鳗鱼及制品中十五种喹诺酮类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法

鳗鱼及制品中十五种喹诺酮类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T20751一2006 鳗鱼及制品中十五种隆诺酮类药物 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Methodforthedeterminationof15quinoloneresidues iineelsandeelproducts LC-MS-MSmethod 2007-03-01实施 2006-12-31发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T20751一2006 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录 本标准由秦皇岛出人境检验检疫局提出 本标准由国家质量监督检验检疫总局归口 本标准起草单位:秦皇岛出人境检验检疫局、福建出人境检验检疫 局、食品安全分析与检测技术教育部重点实验室(福州大学) 本标准主要起草人;庞国芳、,杨方,刘正才、余孔捷、卢声宇、李耀平,陈国南 本标准系首次发布的国家标准
GB/T20751一2006 鳗鱼及制品中十五种哇诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了鳗鱼及制品中十五种唾诺酮类药物残留量的液相色谱-串联质谱测定方法 本标准适用于鳗鱼及制品中十五种唾诺酮类药物的测定 本标准的方法检出限:十五种唾诺类药物的检出限均为54g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分:总则与定义 (GB/T6379.1一2004,Iso5725-l:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,IsO5725-2;1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T66821992,neqISO3696;1987) 原理 试样中残留的呤诺酮类药物采用乙睛提取,提取液经正己婉液液分配脱脂后,以强阳离子固相萃取 小柱净化,液相色谱-串联质谱法测定,外标法定量 试剂和材料 除非另有说明,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 4.1乙睛;色谱纯 4.2甲醇;色谱纯 4.3正己烧 4.4浓氨水 4.5甲酸 乙酸铵 无水硫酸钠:650C灼烧4h,冷却后储于密封容器中备用 氨水十甲醇:2575 量取25ml氨水(4.4),以甲醇(4.2)定容100ml,混匀 甲酸溶液:0.1% 移取1mlL甲酸(4.5),以水定容1L 4.10乙酸铵缓冲液:10mmol/L 称取0.77g乙酸铵(4.6),溶于约700m水中,以甲酸调节 pH=4.6,以水定容1L 4.11十五种呸诺酮类药物标准物质:氟罗沙星、氧氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、 洛美沙星、单诺沙星、奥比沙星、双氟沙星、沙拉沙星、司帕沙星,嗯憧酸、蔡咣酸,氟甲唾,纯度均>98% 4.12标准储备溶液:100mg/儿L 准确称取十五种唾诺酮类药物标准物质(4.11)各10.0mg,分别用 甲醉溶解并定容至100mL,该标准储备液置于4C冰箱中可保存一个月
GB/T20751一2006 4.13标准工作溶液;根据需要取适量标准储备液(4.12),以甲酸溶液(4.9)十乙睛(4.1)(9+1)稀释成 适当浓度的混合标准工作溶液 标准工作溶液要现配现用 4.14强阳离子交换柱(sCXSPE柱)或相当者500mg,3ml 用前依次以3mL甲醇,3mL水,3 nml nol/L乙酸铵缓冲液(4.10)活化,保持柱体湿润 10mm 4.150.22m滤膜 仪器 5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪.配有电喷雾离子源 5.2分析天平;感量0.1mg和0.01 g 5.3组织捣碎机 旋涡振荡器 5.4 5.5分散器.转速应达到100oo" rr/min 超声波发生器 氮气浓缩仪 固相萃取装置 真空泵:真空度应达到80kPa 5. 微量注射器，lml一5ml100山~10o0L 10 11 离心机转速应达到4000r/min 试样的制备与保存 试样制备 鳗鱼去头,将皮、肉分离后先取鱼皮置于微波炉中,以中高功率加热30s后取出切成小块,将鱼肉 切成小块,将二者一并放人组织捣碎机均质,充分混匀,装人清洁容器内,并标明标记 皱鱼制品取可食部分切成小块,放人组织捣碎机均质,充分混匀装人清洁容器内,并标明标记 制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化 6.2试样保存 试样于一18C以下保存,新鲜或冷冻的组织样品可在2C一6C贮存72h 测定步骤 提取 称取5g试样(精确至0.01g)置于50ml聚丙烯离心管中,加人约5g无水硫酸钠(4.7),25ml 乙睛,使用分散器(5.5),在10000r/min分散提取30s,4000r/min离心(5.11)5min.上清液转移至 50ml比色管中,另取一50mL离心管加人15ml乙睛,洗涤分散刀头10s,洗涤液移人第一支离心管 中,用玻棒搅动残渣,旋涡振荡(5.4)提取1min,超声波振荡(5.6)提取5min,4000r/min离心5nmin 上清液合并至50ml比色管,残渣再加人15m乙睛，旋涡振荡提取1min,4000r/min离心5nmin 上清液合并至50mL比色管,乙晴定容至50.0ml 摇匀后移取10.0ml乙晴提取液,以2×5mL正 已烧(4.3)振摇脱脂,使用氮气浓缩仪(5.7)在35C下氮吹至近干,加人3mL乙酸铵缓冲液(4.10),旋 涡振荡30s,待净化 7.2净化 将7.1所得的溶液以约1mL/min的流速全部通过强阳离子交换柱(4.14),抽干,先后以1.5m 甲醉、3mL氨水十甲醉(4.8)洗脱,合并洗脱液,35C下氮吹至近干,以甲酸溶液(4.9)十乙情(4.1) 9十1定容至1mL,过0.22m滤膜(4.15),供液相色谱-串联质谱分析 7.3空白基质溶液的制备 称取阴性样品5g(精确至0.01g),按7.1和7.2操作
GB/T20751一2006 7.4测定 7.4.1液相色谱条件 色请柱.Ca,5pm.,l50 nmm×2.1mm或相当者; a bb 柱温:30C; 流速:200L/min; e d 进样量:20aL 梯度洗脱,洗脱程序见表1 表1液相色谱梯度洗脱程序 时间/min 流速/Al/min 乙晴/% 甲醇/(% 0.1%甲酸/% 78 300 20 75 4.00 300 20 300 20 70 10 8.00 10.00 300 40 20 40 40 40 15.00 300 20 78 15.50 300 20 78 22.00 300 20 7.4.2质谱条件 a 离子源;电喷雾源EsI b)扫描方式:多反应监测(MRM),正离子模式 离子源温度:490C; c d)雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体,使用前应调节各气体流 量以使质谱灵敏度达到检测要求; 喷雾电压、去簇电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度 fD 定性离子对,定量离子对,去簇电压和碰撞气能量见表2 表2十五种畦诺酮类药物的质谱参数 定性离子对 定量离子对 药物名称 英文名称 碰撞气能量/V 碰撞池出口电压/V m/: /之 370.4/326.4 30 70 氟罗沙星 fleroxaein 370.4/326.4 40 370.4/269.4 70 362.4/318.4 30 6o 氧氟沙星 362.4/318.4 ofoxacin 40 362.4/261.3 60 321.1/303.4 35 0 依诺沙星 321.1/303.4 enoxacin 70 48 321.1/232.2 320.4/276.6 26 50 诺氟沙星 320,4/276,6 norfloxacin 30 320.4/233.2 50 332.4/288.3 25 60 环丙沙星 332.4/288. 3 ciprofloxacin 332.4/245.3 33 6o 360.6/316.4 30 60 恩诺沙星 360.6/316. enrofloxacin 360.6/245.4 40 6o 352.3/308.4 28 60 洛美沙星 352.3/308.4 lomefloxacin 352.3/265.4 33 6o
GB/T20751一2006 表2(续 定性离子对 定量离子对 碰撞池出口电压/八 药物名称 英文名称 碰撞气能量/V (m/:) /这 358.3/340.3 40 80 单诺沙星 danofloxacin 358.3/340.3 358.3/283.4 40 8o 396.3/352.3 27 6o 奥比沙星 396.3/352.3 orbiloxacin 35 6o 396.3/295.4 400.4/356.2 28 60 双氟沙星 dfoxacin 00.4/356.2 42 400.4/299.3 60 386.4/342.3 28 60 沙拉沙星 386.4/342.3 sarafloxacin 43 386.4/299.2 60 30 393.3/349.4 80 司帕沙星 393.3/349. sparfloxaein 393.3/292.4 38 8o 262.3/244.2 30 70 恶呤酸 262.3/244.2 oxolinicacid 262.3/216.3 42 70 24 233.3/215.2 6o nalidixicacid 233.3/215,2 莽酸 233.3/187.4 36 6o 262.3/244.3 30 70 262.3/244.3 氟甲隆 flumequin 262.3/202.3 49 70 77 4.3液相色谱-串联质谱测定 7.4.3.1定性测定 每种被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同实验条件下,样品中待测物质的保留时间 与混合基质标准校准溶液中对应浓度标准校准溶液的保留时间偏差在士2.5%之内;且样品谱图中各组 分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比 较,若偏差不超过表3规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 >50 -2050 >l0~20 1o 允许的最大偏差 士20 士25 士30 士50 7.4.3.2定量测定 外标法定量:在仪器最佳工作条件下,对混合基质标准校准溶液进样,以峰面积为纵坐标,混合基质 校准溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线,用标准工作曲线对样品进行定量,样品溶液中待测物的响应 值均应在仪器测定的线性范围内 在上述色谱条件下,十五种唾诺酮类药物的参考保留时间见表4. 十五种畦诺酮类药物的多反应监测(MRM)色谱图参见图A.1 十五种唾诺酮类药物的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见表B.1 表4十五种畦诺酮类药物的参考保留时间 药物名称 保留时间/min 药物名称 保留时间/nminm 药物名称 保留时间/min 5.14 恩诺沙星 8.4 沙拉沙星 10.83 氟罗沙星 氧氟沙星 洛美沙星 司帕沙星 5.88 8.42 13,07 依诺沙星 6.11 单诺沙星 8.55 呕唾酸 16.26 诺氟沙星 奥比沙星 禁唁酸 6.86 9.46 17.78 环丙沙星 7.67 双氟沙星 9.93 氟甲峰 18.25
GB/T20751一2006 7.5平行试验 按以上步骤,对同一试样进行平行试验测定 7.6回收率试验 在阴性样品中添加适量标准溶液,按7.1和7.2操作,测定后计算样品添加的回收率 结果计算 试样中十五种憧诺酮类药物残留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算 1000 yX X=c×- 000 式中 试样中被测组分残留量,单位为微克每千克(4g/kg); 从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); 试样溶液定容体积,单位为毫升(mL) 试样溶液所代表试样的质量,单位为克(g) 注:计算结果应扣除空白值 精密度 本部分的精常座数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,重复性和再现性的m 以95%的可信度来计算 9.1重复性 在重复性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,被测物的含量范围 及重复性方程见表5 表5十五种隆诺酮类药物的含量范围及重复性和再现性方程 名 称 含量范围/ eke" 样品基体 重复性限r" 再现性限R 鳗鱼 =0.3161m R=0.3605从 氟罗沙星 5.040.0 烤鳗 0.2849m十0.0348 R=0.3615川 鳗鱼 0.3021m 0.2989十0.1299 氧氟沙星 5.040.0 烤级 0.2876m 0.2769十0.3248 0.188m十0.9684 0.1599m十1.2851 鳗鱼 依诺沙星 5,040.0 烤鳗 0.309m 0.3126m 鳗鱼 0.154m十1.6128 0,2026m十1.2268 诺氟沙星 5.0一40.o 烤 0.2193m0.1127 0.2648川十0.121 鳗鱼 0.2041m+0.5605 0.2825m十0.133 环丙沙星 5.0一40.o 烤蚁 0. 1835m十0,6098 0.2694m+0.4192 鱼 0.2218十0.9717 0.2233m十1.0813 恩诺沙星 5.040.0 烤 0.3156m十0.3862 0.3701m 鳗鱼 0.2151m十0.6519 0.2306m十0.77 洛美沙星 5,040,.0 烤 0,196m十0.1157 0.219m十0.1681 0.4957mn 0.3672m+0.0593 鳗鱼 单诺沙星 5.040.0 烤鳗 0.2522m0.8514 0,2765朋十0,4918
GB/T20751一2006 表5(续 名 称 含量范围/(4g/kg 样品基体 重复性限r" 再现性限R 鳗鱼 =0,2325mn 0.2604m十0.5997 奥比沙星 5.040.o 烤蚁 0.211n 0.2561m十0.2304 鳗鱼 0.3163m十0.3587 0.3397m十0.488 双氟沙星 5.0~40.o 烤剑 0.2893m1 0.3672m十 十0.0593 鱼 0,2919mn 0.3031mn 沙拉沙星 5.040.0 烤鳗 0.21mn 0,25m 0.2505m0.4917 0,2588m十0.2871l 鳗鱼 司帕沙星 5.0~40.o 烤蚁 0.1776m 0.2902" 鱼 0.3958m 0.385十0.4632 唔唾酸 5.040.0 烤鳗 0.2007m十1.1761 0.2693朋十1.3156 0.249朋十0.4497 0.4044m十0,436l 鳗鱼 紫院酸 5.040.0 烤~ 0.196m十0.2194 0.3641从 鱼 0.243m十0.4749 0,2886m十0.6808 氟甲峰 5.040.0 烤鳗 0.453m 0.2032m十0.6735 注:m为两次测定结果的算术平均值 如果差值超过重复性限,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的剥定 9.2再现性 在再现性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,被测物的含量范围 及再现性方程见表5
GB/T20751?2006 ? A ?? ??????????(MRN)?? ?????????(MRM)??,?A.1 5.9 ;.1 .0e4 3.0e4 3.004 5.8 ? ?? ?? 2.0e4 2.0e4 2.0e4 1.0e4 l.0e4 1,.0e4 6 6s 026 1mir 7.6 6.8 8.2 3.0e4 3.0e4 3,0e4 ? ?? ??? 2.0e4 2.0e4 2.0e4 .0e4 1.0e4 .Oe4 024682o 02468? 0246820 /min 1/min /min 9.2 B.5 A.0et a.0et 3.0o4 ? ±? ?? 2.e4 ?.De4 2.0e4 1.0e4 1.0e4 1.0e4 124610 ;0214620 0246 1/min 1/min 12.8 10.6 3.0e4- 3.0e4 9.7 ?? ?? ??? 2.0e4 2.0e4 2.0e4 .0e4 1.0e4 1.0e4 6I0246 ;i02 ;;2 /mn /min /min 17.6 3,0e4 3.0e4 J.0e4 18, ? 16.2 ? ? 2.0e4 2.0e4 2.0o4 1.0e4 l.0e4 .0e4 02 0 o2402D /min 7min 1/min ?A.1????????(MR)??
GB/T20751一2006 附录 B 资料性附录 收率 十五种唾诺酮类药物的添加浓度及其回收率范围的试验数据,见表B.1 表B.1十五种隆诺酮类药物的添加浓度及其回收率范围的试验数据 回收率范围/% 畦诺酮类药物 舔加浓度/g/ke) 鳗 鱼 烤 鳗 69.6 93.6 75.8 101.2 10 68,0 l05,0 75.5 93.l 氟罗沙星 75.5 20 68.5 l05.5 98.5 1o4.0 79.8 94 5 40 65.3 75.8 98.2 73.8 90,4 10 75.3 104.0 76.1 91.1 氧氟沙星 20 82.5 97.0 75.5 98,5 40 65.5 97.3 3.3 104.8 67.4 100.4 98.0 74.0 10 79.0 l00.0 73.2 88.4 依诺沙星 92.o 20 73.5 103.0 73.0 40 64.8 l01.0 75.0 96.0 68.2 76.2 103.8 97.0 102.0 10 74.7 74.0 93.5 诺氟沙星 20 73.0 97.5 5.5 118.5 40 68.8 97.5 79,.5 94.8 68.2 91.0 77.8 94.4 1o1.0 72." 10 78.4 98.4 环丙沙星 20 79,097.5 75.0 93.5 40 71.5 102.8 72.8 90.8 5 66.8 98.2 73.2 100.4 10 80.8 105.0 70.0 86.2 恩诺沙星 20 70.5 98.5 64.0 96.5 77.5 40 61.3 96.8 96.5 68.8 98.0 69.4 94.4 10 75,3 104.0 73.6 96.1 洛美沙星 20 74.0 96.0 75.5 108.0 40 73.5l00.8 75.391.8
GB/T20751?2006 B.1( ?Χ/(% ??? ?/( w/ke) 70.6?90.8 76.4l00.6 105.0 91. 7 10 70.9 68.9 ?? 20 74.5 101.5 69.0 102.5 40 65.0 102.8 75.8 94.8 70.6 85.4 78.0 101.0 10 71.9 96.9 76.9 99,0 ±? 20 78.092.o 77.5 99.0 40 76.3 l00.5 68.8 92.0 72.6 97.0 69.0 94.2 1o 94.9 72.9 77.1 94.8 ?? 20 81.o 99.5 72.5 100.5 40 79.5 96.3 73.3 92.0 69.2 94.2 73.2 90.6 10 74.1 95.0 76.7 102.0 ?? 20 71.5 102.0 735 106.5 72.097.3 95.0 40 79.0 71.2 88.6 79.2 109.6 10 74.3 98,1 73,.2 96.4 ?? 20 76.0~l00.5 78.5 94.5 40 67.5 99.0 73.3 99.5 69.8 122.0 99.6 67.8 752 107.0 64.9 l04.0 10 ? l05.0 74.0 20 72.0 106.0 71.o 107.0 70.3 93.8 40 73.2 82,2 71.2 105,4 76.3 107.0 10 78.2 98.9 20 76.5 96.0 85.5 100.0 40 68.0 97.8 73.5 96.3 66.2 75.2 103.0 95.4 99.5 74." 107.0 l0 79.6 20 75,5lo4.0 77.0 99.5 40 73.3 90.8 77.3 95 3