镜还可以观测金、银纳米颗粒在生物体内的位置、形态等信息，从而研究其生物效应。

在透射电子显微镜检测金、银纳米颗粒时，需要注意样品制备、操作条件等因素。GB/T34168-2017标准规定了一系列透射电子显微镜检测方法，包括样品处理、显微镜参数设置、成像条件等。根据这些方法，可以获得高质量的金、银纳米颗粒透射电子显微镜图像。

除了透射电子显微镜，还有其他手段可以研究金、银纳米颗粒的生物效应，如扫描电子显微镜、原子力显微镜等。不同的手段可以提供不同的信息和视角，相互印证，进一步深入研究金、银纳米颗粒的生物效应。

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