H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法

H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法

国家标准 GB/T19438.4一2004 H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法 Methodofthereal-timeRT-PrCRforthedeteetionm favianinflenzavirussubtypeH9 2004-02-14发布 2004-02-15实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 小 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T19438.4一2004 前 言 GB/T19438一2004《禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分: GB/T19438.1一2004《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》; GB/T19438.2一2004《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》; GB/T19438.3一2004《H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》; GB/T19438.4一2004《H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》. 本部分的附录A是资料性附录 本部分由国家质量监督检验检疫总局提出 本部分起草单位;北京出人境检验检疫局,深圳市匹基生物工程股份有限公司 本部分主要起草人:张利峰、张鹤晓,刘继红、郭晋优、刘艳华、杨伟
GB/T19438.4一2004 H9亚型禽流感病毒荧光RI-PCR检测方法 范围 本部分规定了荧光RT-PCR检测H9亚型禽流感病毒的操作方法 本部分适用于活禽及其产品中H9亚型禽流感病毒的检测 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本部分 GB/T19438.1一2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 缩略语 下列缩略语适用于本部分 3.1 荧光Rr-CR 荧光反转录-聚合酶链反应 3.2 Ct值 每个反应管内的荧光信号达到设定的闵值时所经历的循环数 3.3 RNA 核糖核酸 3.4 DEPC 焦碳酸乙二酯 3.5 PBS 磷酸盐缓冲盐水 3.6 Taq酶 TaqDNA聚合酶 原理 H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法是采用TaqMan技术 设计一对仅在H9亚型禽流感 病毒血凝素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针 探针的5'端和3'分别标记 不同的荧光素,如5'端标记FAM荧光素,它发出的荧光能够被检测仪器接收,称为报告荧光基团(用R 表示),3'端一般标记TAMRA荧光素,它在近距离内能吸收5'端报告荧光基团发出的荧光信号,称为 淬灭荧光基团(用Q表示) 当PCR反应在退火阶段时,一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合,此时探针上R基团发
GB/T19438.4一2004 出的荧光信号被Q基团所吸收,仪器检测不到R所发出的荧光信号;当PCR反应进行到延伸阶段时. Ta酶在引物的引导下,以四种核苷酸为底物,根据碱基配对的原则,沿着模板链合成新链;当链的延伸 进行到探针结合部位时,受到探针的阻碍而无法继续,此时的Taq酶发挥它的5'-3'外切核酸酶的功 能,将探针切成单核苷酸,消除阻碍,与此同时标记在探针上的R基团游离出来,R所发出的荧光再不 为Q所吸收而被检测仪所接收;在Taq酶的作用下继续延伸过程合成完整的新链,R和Q基团均游离 于溶液中,仪器可继续检测到R所发出的荧光信号 材料与试剂 5.1试剂 除特别说明以外,本标准所用试剂均为分析纯,所有试剂均用无NA酶污染的容器(用DEPC水 处理后高压灭菌)分装 5.1.1三氯甲炕 5.1. 异丙醇(一20C预冷). .2 5. .1.3PES;配方见GB/T19438.12004中附录A 121C士2C,15min高压灭菌冷却后,无菌条件 下加人青霉素、链霉索各10000IU/mL 75%乙醇;用新开启的无水乙醇和无RNA酶的水配制,一20C预冷 4 5.1. 5.1.5HH9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒;组成、说明及使用注意事项参见附录A 5.2仪器与器材 荧光RT-PCR检测仪 2 高速台式冷冻离心机(最高转速12000!/min以上》. 5.2. 台式离心机(最高转速2000r/nmin) 5.2. 混匀器 5.2.5冰箱(2C8C和一20C两种) 5.2.6可移动紫外灯 5.2.7微量可调移液器及配套带滤芯吸头(10AL、100AL、l000AL). 5.2. 8 专用毛细玻璃管或PCR管 5. Eppendorf管(1.5mL). 抽样 6. 采样工具 下列采样工具必须经121C士2C,15min高压灭菌并烘干 棉拭子; 剪刀、慑子; 注射器; 1.5mLEppendorl管; 研钵 6.2样品采集 6.2.1活禽 取咽喉拭子和泄殖腔拭子,采集方法如下 -取咽喉拭子时将拭子深人喉头口及上飘裂来回刮3次5次取咽喉分泌液; 由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的认可 如果其他等效产品具 1 有相同的效果,则可使用这些等效产品
GB/T19438.4一2004 -取泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔转一圈并沾取少量粪便; 将同一样品的咽喉拭子和泄殖腔拭子一并放人盛有1.0mLPES的1.5ml，Eppendorf管中， 加盖、编号 6.2.2肌肉或组织脏器 待检样品装人一次性塑料袋或其他灭菌容器,编号,送实验室 6.2.3血清、血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendor管中,编号备用 6.3样品储运 样品采集后,将采集的样品放人密闭的塑料袋内(一个采样点的样品,放一个塑料袋),于保温箱中 加冰、密封,送实验室 6.4样品制备 6.4.1咽喉、泄殖腔拭子 样品在混匀器上充分混合后,用高压灭菌镀子将拭子中的液体挤出,室温放置30min,取上清液转 人无菌的1.5mlEppendor管中,编号备用 6.4.2肌肉或组织脏器 取待检样品2.0g于已洗净,灭菌并烘干的研钵中充分研磨,加10mlPBS混匀,4C,3000r/min 离心15min,取上清液转人无菌的1.5mlEppendor管中,编号备用 6.5样本存放 样本在2C~8C条件下保存应不超过24h,若需长期保存应放在一70C以下冰箱,但应避免反复 冻融(冻融不超过3次) 操作方法 实验室的设置与管理 实验室的设置与管理见GB/T19438.12004中附录c 7.2样本的处理 在样本制备区进行 7.2.1取n个灭菌的1.5mLEppendorf管,其中n为被检样品、阳性样品与阴性样品的和(阳性样品、 阴性样品在试剂盒中已标出),做标记 7.2.2每管加人600 A裂解液,分别加人被检样本,阴性对照、阳性对照各200L，一份样本换用一 个吸头,再加人200l三氯甲熔,混匀器上振荡混匀5s(不能过于强烈,以免产生乳化层,也可以用手 颠倒混匀) 于4C,12000r/min离心15min 7.2.3取与7.2.1相同数量灭菌的1.5mlEppendorf管,加人500l异丙醇(一20C预冷),做标记 吸取7.2.2各管中的上清液转移至相应的管中,上清液应至少吸取500L,不能吸出中间层,颠倒 混匀 7.2.4于4c,12000r/min离心15min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置),小心倒去上 清液,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干);加人600L75%乙醇,颠倒 洗涤 7.2.5于4C,12000r/min离心10min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置),小心倒去上 清液,倒置于吸水纸上,尽量沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干) 7.2.64000r/min离心10s(Eppendorl管开口保持朝离心机转轴方向放置),将管壁上的残余液体甩 到管底部,小心倒去上清液,用微量加样器将其吸干,一份样本换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀 面,室温干燥3min,不能过于干燥,以免RNA不溶 7.2.7加人11LDEPC水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,2000r/min离心5s,冰上保存备用 提
GB/T19438.4一2004 取的RNA须在2h内进行PCR扩增;若需长期保存须放置于一70C冰箱 7.3检测 7.3.1扩增试剂准备 在反应混合物配制区进行 从试剂盒中取出相应的荧光RT-PCR反应液、Taq酶,在室温下融化后,2000r/min离心5s 设 所需荧光RT-PCR检测总数为n,其中n为被检样品、阳性样品与阴性样品的和,每个样品测试反应体 系配制见表1 表1每个样品测试反应体系配制表 试 剂 RT-PCR反应液/l Taq酶/l 量 15 0.25 根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量,加人到适当体积试管中,按每四份样品加人一颗 RTPRCR反转录酶颗粒,计算应加人的酶颗粒数,充分混合均匀,向每个荧光RTCR管中各分装15" 反应混合物液体,转移至样本处理区 7.3.2加样 在样本处理区进行 在各设定的荧光RT-PCR管中分别加人7.2.7中制备的RNA溶液各10L,盖紧管盖,500r/min 离心30s 7.3.3荧光RT-CR检测 在检测区进行 将7.3.2中离心后的PCR管放人荧光RT-PCR检测仪内,记录样本摆放顺序 循环条件设置 第一阶段,反转录42C/30min; -第二阶段,预变性92C/3min -第三阶段,.92C/10s,45C/30s,72C/lmin.5个循环 第四阶段,92C/10s,60C/30s,40个循环,在第四阶段每次循环的退火延伸时收集荧光 试验检测结束后,根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果 结果判定 8.1结果分析条件设定 直接读取检测结果 阂值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以值线刚好超过正常阴性样品 扩增曲线的最高点为准 质控标准 8.2.1阴性样品无Ct值或无扩增曲线 8.2.2阳性对照的Ct值应小于28.0,并出现典型的扩增曲线 否则,此次实验视为无效 结果描述及判定 阴性 无Ct值或无扩增曲线,表示样品中无H9亚型禽流感病毒 阳性 Ct值小于等于30.0,且出现典型的扩增曲线,示样品中存在H9亚型禽流感病毒 8.3.3有效原则 Ct大于30.0的样本建议重做 重做结果无数值者为阴性,否则为阳性
GB/T19438.4一2004 附 录A 资料性附录 H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒的组成 试剂盒组成 A.1 每个试剂盒可做48个检测,包括以下成分 裂解液 30m×1盒 DEPC水 lmL×1管 H9亚型禽流感病毒RT-PCR反应液 750ALX1管 RT-PCR酶 1颗/管×12管 Taq酶 12L×1管 阴性对照 1mLX1管 阳性对照(非感染性体外转录RNA mL×1管 A.2说明 A.2.1裂解液的主要成分为异硫夙酸呱和酚,为RNA提取试剂,外观为红色液体,于4C保存 A.2.2DEPC水,是用1%DEPC处理后的去离子水,用于溶解RNA .2.3H9亚型禽流感病毒RT-PCR反应液中含有检测H9亚型禽流感病毒的特异性引物、探针及各 A 种离子 A.3使用时的注意事项 A.3.1由于阳性样品中模板浓度相对较高,检测过程中不得交叉污染 A.3.2反应液分装时应避免产生气泡,上机前检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄露污染仪器 A.3.3RT-PCR酶颗粒极易吸潮失活,必须在室温条件下置于干燥器内保存，使用时取出所需数量 剩余部分立即放回干燥器中