国家标准 GB/T18645一2020 代替GB/T18645一2002 动物结核病诊断技术 Diagwstietechniquesforanimaltubereulosis 2020-12-14发布 2020-12-14实施国家市场监督管理总局发布国家标涯花管理委员会国家标准
GB/T18645一2020 目次前言引言范围 2 规范性引用文件 3 缩略语临床诊断 4.1流行特点 4.2临床症状 4.3病理变化细菌学检查 5.1器材 5.2试剂 5.3病料的采集、,运送与处理 5.4染色镜检 5.5分离培养和生化鉴定结核菌素皮内变态反应试验 6.1器材 6.2试剂 6.3牛分枝杆菌PPD皮内变态反应 6.！禽分枝杆菌PPD皮内变态反应 6.5其他动物结核皮内变态反应 PCR检测 7.1器材 7.2试剂 7.3采样及样品处理 7.4PCR扩增反应 7.5电泳检测PCR扩增产物 7.6质控结果分析及判定 7,7 7.8PCR检测结果的确证 8 yY干扰素(IFN-)体外检测法(体外IFN-丫释放试验检测法 8.1器材 8.2试剂 8.3操作方法诊断结果判定
GB/T18645一2020 附录A资料性附录)试剂的配方 17 附录B资料性附录标本消化浓缩法 18 附录c规范性附录采样及样品处理(PCR检测用 20 附录D资料性附录DNA提取液 21 附录E资料性附录常规PCR扩增产物核酸序列 22 附录F规范性附录样品采集、包装和运输的要求 I
GB/T18645一2020 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准代替GB/T18645一2002《动物结核病诊断技术》与G;B/T18645一2002相比,主要技术内容变化如下 -增加了引言; -增加了规范性引用文件(见第2章) -增加了缩略语(见第3章); -增加了临床诊断方法,包括流行特点临床症状和病理变化(见4.1、4.2和4.3); -增加了警示内容,对于剖检、采样及实验室开展相关病原检测部分及实验室接触有毒物质部分给以警示(见4.3); -增加了其他动物皮内变态反应(见6.5); 增加了PCR检测(见第7章); -增加了子干扰素(FN)体外检酬法(见第8章》增加了诊断结果判定(见第9章); 删除了动物接种试验的内容(见2002年版的2.3.l) 增加了常规PCR扩增产物核酸序列(见附录E); 增加了样品采集,包装和运输要求(见附录F). 请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由农业农村部提出本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAc/Tc181)归口本标准起草单位;兽医药品监察所、动物卫生与流行病学研究中心本标准主要起草人;朱良全、丁家波、沈青春、孙明军、毛开荣、魏荣、许冠龙、冯宇本标准所代替标准的历次发布版本情况为 GB/T186452002
GB/T18645一2020 引言动物结核病是由分枝杆菌属的细菌引起的一种慢性、人兽共患性传染病,在全世界范围内严重威胁人类健康并影响畜牧业发展分枝杆菌属主要由结核分枝杆菌复合群、麻风分枝杆菌以及非结核分枚杆菌所组成而牛分枝杆菌、结核分枝杆菌是结核分枝杆菌复合群的成员,禽分枝杆菌属于非结核分枝杆菌成员牛结核病是国家二类动物疫病,也是《国家中长期动物疫病防治规划(2012一2020年))中16种优先防治的国内动物疫病之一,其病原主要为牛分枝杆菌牛分枝杆菌的宿主谱广,几乎包括所有的温血脊椎动物除牛最易感外,还可感染鹿、猪等多种动物;结核分枝杆菌主要导致人结核病,但也可感染牛;禽分枝杆菌禽亚种主要引起禽结核病动物结核病主要通过呼吸道和消化道感染,可侵害多种动物,家畜中奶牛最易感,其次为黄牛、耗牛,水牛、猪和家禽,野生动物中以鹿较为常见该病临床上主要特征是病程缓慢,渐进性消瘦、咳嗽、衰竭,并在多种组织器官如肺、肝,脾和肠道等)形成肉芽肿和干酪样钙化结节近年来国内外对动物结核病防控十分重视,如发病率高、危害较为严重的牛结核病被世界动物卫生组织(OIE)列为必须通报疫病,也是国际贸易必检对象随着国际贸易的蓬勃发展,动物结核病可在人及多种动物间传播,对畜牧业及公共卫生安全危害严重目前我国采用的动物结核病的诊断技术国家标准为GB/T18645一2002《动物结核病诊断技术》,其受当时知识和技术条件所限,内容已不能满足当前动物结核病诊断、检疫检测需求兽共患性动物结核病诊断的国家标准,缺少必要的生物安全要求,以及流行病学、临床症状和病理变化等临床诊断的相关内容 2)诊断方法涉及动物接种实验内容,因确诊时间长至少个月和动物福利的因素,国际上现已很少使用 3)诊断方法缺少新的通用成熟技术(如PCR,体外检测y干扰索法等) 4)需要对标准中涉及的烟酸试验或硝基苯甲酸试验的生化方法进行规范统如GB/T18645-2002《动物结核病诊断技术》与 sN/T1310-2011《动物结核病检验检疫技术规范》中涉及生化试验方法不统一前者采用烟酸试验毒性较大,而后者采用对硝基苯甲酸试验相对安全 5)需要增加适用范围,以满足出人境检验检疫工作发展的需要因此,修订完善适用于我国动物结核病诊断的国家标准,对于临床兽医、检验检疫等科研工作者及时、准确做好诊断,从而对疫病防控和疫情处置采取快速、合理有效的应对措施,意义重大 IN
GB/T18645一2020 动物结核病诊断技术范围本标准规定了动物结核病的临床诊断、细菌学检查、皮内变态反应、PCR和y-干扰素(IFN-)体外检测的技术方法、操作程序和判定标准本标准适用于动物结核病的诊断,其中流行特点、临床症状、病理空化以及皮内变态反应适用于动物结核病的临床诊断;细菌学检查中染色镜检适用于动物结核病病原学初步诊断,细菌学检查中分离培养和生化鉴定、病原分离和PCR试验适用于动物结核病病原学确诊;y-干扰素(IFN-7)体外检测法适用于牛结核病的辅助诊断规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T18088出人境动物检疫采样 GB19489实验室生物安全通用要求缩略语下列缩略语适用于本文件 forAnimalHealth OIE;世界动物卫生组织(worldOrganization PPD:提纯蛋白衍生物(PurifiedProteinDerivative IU:国际单位(InternationalUnit PCR;聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction) -linkked ELISA;酶联免疫吸附试验(Enzyme- lmmunosorbentAssay TCH:嚓吩盼-2-梭酸胁培养基(Thiophen-2-carb hoxsyleAcidHHydhaideo) FN-y;伽马干扰素(Gammalnterferon) PNB;对硝基苯甲酸(PnitrobenzoicAcid) DNA;脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAeid NTP;脱氧核苷三磷酸(DosyRibonucleosideTrphosphate) EDTA:乙二胺四乙酸(EthyleneDiamineTetraaceticAcid 临床诊断流行特点 A 多种动物对牛分枝杆菌、结核分枝杆菌、禽分枝杆菌等易感,动物中奶牛最易感,其次为黄牛、托牛、水牛、猪和家禽,野生动物中以鹿较为常见结核分枝杆菌主要侵害人少见于牛、猪;牛分枝杆菌主要侵害牛,亦可感染人、绵羊、山羊、猪及犬;禽分枝杆菌主要侵害家禽和水禽,其中鸡和鸽最易感染,鹅和鸭次之,牛、猪和人也可感染实验动物中,豚鼠对牛分枝杆菌和结核分枝杆菌敏感,对禽分枝杆菌有抵抗力,通常只能形成局部病灶;家兔对禽分枝杆菌高度敏感,对牛分枝杆菌敏感,结核分枝杆菌虽可使家
GB/T18645一2020 兔肺部形成少量病灶,但可趋于痊愈而不致死本病主要通过呼吸道和消化道感染,也可通过交配感染污染的饲草饲料通过消化道感染也是一个重要的途径该病可发生在动物的任何年龄,雌性动物感染率高于雄性 4.2临床症状感染通常呈慢性经过,病初症状不明显,当病程逐渐延长,则症状逐渐显露由于患病器官不同,症状亦不一致: 牛结核病常表现为肺结核、乳房结核、淋巴结核,有时可见肠结核,生殖器结核,脑结核、浆膜结 a 核及全身性结核 b禽结核病常表现贫血、消瘦,鸡冠萎缩以及产蛋停止等病禽可因衰竭或肝变性破裂而突然死亡鹿结核病症状与牛结核病基本相同猪结核病多表现为淋巴结核,最常发病部位为颌下、咽、颈及肠系膜淋巴结;肺、肝、肠、胃等结 d 核时主要表现消瘦、咳嗽、气喘等症状肠道有病灶时则可能发生下痢绵羊及山羊结核病常不表现明显的临床症状,往往在屠宰后才被发现,体内淋巴结可见结核病灶 4.3病理变化警示对本病剖检采样过程中应防止病原微生物扩散和感染相关操作应符合GB/T18088和 GB19489的规定根据结核病引起动物机体病理变化的差异,可将其分为增生性和渗出性结核两种,有时两种病灶同时存在当机体抵抗力强时,对结核菌的反应常以细胞增生为主,形成增生性结核结节,即由类上皮细胞和巨细胞集结在结核菌周围形成特异性的肉芽肿,外周是一层密集的淋巴细胞和成纤维细胞从而形成非特异性肉芽组织当机体抵抗力低时,则以渗出性炎症为主,即在组织中有纤维蛋白和淋巴细胞的弥漫性沉积,随后发生干酪样坏死、化脓或钙化这种变化主要见于肺和淋巴结 S 细菌学检查 5.1器材 I级生物安全柜、恒温培养箱、冰箱(2笔8笔，一15C以下、离心机离心力可达2000g、显微镜 5.2试剂除特别规定外,所用化学试剂均为分析纯溶液与培养基:4%硫酸、3%或4%氢氧化钠溶液、5%~10%盐酸溶液、氢氧化钠消化液,0.1nmol/L柠檬酸钠溶液、安替福民(antiformin)溶液、甘油蛋白、姜-尼民(Zieh1Nelseen)抗酸染色液,对硝基苯甲酸 PNB)培养基、PBS(1/15mol/L)缓冲液,改良罗氏(L.owenstein-Jensen，L-J)培养基、吐温-80(Twee en- 80)水解试验溶液硝酸盐还原试验溶液,0.12%尿素溶液,0.1%盼红指示剂、嚓吩-2-梭酸阱(TCH)培养基配制方法参见附录A 5.3病料的采集、运送与处理 5.3.1病料的采集病料的采集,包括以下内容
GB/T18645一2020 -对于病、死动物,应采集其淋巴结及病变组织器官(如;肺、肝、脾等)作为细菌学检查材料 -对于怀疑有呼吸道结核、乳房结核、泌尿生殖道结核、肠结核的活畜,应相应采集其痰、乳、精液、子宫分泌物、尿和粪便作为细菌学检查材料对于皮内变态反应试验阳性,但尸检无病理学变化的动物,应采集其下颌,咽后、支气管、,肺(特别是肺门淋巴结、纵隔及一些肠系膜的淋巴结作为细菌学检查材料 5.3.2病料的运送样品应封装在无菌的洁净容器或样品袋内冷藏运送如当天无法送达实验室的,应予冷冻后运送当无法提供冷冻条件时,可在病料中加人明酸,使其终浓度为0.5%,但样品处理保存时间不超过1周样品采集、包装和运输详细要求应按附录F的规定执行 5.3.3病料的处理 5.3.3.1硫酸消化法此法适用于痰、尿,粪和病变组织等的处理处理前,病变组织先按常规方法研磨或匀浆制成乳剂将痰,尿,粪或病变组织等按1:5(样品;溶液,质量浓度)加人4%硫酸溶液充分混合,然后置37C作用 1h一2h,经1000片离心30nmin,弃上清液,取沉淀物涂片镜检,培养;也可用硫酸处理后,在沉淀物中滴加3%氢氧化钠溶液中和,然后涂片镜检或培养硫酸消化法具体操作参见附录B的B.2 5.3.3.2氢氧化钠消化法此法适用于痰、尿,粪和病变组织等的处理消化处理前,病变组织先按常规方法制成乳剂将被检的痰尿,粪便或病变组织按1:5(样品;溶液,质量浓度)的比例加人氢氧化钠消化液中,混匀后 7作用2h一3h,然后无菌滴加5%盐酸溶液(参见A.3)进行中和,将样本的pH值调到6.8左有(此时显淡黄绿色),以1000g,离心15nmin一20min,弃上清液,取沉淀物涂片镜检或培养对痰液的消化浓缩还可采用以下处理方法;取4%氢氧化钠溶液50ml,0.1mol!/I 柠檬酸钠 50mlN-乙酰-l-半胱氨酸0.5g混合将上述混合液与痰液按1;2的比例加人,作用24h48h,以 000g离心15min,取沉淀物涂片镜检或培养氢氧化钠消化法具体操作参见B.3 5.3.3.3安替福民(antiformin)沉淀浓缩法此法适用于痰、乳、精液和子宫分泌液等处理将被检样品置于试管中,加人3倍一4倍量的15%~ 20%安替福民游液,充分摇匀后37C作用1h,加1倍一2倍量的灭菌蒸细水,摇匀.100 离心 20min30min,弃上清液,沉淀物加蒸僧水恢复量后再离心一次,取沉淀物涂片镜检、培养安替福民 antiformin)沉淀浓缩法具体操作参见B.4 5.4染色镜检 5.4.1涂片先在玻片上涂布一层薄甘油蛋白,然后吸取处理好的样品滴加其上,涂布均匀如被检样品为乳汁 nmin2min 等含脂肪较多的材料,在涂片制成后,滴加二甲苯或乙腿,使其覆盖整个涂片,摇动1" 脱脂后倾去,再滴加95%酒精,以除去二甲苯,待酒精挥发后即可染色甘油蛋白的配制方法参见A.4 5.4.2姜-尼氏(Zieh-Neelsen)抗酸染色涂片经火焰固定后,滴加苯酚复红染色液,使其覆盖整个涂片之后,将玻片置于火焰上加热至出现燕汽但不产生气泡,保持热染色5min 如热染过程出现染色液干凋,应及时添加,适量补充充分水洗后滴加3%盐酸酒精脱色液,脱色30s一60s,至无色素脱下为止充分水洗,以骆氏美蓝染色液复
GB/T18645一2020 1 染 min 水洗,吹干,镜检姜-尼氏(Ziehl-Neelsen)抗酸染色配制方法参见A.5 5.4.3结果判定在显微镜下,可见细长平直或微弯曲的红色杆菌,长1.5m一54m,宽0.2Hm一0.5pAm即为阳性在陈旧培养基或干酪性淋巴结内,偶尔可见长达10m或更长菌体否则判为阴性 5.5分离培养和生化鉴定 5.5.1分离培养将经过处理的病料接种到配氏培养基(参见A.6)或改良L-J培养基(参见A.7)上,每份样品同时接种2管一4管,在37C培养1d后,以熔化的石蜡封口,继续培养至少8周(一般10周12周结核分枝杆菌在固体培养基上生长,菌落干燥、粗糙,呈白色、,黄色或橙色牛分枝杆菌在固体培养基上菌落湿润、略显粗糙,加人1%的丙酮酸钠可促进其生长禽分枝杆菌在固体培养基上形成湿润、弥漫状、光滑菌落结核分枝杆菌和牛分枝杆菌在42不生长,禽分枝杆菌可在42C生长 5.5.2生化鉴定 5.5.2.1对硝基苯甲酸(PNB)试验准备PNB培养基参见A.8)1支,改良1-培养基1支,每支培养基接种14g细菌;37C孵育 4周,每周观察一次结果并记录两种培养基上菌落的生长情况牛分枝杆菌、结核分枝杆菌在PNB培养基上不生长,禽分枝杆菌可在PNB培养基上生长;三种菌均可在改良L-J培养基生长 5.5.2.2嚷吩-2-羚酸阱(TCH)抗性试验将细菌接种TcH培养基(参见A.9)和改良LJ培养基,37C培养8周,1周后开始观察,每周观察一次结果并记录两种培养基上菌落的生长情况禽分枝杆菌、结核分枝杆菌可在TCH培养基上生长牛分枝杆菌在TCH培养基上不生长;三种菌均可在改良L-J培养基生长 5.5.2.3尿素酶试验准备两支试管,试管A加人3mLPBS(pH6.7,1/15mol/L)(参见A.10)和1滴0.1%酚红指示剂参见A.11);试管B加人用PBs(pH6.7,1/15mol/L)配制的0.12%尿素溶液(参见A.12)和1滴 0.1%盼红指示剂挑取细菌约5mg移置于试管B中两支试管均置37C培养3d后观察结果管(空白对照)不变色,B管菌液生长使培养基变成红色判为阳性,培养基不变色者判为阴性 5.5.2.4硝酸盐还原试验取细菌约5mg置于装有2mL硝酸盐还原试验溶液(参见A.13)的试管中,充分混匀,置37C水浴2h,滴加1滴2倍稀释的盐酸,2滴0.2%氨基苯磺胺(参见A.14),2滴0.1%N-甲基盐酸二氨基乙烯参见A.15),混匀后观察结果,lmin内呈红色判为阳性,颜色无变化判为阴性 5.5.2.5耐热接触酶试验用生理盐水配制含菌量为10mg/mL的菌液,分装试管,每管0.5mL,分别置于68C水浴20min，冷却后缓缓加人0.5mlL过氧化氢(H.O.)和吐温-80混合液(10%吐温-80加等量30%H.O.),观察结果如有小气泡持续从管底升起判为阳性.否则为阴性 5.5.2.6吐温-80水解试验向吐温-80水解试验培养基(参见A.I6)试管中加人含菌量为10mg/m的菌液0.5ml 3d一5l
GB/T18645一2020 后观察结果如试管内溶液由原来的琥珀色变为桃红色或红色判为阳性,无颜色变化判为阴性 5.5.2.7 生化鉴定动物结核病涉及的分枝杆菌生化试验的判定结果见表1 表1分枝杆菌生化鉴定判定结果对硝基苯甲酸TcH抗性硝酸盐还原耐热接触酶吐温-80水解生化试剂类型尿素酗试验试验试验试验试验试验牛分枝杆菌禽分枝杆菌结核分枝杆菌注;“+”'表示阳性反应;“-”表示阴性反应;“士”表示多数菌株阳性反应,少数菌株阴性反应结核菌素皮内变态反应试验 6.1器材剪毛剪或剃毛器、游标卡尺、一次性无菌注射器(0.5mm×10mm)或其他适用的商品化注射器 6.2试剂 6.2.1牛型PPD 根据使用说明将原液用灭菌生理盐水或稀释用水稀释至使用浓度(20000IU/ml) PPD冻干粉稀释;在无菌状态下吸取一定量的灭菌生理盐水或稀释用水,注人冻干粉玻璃瓶中,充分摇匀后使用,应现配现用 6.2.2 禽型PPD 配制方法同6.2.1,使用浓度(25000IU/mL) 6.3牛分枝杆菌PP皮内变态反应 6.3.1操作方法出生后20d的牛即可用本试验,可单独采用牛型PPD(PPDB),也可同时采用牛型PPD和禽型 PPD(PPDA)进行试验皮内变态反应具体操作和观察步骤为注射部位及术前处理:将牛只进行编号,采用颈侧中部上1/3处或尾根部进行皮内注射,3个 a 月以内的犊牛也可在肩卿部进行对注射部位剪毛,直径约10cm,用卡尺测量术部中央皮皱厚度,做好记录注意,注射部位应无明显的病变注射方法及剂量;牛型和禽型PPD的注射部位应间隔开,在颈部同侧、肩脚部同侧应间隔约 12em15em,或在不同侧进行尾根部采用不同侧(左侧或右侧)无毛的褶皱部进行注射,用 75%酒精消毒注射部位,在皮内注人牛型PD或禽型PPD0.1 mL,牛型PPD不低于2000IU 0.1lml,禽型PPD不低于2500IU/0.lml,或按试剂说明书配制的剂量注射次数和观察反应;皮内注射后经72h判定,仔细观察局部有无热痛、肿胀等炎性反应,并以卡尺测量皮皱厚度,做好详细记录对疑似反应牛应立即在另一侧以同一批PPD同一剂量进行第二回皮内注射,再经72h观察反应结果对阴性牛和疑似反应牛,于注射后96h和
GB/T18645一2020 120h再分别观察一次,以防个别牛出现较晚的迟发型变态反应 6.3.2结果判定牛型PPD单皮内变态反应及牛型PPD和禽型PPD比较皮内变态反应具体结果判定如下牛型PPD单皮内变态反应 a 牛型PPD单皮内变态反应包括颈部注射和尾根部注射颈部注射:注射部位前后出现明显的炎性反应,皮皱厚差值大于或等于4mm,判为阳性;无明显炎性反应,且皮皱厚差值为2" mm4mm,判为可疑;无明显炎性反应,皮皱厚值小于或等于2mm,判为阴性对于已确认感染的牛群,皮试出现任何可触摸或可见的肿胀反应均判为阳性尾根部注射出现可触摸或可见的炎性反应(当出现两侧褶皱部时,注射一侧的褶皱部与对侧的褶皱部厚度差达4mm及以上;当仅出现一侧褶皱部时,其尾褶厚度达8mm及以上)判为阳性,未出现可触摸或可见的炎性反应判为阴性 b)牛型PPD和禽型PPD比较皮内变态反应注射牛型PPD部位的皮皱厚差大于注射禽型PPD部位的皮皱厚差值大于4mm,判为阳性;注射牛型PPD部位的皮皱厚差大于注射禽型PPD部位的皮皱厚差值在4nmm以下,判为可疑;注射牛型 PPD部位的皮皱厚值等于或小于注射禽型PPD部位的皮皱厚,判为阴性 6.3.3复检判为可疑反应的,于42d后进行复检结果仍为可疑或阳性的,判为阳性 6.4禽分枝杆菌PPD皮内变态反应 6.4.1操作方法家禽可在肉辑皮内注射禽型PPD,剂量为每羽0.1mL,约2500IU或按试剂说明书配制的剂量 6.4.2结果判定注射后24h观察判定结果注射部位肿胀,出现硬结、扩展至对侧肉辑和颈部的广泛性水肿等炎性反应,判为阳性;注射部位无肿胀等炎性反应,判为阴性 6.5其他动物结核皮内变态反应鹿、猪、羊等其他中大动物的皮内变态反应试验参照牛的皮内变态反应试验进行判定其中鹿的让射部位为颈侧中部;猪、绵羊在耳根外侧注射;山羊在肩部注射 CR检测 7.1器材 PCR仪、PCR反应管,电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统或紫外透射仪、恒温水浴箱、烘箱、台式冷冻离心机《离心力可达1500),旋祸混匀器、冰箱(2 "C8"C，一20C，一80C)、微量可调移液器 10AL,100AL,1000L)及配套带滤芯吸嘴 7.2试剂 7.2.12×PCR反应液:含TaqPolymerase0.1U/AL,dATP,dTTP,dCTP和dG;TP各500mol/L 20mmol/几Tris-HCL(pH8.3),100mmol/L氯化钾,3mmol/1氧化镁也可采用等效商品化试剂
GB/T18645一2020 7.2.2PCR扩增引物序列动物结核病中涉及的分枝杆菌PCR扩增引物及序列信息见表2 表2分枝杆菌引物名称及序列目标菌名称引物名称引物序列 MBF 上游引物;5'-AcGcGAcGAccTcATATTcc3 牛分枝杆菌 MBR 下游引物1;5'-CAcccAGAAGGcGAACAGAT-3" SB1 上游引物5'-TTccGAATcccTTGTGA3" 结核分枝杆菌 CSB3 下游引物:5'-AGTCGCC(GTGGC'TTCTCTTTTA-3" DnaJ1 上游引物;5'-GACTTCTACAAGGAGCTGGG-3 DnaJ2 下游引物;5'-GAGACCGCCTTGAATCGTTC-3 S1245-1 上游引物:5'-GAGTTGACCGCGTTCATCG-3 禽分枝杆菌 1S1245-2 下游引物:5'-CGTCGAGGAAGACATACGG-3 上游引物5'-GGATTGCTAAcCcAcGTGGTG-3" IS901-1 S901-2 下游引物;5-GcG.AGTTGcTTG.ATGAGcG3 7.2.3灭菌双蒸水 7.2.4电泳试剂;Goldview或其他等效核酸染料,DNA标准相对分子质量(100bp~1kb)、Tris乙酸 TAE)电泳缓冲液,2%琼脂糖凝胶,配制方法参见附录A 7.3采样及样品处理采样及样品处理按附录C的规定执行其涉及的样品采集,包装和运输按附录下的规定执行 7.4PCR扩增反应 7.4.1PCR扩增试剂准备取出2×PCR反应液、引物,在室温下融化,瞬时离心5s后置冰上或采用其他等效商品化PCR 反应试剂 PCR反应混合液的试剂及用量见表3 表3CR反应混合液的成分及用量 olL 试剂 2×PCR反应液 PCR引物(104mol 灭菌双燕水用量每种引物1Al 补充反应体系至24Al 2.5L 可根据需要选择牛分枝杆菌、结核分枝杆菌以及禽分枝杆菌进行PCR检测对于牛分枝杆菌,每个PCR反应混合液中加MB上下游引物(10mol/L)各1AL;对于结核分枝杆菌,每个PCR反应混合液中加csB上下游引物104moalL)各AL,对于禽分枝杆菌,每个PCR反应混合液中加人Dma 上下游引物(104mol/L),IS1245上下游引物(104nmol/L),IS901上下游引物(10Amol/L)各1 7.4.2加模板在上述PCR反应混合液中分别加人已提取好的样品或对照核酸1L,充分混匀 7.4.3CR扩增检测牛分枝杆菌或结核分枝杆菌PCR反应条件:第一步,94C,3nmin;第二步,94C,20s,牛分枝杆菌
GB/T18645一2020 60C或结核分枝杆菌55C,20s,72C,30s,35个循环;第三步,72,1min 禽分枝杆菌PCR反应条件;第一步,96C,2min;第二步,96C,l0s,58C,10s，72C,lmin, 35个循环;第三步,72C,2min 7.5电泳检测rCR扩增产物采用1%琼脂糖凝胶,(Goldview或其他等效核酸染料设DNA标准分子量对照,5V/emm8V/em电泳1h,置紫外透射仪或凝胶成像系统仪上观察,拍照记录检测结果 7.6质控阴性对照无特异性扩增产物,阳性对照有与分子量相符的特异性扩增产物,实验成立 7.7结果分析及判定牛分枝杆菌PCR特异扩增产物分子量为406bp,结核分枝杆菌PCR特异扩增产物分子量为263bp 禽分枝杆菌3条特异PCR扩增产物分子量分别为577bp(IS901基因片段),385bp(IS1245基因片段)140bp(Dna基因片段). 对于牛分枝杆菌PCR检测,样品呈现406bp特异扩增产物,判为牛分枝杆菌阳性;样品呈现263p 特异扩增产物,判为结核分枝杆菌阳性;对于禽分枝杆菌PCR检测,样品同时呈现577bp,385bp和 140bp三条目的条带,则判为禽分枝杆菌阳性样品无特异扩增产物,判为阴性 7.8PCR检测结果的确证必要时,对PCR扩增产物进行测序确证将所测得的序列与标准序列(参见附录E)进行比对,序列吻合(扩增区全序列比对同源性达95%以上)表明确证为阳性 8 y-干扰素(IFN-')体外检测法(体外IN-?释放试验检测法 8.1器材酶标仪(波长450nm)、I级生物安全柜、二氧化碳培养箱或生化培养箱、混匀仪、冰箱(2C8C -15C以下),电子天平、高压消毒锅、微量可调移液器及吸头、一次性无菌离心管(2ml或1.5mL) mL,20mL)或一次性采血针、一次性无菌一次性肝素锂或肝素钠抗凝采血管、一次性注射器(5mL,101 24孔细胞培养板 8.2试剂 PPDB(20000IU/mL),PPDA(25000IU/mL),无菌PBS(0.01nmol/L,pH7.2一7.4)、鼠抗牛 IFN-丫单克隆抗体1D4、100×HRP标记鼠抗牛IFN-Y单克隆抗体4B5、包被缓冲液、封闭液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、洗涤液、TMB底物显色溶液、终止液或等效商品化试剂 8.3操作方法 8.3.1样品准备用采血针或注射器无菌采集全血4mL以上,立刻转移至肝素锂或肝素钠抗凝采血管中,轻轻颠倒混匀3次一5次,18C一25C保存,30h内送达实验室进行刺激培养将抗凝血轻轻颠倒混匀,无菌分装于24孔细胞培养板,每份血液样品分装3孔,每孔加人1.5ml 全血,分别加人0.1ml的PPDB使用工作浓度为:3000IU/mL)、PPDA使用工作浓度为: 2500IU/mL)和Ps(0.01molL,pH7.2一7.4),轻轻振荡混匀,置37C、含5%co培养24h,收集
GB/T18645一2020 上清,立即用于检测,或保存于-15C以下备用或按等效商品化试剂盒要求准备样品 8.3.2 包被用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L,pH9.6)稀释鼠抗牛IFN-y单克隆抗体1D4至1g/mlL,100AL/孔,包被酶标板,2C8C孵育16h. 8.3.3包被后洗涤倾去ELISA板中液体,加人1×PBST洗涤液,250L/孔,振荡洗涤30s,倾去液体,重复洗涤 6次,最后一次轻轻拍干EL.IsA板 8.3.4封闭加人含有3%BSA的PBSs溶液,200AL/孔,2C8C作用12h 8.3.5封闭后洗涤同8.3.3 洗涤后的单克隆抗体包被板可立即使用或用铝箔袋包装,置2C8C保存备用 8.3.6加样前准备将试剂盒中溶液(100×HRP抗牛IFN-丫单抗、阳性对照和阴性对照除外)从2C8C取出后恢复至室温;将20×洗涤液恢复至室温(可在37C水浴中加热5min10min使结晶溶解),然后用双燕水作20倍稀释(10mL20×浓缩洗涤液加人190mL双蒸水),充分混匀 8.3.7加样取单抗包被板(根据样品多少,可拆开分次使用),每孔先加人50L样品稀释液再分别加人 50l检测样品(包括PPDB,PPDA和PBS刺激样品,及阴,阳性对照)充分混匀,封板,22C26C 避光反应601 min 取出反应板,弃去反应液,每孔加人250AL1×洗涤液,洗涤6次,最后1次轻轻拍干 8.3.8加入酶标抗体用酶标抗体稀释液100倍稀释100×HRP抗牛IFN-丫单抗4B5(现配现用,1ml.100×HRP抗牛 IFN-y单抗4B5加人99mL酶标抗体稀释液),100L/孔,22C一26C避光反应60min 取出反应板,弃去反应液,每孔加人250AL1×洗涤液,洗涤6次,最后1次轻轻拍干 8.3.9显色与终止加人底物显色液,100AL/孔,从加人第1孔即开始计时,22C26C避光反应30min 按底物显色液加人顺序,向各孔依次加人50AL终止液,轻轻混匀,10min内用酶标仪测定ODa值 8.3.10结果判定实验成立条件;阴性对照OD0值0.15,阳性对照OD0值>1.0. 判定方法;PPDB,PDA和PEs刺激样品的oDw值分别记作oDa值.mw.oD s0nm 值omD、OD. D,o值m5) 当OD的值p的 oDw值wm>0.1，且oDw值.mw-oDa 、>0.1时,判为牛结核病阳性;当OD0值p OD值e,<0.1,或OD值p 值rp ODa值pN<0.l时,判为牛结核病阴性
GB/T18645一2020 9 诊断结果判定 g.1对于牛,符合第4章,可判为疑似牛结核病;符合第4章,并且第5章,6.3,第7章、第8章四种方法中任何一种牛分枝杆菌结果为阳性,可诊断为牛结核病;符合5.5.1中牛分枝杆菌分离培养并且生化鉴定阳性,或符合5.5.1中牛分枝杆菌分离培养并且第7章PCR检测阳性,可诊断为牛结核病符合 6.3.2a)和b)试验结果阳性,或符合6.3.2a)和第8章试验结果阳性,可按牛结核病处理 9.2对于禽,符合第4章,可判为疑似禽结核病;符合第4章,并且第5章、6.4,第7章三种方法中任何一种禽分枝杆菌结果为阳性,可诊断为禽结核病;符合5.5.1中禽分枝杆菌分离培养并且生化鉴定阳性,或符合5.5.1禽分枝杆菌分离培养并且第7章PCR检测为阳性,可诊断为禽结核病符合6.4试验结果阳性,可按禽结核病处理对于鹿,猪,羊,符合第4章中各自特征,可判为疑似鹿,猪、羊结核病;符合第4章中各自特征,并 9.3 且6.5结果阳性,可诊断为鹿、猪,羊结核病 0
GB/T18645?2020 ? A ?? ?? A.14"%HHSo?? ??350mL,??98%?10mLHso1098%1.84=18.03g),? 450ml,,??HsO???18/450=4% A.23%4%NaoH?? ?NaOH3g4g100ml???,? A.35%?? ?37%?105.6mL,864.9mL???,? A.4?? A.4.1? 20m 20m ?0.4g A.4.2 ?1~2,??,75%??,?,,? 20ml,?;?20mL,??0.4g?м?,??ɡ A.5?-(Zieh-Neelsen)???? A.5.1???? ?????(?100mL95%?3g?)10mL,5%?90mL,? ??? A.5.23%??? ?3ml,95%?97ml,? A.5.3??? ?;0.3g30ml95%? ?:0.01%KOH?1001 m 11
GB/T18645?2020 ? A.6(Petragnane)? A.6.1? ??450ml,18g,?(???)2.6g,??225g,15 ?3弴15?12),40g,2%???30ml A.6.2 ???,??(???),?????40nmin~ 60min n,?,????50???75%?? ),??????????,??С ???(?),Ъ3,?1,165C30min, 2,375C80C30min A.6.3? ??á A.7L-? A.7.1? 2.4 ? g ? 0.24g ? 0.6g DL-?(DL-Asparagin) 3.6g ( 12 g 30 g ?? 1000ml(?30) 20mL 2%??? ? 600mL A.7.2 ???,??,????, ,??1h75%??,,???,??? ???50?,??2%??,???? ,80C30min,37C48h,???á?,4C4 A.7.3? ??á A.8(PNB) ?500mg,10mL???;L?,?500nmg 12
GB/T18645一2020 对硝基苯甲酸的比例添加到培养基溶液中 PNB培养基有商品化培养基,可按其使用说明配制 A.9TCH培养基 1-J培养基 100ml TCH 1mg 将改良L」培养基水浴煮沸,加人rcHH后,充分搅匀分装于试管中 80C灭菌30min后,37 培养48h,若无杂菌污染即可使用 A.10PBS缓冲液1/15mol/L 甲液(1/15mol/I磷酸二氢钠溶液):称取磷酸二氢钠(NaHP(O2H.O)23.87g,加双蒸水溶解，定容至1000ml 121C灭菌20min,4C保存乙液(15mol/L磷酸氢二钾溶液);称取磷酸氢二钾(K.HIPO9.07g,加双蒸水溶解,定容至 1000mL 121C灭菌20min,4C保存将甲液和乙液按32的比例混合即为pH7.0的PBs缓冲液将甲液和乙液按2:3的比例混合,即为pH6.7的PBS缓冲液 A.110.1%酚红指示剂配制方法 A.11.1成分红 0.1g 0.lmol/I(0.4%)NaOH 15ml 85mL 去离子水 A.11.2配制称取0.1g酚红置研钵中,缓慢滴加0.1mol/几NaOH溶液15ml边加边磨,并不断吸出已溶解的酚红液,直至全部溶解,然后加人85m双燕水,颜色为深红，经粗滤纸过滤后使用,室温保存 A.120.12"%尿素溶液尿素 0.12g 燕水 100ml 将尿素溶于水中,用0.224m滤膜过滤除菌,4C保存 A.13硝酸盐还原试验溶液 1/15mol/LpH70磷酸盐缓冲液 100mL 851 硝酸钠 mg 将硝酸钠加人磷酸盐缓冲液中,溶解后112kPa灭菌20mim,分装于试管,每管2ml. 13
GB/T18645?2020 A.140.2%? ?0.2g??,???,100ml A.150.1%N-?? ?0.1gN-??,???,100mL A.16-80? 1/15mol/L,pH7.0λ? 100ml -8o 0.5ml 0.2%?? 2mL -800.2%?)??λ?,,112kPa20min? ?,?2 ?4C?2? ml A.17??? pH6.8?? A?(0.2mol/1.NaHPO?:?NaHPO2H.O15.61g??, 500ml B?(0.2mol/LNaHPO?);?NaHPO12H.O35.82g,??, 500mla ??51mlA?,49mlB?,?100mlpH6.8?? ?2.94g(Na.,C,H,O2H,O),?100mLpH6.8??,? 121C?2C?15min,4C A.18?? 5.3g 15g 16.2g ??,??,1000mL,?121C?2C?15min, 4"C A.190.5mol/LEDTApH8.0) ?186.lgEDTA,?800ml?,??,?pH?8.0 1000mL,?121C?2C?15nmin,档 A.200.01mol/LpH7.6s A?B? 14
GB/T18645一2020 A液(0.2mol/LNaH.PO,溶液);称取一水合磷酸二氢钠(NaH.POH,O)27.6g,或二水合磷酸二氢钠(NaH PO2H.o)31.2g,溶于燕溜水中,定容至1000mL B液(0.2mol/LNaHPO溶液):称取十二水合磷酸氢二钠(NaeHPO12H.O)71.6g,或二水合磷酸氢二钠(NaHPO2H.O)35.6g溶于蒸憎水中,定容至1000ml 称取17g氯化钠,用适量蒸憎水溶解,量取13mlLA液加87ml.B液,用蒸僧水定容至2000ml A..21 TAE电泳缓冲液 10×TAE的配制 Tris 8.4g 11.4mL 冰乙酸 0.5mol/LEDTA 20mL或EDTA3.72g 加水定容至1000ml 使用时,用蒸僧水稀释10倍即为1×TAE电泳缓冲液 A.221%琼脂糖凝胶称取1《琼脂糖粉,加人100mL.1xTAE电谋缓冲液,加热游解,冷却至60,加5LGoldiew 或其他等效核酸染料,混匀 A.230.01mo/L无菌PBSpH7.27.4 称取NaHPO1.42g,Kcl0.2g,NaCl8.0g,KH,PO.0.27g,加双蒸水至800mL,调pH值7.2 7.4,定容至1000ml,高压灭菌或过滤除菌 A.24包被缓冲液pH9.6 称取Na,CO1.59g,NaHCO2.93g加双蒸水至800mL,调plH9.6,定容至1000ml A.2520×浓缩洗涤液称取NaHro28.4w.kKe4e,Nacl10郎.kKH.ro;.4反席于0mL的去离子水中,加人吐温-2010ml,proclin3000.5ml,待完全溶解后用浓盐酸调节pH值至7.4,定容至1000mlL,使用时用双蒸水稀释成1×洗涤液,过滤除菌 A.26样品稀释液 g,proein3000.5mL,加双称取NaeHPO1.42g,KCl0.2g,NaCl8.0g,KH.PO0.27g,BSA108 蒸水至800mL,调pH7.27.4,定容至1000mL,过滤除菌酶标抗体稀释液称取Nae,HPO1.42g,KCl0.2g,NaCl8.0g,KH,PO0.27g,BsA10g,proclin3000.5mL,加双蒸水至800ml,调pH7.27.4,定容至1000 ml,过滤除菌 15
GB/T18645一2020 A.28封闭液称取Na,HPO1.42g,KCl0.2g,NaCl8.0g,KH,PO0.27g，BSA30g,proelin3000.5ml,加双蒸水至800mL,调pH7.27.4,定容至1000mL,过滤除菌 A.29TMIB底物显色溶液 A液;醋酸钠13.6g,柠檬酸1.6g.30%H.O.0.3mL,加双蒸水至500mL,避光保存于2笔 8C B液;EDTA-Na.0.2g,柠檬酸0.95g,甘油50mL,TMB2HCl(用DMsO溶解为10mg/mL 0.2g,加双蒸水定容至500ml,避光保存于2C8C 使用前,将A液和B液等体积混合,立即使用亦可用商品化TMB底物显色溶液 A.30终止液取37%浓盐酸82.8mL加人917.2mL.双蒸水中,混匀,室温保存 16
GB/T18645一2020 附录 B 资料性附录标本消化浓缩法 B.1概述在培养或进行动物试验时,常因污染的杂菌生长较快,使结核分枝杆菌被抑制下列几种消化浓缩方法可使检验标本中蛋白质溶解、杀灭污染杂菌,而结核分枝杆菌因有蜡质外膜而不死亡,并得到浓缩 B.2HSo消化法用4%HSO溶液和病灶组织等按质量比约5:1之比例加人混合,然后置37C作用1h~2h, 经3000g一4000离心30min,弃上清,取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物也可用H,sO消化浓缩后,在沉淀物中加人3%NaOH中和,然后抹片镜检、培养 B.3NaoH消化法 Na(OH消化液配置及标本处理方法如下 a 取NaOH35g40g,钾明矶2g,澳麝香草酚蓝20mg(预先用60%酒精配制成0.4%浓度,应用时按比例加人、蒸馏水1000mL混合,即为NaOH消化液将被检病灶组织与NaOH消化液按量(质量浓度)之比约1;5混合均匀后,37C作用2h3h 然后无菌滴加5%10%HCI溶液进行中和,调标本的pH值到6.8左右此时显淡黄绿色 20 以3000g~4000片离心15min min,弃上清,取沉淀物涂片镜检、培养和接种动物在病料中加人等量(质量浓度)的4%NaOH溶液,充分摇荡5min10min,然后以3000g" 20 离心15min~ min,弃上清,加1滴盼红指示剂于沉淀物中,用2mol/L盐酸中和至淡红色然后取沉淀物涂片镜检、培养 B.4安替福民(antiformim)沉淀浓缩法溶液A:Na.CO12g,漂白粉8g、蒸僧水80ml 溶液B;NaOH15g、蒸憎水85ml 应用时,将A,B两液等量混合,再用蒸馏水稀释成15%~20%后使用,该溶液应存放于棕色瓶内将被检样品置于试管中,加人3倍4倍量质量浓度)的15%一20%安替福民溶液,充分摇匀后 37作用1h,加1倍~2倍量体积分数)的灭菌蒸僧水,摇匀,30004000其离心201 min一30min,弃上清,沉淀物加蒸僧水恢复原量后再离心一次,取沉淀物涂片镜检、培养 17
GB/T18645一2020 附录 C 规范性附录) 采样及样品处理(PCR检测用 C.1 采样工具采样工具需买用1a1笔土2C灭菌15nmm并烘干,或经10t干烤2h灭菌;或买用一次性无菌用等效工具 C.2 采样 C.2.1 血样用无菌注射器或真空采血管,自动物静脉采血,无菌分离血清用无菌注射器或真空采血管,自动物静脉采血,将血液直接滴人抗凝剂中,并立即连续摇动,充分混合抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液,或0.5mol/LEDTA 每mL血液加1mL抗凝剂条件允许时，应优先采集全血,以更有利于富集菌体 C.2.2奶样无菌采集奶液于灭菌的容器中一般以挤出的后段奶液含菌量较多,早晨挤出的奶液含菌量最高 C.2.3痰液动物痰液采集:动物咯痰极少,宜在清晨采集,用橡胶管自口腔伸人至气管内,外接注射器吸取痰液亦可取咳出的痰块 C.2.4组织器官采集动物下颌、咽后、支气管、肺(特别是肺门淋巴结,纵隔和肠系膜淋巴结,以及病变组织器官如;肝,脾等. C.2.5粪便采集混有黏液、血液、黏膜的粪便,或用刮匙从动物直肠深部(约30cm)取少量黏液粪便,盛于灭菌容器中 c.2.6样品的保存和运输待检样品在2C8C保存应不超过24h;-20C保存不超过3个月;-80以下长期保存样品应置于低温、密封的容器内运输 C.3样品处理 c.3.1血样前处理取1ml2ml全血样品,15000g离心10nin,弃上清液;加等体积灭菌双蒸水充分振荡,15000g 18
GB/T18645一2020 离心10min;弃上清液,若红细胞裂解不完全,应采用灭菌双蒸水重复洗涤;收集沉淀物,继续进行核酸提取,或置-20C贮存备用取1mL~2m血清样品,l5000只离心10min;弃上清液,加1mL0.01mol/LpH7.6PBS,充分振荡混匀,15000g离心10min;弃上清液,收集沉淀物,继续进行核酸提取,或置一20C贮存备用 C.3.2奶样前处理取10ml奶液,加100mlTritonX-100,振荡混匀,2500尽离心20min;弃上清液,取沉淀,加 lnmlL.0.01mol/儿LpH7.6PBS,充分振荡混匀;将沉淀悬浮液移人微量离心管,15000离心l0min;弃上清液,收集沉淀物,继续进行核酸提取,或置一20C贮存备用 C.3.3痰液的前处理在痰液样品中加人2倍4倍体积4%氢氧化钠溶液,振荡混匀,室温放置30min,间或振荡混匀使其充分液化(无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全;若液化不完全,可适当再加人少量 4%氢氧化钠溶液直至液化完全);15000片离心10mim;弃上清液,加lmlL0.01mol/LpH7.6PBS,充分振荡混剑500., 离心10min,弃上清液，重复本步骤1次;收集沉淀物,继续进行核酸提取,或置 -20C贮存备用 C.3.4组织样品前处理取适量组织样品(剔除脂肪,被膜),剪碎按15的比例加人柠檬酸钠-磷酸缓冲液(例1迟组织样品加人5nml缓冲液),充分研磨;加等量4%气氧化钠溶液，继续研磨5min10min,使组织液化;移人离心管,充分振荡.75亿温浴0.5h一1h;取上清液(避免吸取粗渣).15000发离心10nmin;弃上清液加等量0.01mol/LpH7.6PBS振荡混匀,使沉淀充分悬浮,15000离心10min,弃上清液,重复本步骤1次;收集沉淀物,继续进行核酸提取,或置一20C贮存备用 C.3.5粪样前处理取粪样1g2g,按1:5的比例加人4%硫酸溶液(例,1g粪样加5mL液体)充分振荡混匀,室温静置0.5h1h;取上层约3ml液体(避免吸取粗渣),5000发离心1nmin,取上清液,15000离心 10min;弃上清液,加等量0.01mol/LpH7.6PBS,振荡混匀.使沉淀充分悬浮,15000离心10min. 弃上清液,重复本步骤1次;收集沉淀物,继续进行核酸提取,或置一20C贮存备用 C.4核酸提取在上述已完成前处理的样品(沉淀物)中加人50L1004LDNA提取液(参见附录D),充分振荡混匀,56C温浴30min,98C100C加热l0min,瞬时离心使液滴聚集管底,加等体积三氯甲炕,振荡混匀.12000尽离心5min,取上清液直接用于PCR或贮存于一80C备用(适用于除粪样外的其他样品) 其中粪样样品还应进行以下步骤;加人等体积异丙醇(一20C预冷),颠倒混匀,放置5min~ l0 min;4C,15000g离心10min,弃上清液,加3倍体积70%乙醇醉(4C预冷),振荡洗涤;4C,15000g 离心10min,弃上清液,室温干燥5min;加人50AL,无DNA酶、无RNA酶水,混匀、溶解核酸,直接用于PCR或贮存于-80C备用或采用等效的商品化核酸提取试剂盒或核酸提取设备 19
GB/T18645一2020 附录 D 资料性附录) DNA提取液含100mmol/1Tris-HCL(pH8.0),0.,01%TritonX-100,2004g/L蛋白酶K 可采用等效商品化试剂 20
GB/T18645一2020 录附 E 资料性附录常规PCR扩增产物核酸序列 B.1牛分枝杆菌PCR扩增产物序列扩增区域为MD1543和Mb1544基因 ACGCGACcGACCTCATATTCCGAATCCCTTGTGAAGTAGTAATGTGCGAGCTGAGCGATGICcGCCGCTCCCAAAAATACCAATGG GGTCATGACGCCCCTAAcCAGAATGGAACATACAAGCcGTAGTcGTGCAGAAGCGCAACACTCrGGAGTGGCCTACAAC GGcGCrCrccGcGGcGcGGGCGAccGGATACrAGCrGGrCAATAGCCArcAGCAATrCrCAGA acsca CGGGGCGCGCC GTGCcGTAGAGCGTcCCCACrGATGTGGAcGAGGTGCrCCTGGGGTGGGGATGGCGATGACccGGCGCGTCTGGGACrCGCG GICGICATGCIGICGCGGCGICGGCCCATGCTGAATCTGT'TCGCCICTGGGIG E.2结核分枝杆菌PCR扩增产物序列扩增区域为Rv1505c和Rv1506基因 CCGAATcCCTGTGAAGTAGTAAGTGCGAGCTGAGCGAGTCGCCGCTCCCAAAAAAcCAATGGTIGGTCATGACGCCT TCCTAACCAGAATGIGAAT"ICATACAAGCCGTAGICGIGCAGAAGCGCAACAC'TCGGAG'TACCTGCGC'T"IGCAGAGATCAAATAGG GCGCATGGGTCAGCATAGTACAGGICG'TCGCGCATC'T'I'IGAIGCATCGGAATAAGATGTCAGGCAATTAAAAGAGAAGCCACGGCGACT E.3禽分枝杆菌CR扩增产物序列 E.3.1引物对Dma对应的扩增产物序列 GACITCTACAAGGAGCTGGGCGICTCCTCTGACGCCAGTCCCGAAGAGATCAAACGCGCCTACCGCAAGCTGGCGCGCGATCTAC ACCCGGATGCCAACCCCGACAATCCCGCCGCCGGCGAACGATCAAGGCGGTCTC B.3.2引物对Is1245对应的扩增产物序列 TGTCCACGGTCGCAGGGGACCTGGAAC'TGCGGAT TcccGGCGGGGAGCGGCGTCGCCGG GTCGATCAGTGCTGTTCGCGGIGGTGATGGAGGCCTACCIGCACGGCACCTCCACCCGCAAGGTCGACGATCIGGTCAAGGCACIGGG TAccGATAcCGGGATCICCAAAAGCGAGGCAGccGGATCrGCAAAGAcCICGACAcCGAGGICGcGGCCrcCGGGACcGGCcGTrGG GTGATCAGCGCrTCCGTATGTCTCCTCGACG E.3.3引物对Is901序列对应的扩增产物序列 GGATGCTAACCACGTGGGTGGGCGATCGATGACCTCGCcGCCGGCGGCGCTGCCGATCGCCGTACTGCrGACCGCGAAAGC CGAGGTGGTGTATGmGCCGGGCCGCACGGT"TAACACGATGAGTCATGCG GTCGACTACTCCACCCGCGCGCCGTGTCCTGGTCCGCTATGTGCACTCCGGGCGAAATCCGGTCGGCAAAAAGAGCIGGCGTGA TCAAGCACCTTCGGAAAAACCGGGCATGGCCCAACAACATCGACACGATCGCCGACAAGGCGCTCGCCGCGGCAGCAGGCCAGATAATC ACcCCIrCccGGCGAAGCCGGAACcGCcGCGCICATCAAGCAACICGC
GB/T18645一2020 附录规范性附录) 样品采集、包装和运输的要求 F.1样品采集需要由了解相关专业知识和操作技能的工作人员操作,并配备生物安全防护措施,包括个人防护用品<隔离衣、帽、口罩、鞋套,手套、防护眼镜等)和消毒设施 F:.2样品包装应使用无菌容器，一个样品一个容器容器选耐用材料制成,防渗漏,可盛容量低于500mL,能承受运输过程中可能发生的温度和压力变化应随附样品信息,包括样品类型如淋巴结、肺脏或结核结节等),宿主种类,采样时间,采样地点、采样人名称及联系方式等信息 F.3样品运输应按照《高致病性动物病原微生物菌(毒)种或者样本运输包装规范》的规定,实行三层包装在原始容器与第二层包装之间放置有吸附作用的材料,第二层包装使用防漏材料,最外层包装可使用纸质或泡沫材料包装盒运输标本的外包装应有明确的标签,标明寄送人和接收人的详细联系方式,包装日期和运输日期

动物结核病诊断技术GB/T18645-2020介绍

动物结核病是一种由分枝杆菌引起的慢性传染病，不仅危害动物健康，还对人类健康构成威胁。因此，制定准确可靠的诊断技术是非常必要的。

GB/T18645-2020是我国针对动物结核病诊断技术的权威标准，于2020年正式发布。该标准涵盖了结核病的免疫学、细菌学和组织学等多个方面。

免疫学诊断技术

免疫学诊断技术主要依靠检测机体对分枝杆菌特异抗原的免疫反应来诊断动物是否感染结核病。GB/T18645-2020标准规定了ELISA、IFAT、T-SPOT.TB和皮内反应等多种免疫学诊断方法，其中以T-SPOT.TB技术最为准确和可靠。

细菌学诊断技术

细菌学诊断技术主要通过分离和鉴定结核分枝杆菌来诊断结核病。GB/T18645-2020标准规定了包括培养、涂片染色、PCR和LAMP在内的多种细菌学诊断方法，其中PCR和LAMP技术因其快速、高灵敏度和高特异性而受到广泛关注。

组织学诊断技术

组织学诊断技术是通过采集动物体内组织样本，经过切片、染色和显微镜观察来诊断结核病。GB/T18645-2020标准规定了常规染色法、抗酸染色法和免疫组化等多种组织学诊断方法，其中常规染色法因其简便易行、成本低廉而被广泛应用。

总之，GB/T18645-2020标准的发布对于加强动物结核病的诊断和防控非常有意义，也为我们提供了更加科学准确的诊断技术。