动物狂犬病病毒核酸检测方法

动物狂犬病病毒核酸检测方法

国家标准 GB/T36789一2018 动物狂犬病病毒核酸检测方法 Nceicaciddeteetionofanimmalrabiesvirus 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36789一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业农村部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口 本标准起草单位:军事医学科学院军事兽医研究所 本标准主要起草人:冯烨、郭焕成、许运斌、江禹、涂长春
GB/T36789一2018 引 言 本文件的发布机构提请注意,声明符合本文件时,可能涉及4.4与套式RT-PCR检测方法相关的专 利的使用 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场 该专利持有人已向本文件的发布机构保证,他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判 该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案 相关信息可以通过以下 联系方式获得 专利持有人姓名:江禹、涂长春 地址:吉林省长春市净月经济开发区柳莺西路666号军事医学科学院军事兽医研究所 请注意除上述专利外,本文件的某些内容仍可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专 利的责任
GB/36789?2018 ?? Χ ?涨????RT-PCR??RT-PCR ??????,桢???????? в?μ?A) ?? RT-PCR;??-????(Reverse-TranseriptionPolymeraseChainReaetion) DNA;?(DeoxyribonueleicAeid RNA;?(RibonucleicAcid DEPC;??(IDiethypyoearbonate) PBs;λ?(PhosphateBuferSolution Ct?;???(CycleThreshold) EDTA:?(EthyleneDiaminetetraaceticAcid dNTP;?(Deoxy-RibonucleosideTriphosphate) Ta9?;DNA??(ThermusAquaticusPolymerase ?? 3.1 3.1.1 I????C?(?20 C)(4c),?,CR,??PCR ??,??()????? ?(10l200L1000l) 3.1.2? ????????(500mL),??(500ml)?RNase?? 10AL,200AL1000AL)RNase?(1.5mL)??PCR?PCR (0.2mL)?? 3.2? 3.2.1RNA?? 3.2.2λ?(1mol/LPHBS,pH7.4)??B. 3.2.3TAE????B 3.2.4?:200IU/L???10????40U/pLRNA??5IUTa?
GB/T36789一2018 10xTu缓冲液(含Mgt+),2.5mmolLdNTPs,50mol/儿寡聚脱氧胸苷酸引物[ohgo(dr)Pim- er门],.504mol/L随机引物,25mmolL 氯化键(MgCH.),.10%聚乙二醉辛基苯基酥(Tritonx-10o核 酸染料、上样缓冲液、三氯甲炕、异丙醇、75%乙醇、双蒸水、,DEPC水 3.2.5引物及探针序列,见附录C 方法 4.1样品的采集,保存和运送 4.1.1对可疑为狂犬病而扑杀或死亡的动物,应在死亡后尽早无菌采集脑组织,放人灭菌容器内;对待 活检动物,采集脑脊液和唾液拭子 生物安全要求见附录D. 将待检样品置于2C一8C的运输箱内运输;如不能立即运输,可置于样品保存管内，-20C以 4.1.2 下保存,保存期间避免反复冻融 样品置于一70以下可长期保存 4.1.3新鲜冷藏或冰冻样品均应尽快运送至检测地点 4.2样品处理 4.2.1脑组织、脊髓和唾液腺 称取0.l区待检动物脑组织,脊随或唾液腺样品,置于离心管中 加人400Al1xPES充分研磨 脑组织研磨液经43000r/min离心10min 取100lL上清放到1.5mL离心管中,待检 4.2.2唾液拭子样品 将唾液拭子棉签倒置于离心管中,4C3000r/min离心10min 取上清2004l,置1.5mL离心管 中,待检 4.2.3脑脊液或细胞培养物样品 取脑脊液样品或细胞培养物2004L,置1.5m离心管中,待检 4.3核酸提取 4.3.1提取样品总RNA,可采用本标准推荐方法,或选择商业试剂盒,按照试剂盒说明进行 4.3.2取100L脑组织、脊髓或唾液腺样品悬液上清加人900AL裂解液,或200L脑脊液、唾液样 品、细胞培养物加人800AL裂解液,剧烈振荡30s,静置5min. 4.3.3每个样品管中加200L三氯甲婉,振荡20s,4" s,4C12000r/min离心10min. 4C 4.3.4转移4.3.3中的600l上清液至新离心管,加等体积的异丙醇,混匀后4C静置10min,4 10000r/nmin离心10min. 4.3.5弃上清液,沉淀中加1ml75%乙醇,4C12000r/min离心10min,弃上清,留沉淀,将离心管 倒置于吸水纸上干燥 4.3.6将离心管中RNA沉淀用10ALDEPC水充分溶解 4.4套式RT-PCR检测方法 4.4.1对照设立 设置要求:从样品处置开始应设置阳性对照、阴性对照 阳性对照;取已知阳性的同类样品作为阳性对照 也可以将适量灭活的狂犬病病毒添加到已知阴
GB/36789一2018 性样品中作为阳性对照 阴性对照;取已知阴性的同类样品作为阴性对照 采用4.3的方法提取阳性对照和阳性对照的RNA 4.4.2反转录 反应体系;以Oligo(dT)Primer,随机引物为引物,建立20L.反转录体系 2.5mmol/L.dNTPs 4.0l 随机引物(50mol/L 1.5l Oligo(dT)Pimer(50mol/L) 0.5l 10×反转录缓冲液 4.0L 反转录酶 1.0l RNA酶抑制剂 1.0l RNA 8.0l 反应条件:42C孵育1.5h后,95C反应5min,产物为cDNA 4.4.3外套PCR反应体系 反应体系 双蒸水 39.7l 5.0l 0×Taq缓冲液(含Mg+) 外套上游引物 1.0l 外套下游引物 1.0l dNTPs 1.0l .3儿L Tag酶(5U/L) 4.4.2的反应产物cDNA 2.0l 反应条件94C,2min后;9430s-5630s一72C40s进行35个循环;72C,10min;产物 保存于4C产物为外套PCR反应产物 4.4.4内套CR反应体系 反应体系;取2AL外套PCR产物作为内套PCR的模板进行套式PCR,每个样品建立50AL内套 PCR反应体系,组成如下 双蒸水 39.7l 0×Taq缓冲液(含Mg=+ 5.04 内套上游引物 1.0l 内套下游引物 1.0l dNTPs 1.0L Taq酶(5U/AL) 0.3L 外套反应产物 2.0l 反应条件;:94C,2min后;94C30s--56C30s-72C40s进行35个循环;72C,10min;产物 为外套PCR反应产物,保存于4 4.4.5电泳 配制适量的电泳及制胶用的缓冲液和1%琼脂糖凝胶(见附录B) 将琼脂糖溶液倒人制胶模中, mm5 然后在适当位置处插上梳子 凝胶厚度一般在3 mm之间 取PCR产物与上样缓冲液混匀
GB/T36789一2018 用移液枪将其加人加样孔中 接通电源,以120V电压进行电泳,20min后停止电泳 用凝胶成像仪 观察并保存结果 4.4.6实验成立的条件 阳性对照样品的外套PCR产物出现845bp扩增带、内套PCR产物出现371bpp扩增带,阴性对照 无扩增带出现(引物二聚体带除外)时,实验成立 4.4.7结果判定 被检样品的外套PCR产物出现845bp扩增条带,内套PCR产物出现371bp特异性条带,或仅内 套P(CR产物出现371bp特异性条带时,均判定样品为狂犬病病毒检测阳性,否则为阴性 4.5荧光定量RT-CR检测方法 4.5.1对照设立 设置要求;从样品处置开始应设置阳性对照、,阴性对照 阳性对照,取已知阳性的同类样品作为阳性对照 也可以将适量灭活的狂犬病病毒添加到已知阴 性样品中作为阳性对照 阴性对照;取已知阴性的同类样品作为阴性对照 采用4.3的方法提取阳性对照和阳性对照的RNA 4.5.2荧光定量I-PCR反应体系建立 每个样品建立50L荧光定量RT-PCR体系，组成如下 DEPC水 16.15从 dNTPs 0.5Ml 10×Taq缓冲液 5 4l MgCl 12儿l 10%TritonX-100 1AL RNA酶抑制剂 0.25L Taq酶 0.5 4L 反转录酶 0.6AL 上游引物工作液 2儿 下游引物工作液 lL 1L 探针工作液 总RNA 10 4.5.3荧光定量RT-PCR扩增 42C30min;92C3min;92C30s-55C30s一72C20s进行45个循环;设置72C时收集荧 光 4.5.4结果分析条件设定 直接读取检测结果 值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以值线刚好超过正常阴性样品 扩增曲线最高点为准
GB/36789一2018 4.5.5实验成立的条件 阴性对照无Ct值,且无典型扩增曲线 阳性对照Ct值一26,且出现典型扩增曲线 实验结果 有效 4.5.6结果描述及判定 阴性:无Ct值，且无典型扩增曲线,判定样品中无RABV 阳性:Ct值一32,且出现典型扩增曲线,判定样品中存在RABV 可疑;Ct值>32,且出现典型扩增曲线,判定为可疑,需对样本重新检测 重检结果出现C值和典 型扩增曲线者判为阳性,否则判为阴性
GB/T36789一2018 附 录 A 资料性附录) 狂犬病与狂犬病毒属 狂犬病是由狂犬病毒属(Lyssavirusgenus)成员引起的一种具有高度嗜神经性的烈性传染病 2012年国际病毒分类委员会(CTV)第十次会议将狂犬病病毒界定为单股负链RNA病毒目(Mononm gavirales)弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属成员 该属目前包括了12个已定种和2个暂定种 分别为狂犬病病毒(Rabiesvirus,RABV)、拉各斯蝙蝠病毒(L.agosbatvirus,LBV)、蒙哥拉病毒 Mokolavirus,MOKV、杜文哈根病毒(Duvenhagevirus,DUVV)、欧洲蝙蝠狂犬病毒1型(European batlyssavirus1,EBLV-1)欧洲蝙蝠狂犬病毒2型(Europeanbatlyssavirus2,EBLV-2),澳大利亚蝙 蝠病毒(Australianbatlyssavirus， AV),阿拉万病毒(Aravanvirus,ARAv)北塔吉克斯坦病毒 Khujandvirus,KHUV),伊尔库特病毒(Irkutvirus,IRKV),西高加索蝙蝠病毒(westCaucasianbat virus,wCBV,希莫尼蝙蝠病毒(Shimonibatvirus,SHIBV)博克罗蝙蝠狂犬病病毒(Bokeohbatlys- s,IKo) 除RABV外,其他成员统称为狂犬病相关 ,BBLV)、生驹狂犬病毒 sairus， Ilkomalvssairus 病毒(RRV) RABV作为狂犬病毒属最重要的成员,分布最广,全世界99%以上的人和家养动物狂犬 病是由RABV引起的,其他国家偶尔有狂犬病毒属其他成员引发的狂犬病报道 在我国目前所有人和 陆生动物狂犬病疫情均是由RABV感染引发的 世界动物卫生组织(OIE《陆生动物诊断实验和疫苗手册》明确指出,核酸检测技术是快速、敏感的 狂犬病诊断方法,可用于临床样品诊断和狂犬病毒属初步分型 本标准按照OIE要求,根据我国狂犬 病病毒流行株的特点制定,不仅适用于动物脑组织的检测,而且与荧光抗体实验(FAT)方法相比,更适 用于脑脊液、唾液以及腐败样品的检测 需要指出的是,套式RT-PCR和荧光定量RT-PCR方法均可 以准确地检测出狂犬病病毒(RABV) 此外,套式RT-PCR方法还可用于检测狂犬病相关病毒,有关 实验室可根据实际仪器设备条件进行选择
GB/36789一2018 附录 B 规范性附录) 溶液的制备 B.1磷酸盐缓冲液(1mol/LPBs,pl7.4)的制备 B.1.1 成分 磷酸二氢钠 1g 氯化钾 1g 42.5 氯化钠 g 磷酸氢二钠(NaeHPO12H.O) 14.5g B.1.2配制方法 将B.1.1试剂溶于5000m灭菌双燕水中 B.1.3使用 使用时(121士2)C高压灭菌20min.4C保存备用 B.2TAE电泳缓冲液的制备 B.2.1 乙二胺四乙酸二钠(EDTA)溶液0.5mo/L、pH8.0 B.2.1.1成分 二水乙二胺四乙酸二钠 18.61g 氢氧化钠 2g B.2.1.2配制方法 将二水乙二胶四乙酸二躺加人到ml灭前双携水中,用复氧化悄(约2)调pH至队0,二水乙 二胺四乙酸二钠全部溶解后,加灭菌双蒸水至100mL B.3TAE电泳缓冲液(50倍)配制 B.3.1 成分 242g 羚基甲基氨基甲婉(Tris) 57.1mL 冰乙酸 100mL 0.5mol/I乙二胺四乙酸二钠溶液(pH8.0) B.3.2配制方法 将胫基甲基氨基甲婉(Tris)加人57.1lml冰乙酸和0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液(pH8.0 100mL,加灭菌双蒸水至1000ml
GB/T36789?2018 B.4TAE???) B.4.1? 20mL 50TAE?? B.4.2? 50TAE??20ml??1000ml B.51%? B.5.1? ? g 2ml TAE??(50 ? 5l B.5.2? ??TAE??(50)98ml??,??м?? μ5L??
GB/36789一2018 录 附 C 规范性附录 引物及探针 表C.1和表c.2给出了套式RT-PCR引物信息和荧光定量RT-PCR引物及探针信息 表c.1套式RI-CR引物信息 引物名称 引物序列(5'-3' 扩增片段长度 外套上游引物 5'-ATGTAACNCCTCTACAATGG;-3” 71p 外套下游引物 5'-GCCCTGGTTCGAACATTCT ACAATGGAKKTGAcAARATTG司 内套上游引物 5'- 845bp 5'-(C'T(GYYwGAGCcCAGTTVcCYTC-3’ 内套下游引物 注1:RAG),YCT 注2;引物使用时用DEP水稀释20molL,于-20C保存 表c.2荧光定量RT-PCR引物及探针信息 引物及探针名称 引物及探针序列(5'3’ 扩增片段长度 上游引物工作液 ATGTAAcACcYcTACAATG GcAGGGTAYTTRTAcTCATA bp 下游引物工作液 探针 FAM-ACAAGATTGTATTCAAAGTCAATAATCAG-TAMRA 注1:RAG),Y(CT) 注2:两引物扩增片段长度为111bp,Tagman探针5’端标记荧光报告基团FAM(6-阂基荧光素),3'’端标记荧光 悴灭基团为TAMRA(6-梭基-4甲基罗丹明) 引物和探针使用时以DEPC水分别稀释20pmolL 和 5Amol/L,于一20保存
GB/T36789一2018 附 录 D 规范性附录) 生物安全 生物安全措施 D.1 D.1.1狂犬病病毒属于高危险病原,为了确保狂犬病检测实验室的生物安全,实验室具有严格的安全 管理规定，工作人员应经过生物安全培训,皮肤裸露或有开放性伤口时,不能进行本实验 D.1.2所有涉及狂犬病检测的人员应进行暴露前免疫和血清抗狂犬病毒中和抗体水平的检测,以确保 抗体水平达到保护,未经免疫的人员不得进人狂犬病研究、检测实验室 D.1. 样品的处理应在生物安全I级 -2级)或以上的实验室进行 严格操作疑似感染狂犬病病 OBSI- 毒脑组织时的个人防护措施;操作样品时应穿防护服,带一次性乳胶手套和口罩,在生物安全柜内操作 本实验涉及载玻片等玻璃器材,要防止玻片破碎划伤 D.1.4实验室中所有的废弃物、沾染的器皿,包括检测的组织样品,解剖器械、实验器皿等,均应严格消 毒处理后才能够丢弃,消毒可采用焚烧、5%氢氧化钠浸泡或121C高压30min的方法 D.1.5RT-PCR实验室按照工作流程分为配液区、模板提取区、扩增区和电泳区 各区器材试剂专用 不可跨区流动使用,防止污染 实验结束后立即用75%乙醉或紫外灯对工作环境消毒处理 D.1.6提取RNA时,推荐使用免处理的无RNase和DNase一次性耗材 须戴口罩,乳胶手套,尽量避 免交谈,缩短操作时间,防止唾液和皮肤上RNA酶的污染 使用75%乙醉清洁实验工作台、移液器等 实验器材 D.2急救措施 D.2.1如果在狂犬病病毒生物安全实验室内出现伤口暴露,应立即用大量肥皂水冲洗创面,补充注射 狂犬病疫苗1剂,创伤严重时应立即就医 D.2.2如果因操作感染物而造成暴露,应立即按川级暴露处理原则进行暴露后处理 0

动物狂犬病病毒核酸检测方法GB/T36789-2018

狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的急性传染病，常见于犬、猫等哺乳动物。该病毒能够通过受感染动物的唾液等分泌物或伤口直接传播给人类，造成严重危害。因此，对于动物狂犬病的早期诊断至关重要。

GB/T36789-2018是我国制定的针对动物狂犬病病毒核酸检测的标准，该标准规定了狂犬病病毒核酸检测的基本原理、试剂和设备、样品处理和提取、PCR扩增、检测结果判定等方面的内容。

在狂犬病病毒核酸检测过程中，样品处理和提取是非常重要的一步。通常情况下，可以通过对动物组织、血清、唾液等样品进行离心、蛋白酶消化、DNA/RNA提取等步骤来获取高质量的核酸模板。

另外，在PCR扩增过程中，应根据标准所规定的探针和引物进行扩增反应，并在扩增前进行必要的准备工作，如制备阳性对照、负性对照等。

最后，在检测结果判定方面，GB/T36789-2018标准也做出了详细规定。在检测结果呈阳性时，需要进行序列分析以确定病毒亚型和基因型等信息；而在检测结果呈阴性时，还需进行二次核酸检测以确认结果的准确性。

总之，GB/T36789-2018为动物狂犬病病毒核酸检测提供了详细的规范和指导，有助于提高狂犬病的诊断准确性和检测效率，对于保障人类和动物健康具有重要意义。

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