斑点叉尾鮰嗜麦芽寡养单胞菌检测操作方法

斑点叉尾鮰嗜麦芽寡养单胞菌检测操作方法

国家标准 GB/T27635一2011 斑点叉尾卸嗜麦芽寡养单胞菌 检测操作方法 Protoeolofidentifieationofstenotrophomonasmaltophiliafomletalerus punctatusRafinsque 2011-12-30发布 2012-04-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27635一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009的规则起草 本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口 本标准起草单位;江苏出人境检验检疫局、动物卫生与流行病学中心 本标准主要起草人;薛峰、蒋原,袁芳、王云飞、张睿,易海华、徐帮兴、邵卫星、马卉,奕军、陈国强、 乔华林,谢怀根
GB/T27635一2011 斑点叉尾嗜麦芽寡养单胞菌 检测操作方法 范围 本标准规定了斑点叉尾酮嗜麦芽寡养单胞菌的分离与鉴定方法 本标准适用于对斑点叉尾酮的嗜麦芽寡养单胞菌的分离、鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T4789.28一2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 GB/T6682一2008分析实验室用水规格和试验方法 缩略语 下列缩略语适用于本文件 NA:nutrientagar,普通营养琼脂 TsA;tryptosesoyaagar,大豆胰蛋白陈琼脂 VIA:amphotericinB;imipenem;vancomycinhydrochloride,含有万古霉素、亚胺培南、两性霉素B 的选择性平板 设备和材料 4.1冰箱:0C一！C 4.2恒温培养箱28C士1c 4.3铂/接种环或玻璃棒 滤纸 4.5发酵管 天平:0g~100g,精确至0.5默 均质器或灭菌乳钵 4.8灭菌广口瓶;500mL 4.9灭菌三角烧瓶;500mL,250mL 4.10灭菌培养皿:直径90cm 4.11显微镜:10×100× 试剂和培养基 5 试剂级别:除另有规定,本方法试验用水应符合GB/T6682一2008规定的二级水,所用化学试剂
GB/T27635一2011 均为分析纯 5.2普通营养肉汤,大豆胰蛋白陈琼脂(TSA,普通营养琼脂(NA,普通羊血营养琼脂和VIA的配制 见附录A也可按GB/T4789.28一2003中4.7规定 . 革兰氏染色液;按GB/T4789.28一2003中2.2规定 3 5.4氧化酶试剂;按GB/T4789.28一2003中3.18规定 5.5糖发脖管;麦芽糖按GB/T4789.28一2003中3.2规定 5.6DNA酶甲基绿琼脂;按GB/T4789.28一2003中4.51规定 5.7微量生化反应管:乳糖、水杨苷乙酸盐、丙酸盐,戊酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐、L-苹果 酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、2-酮戊二酸盐、丙酮酸盐生化反应,L-丙氨酸、D丙氨酸、I-谷氨酸盐、IL-组氨酸 和L-脯氨酸,按照GB/T4789.282003中规定 5.8API20E生化鉴定试剂盒 检验程序 斑点叉尾酮嗜麦芽寡养单胞菌检验程序见图1 从病鱼肝,肾取样 于225 百m叫普通营养肉话中消商， ，28C士1C， 需氧培养24h VTA琼脂上划线，28土1,需氧培养24h 挑取平板背最未变黄色的可疑菌落 接种大豆胰蛋白胁琼脂或普通背养琼脂，或者普通羊血琼脂,28c 革兰氏染色 氧化酶 其他生 API20E 麦芽糖氧化实验、DNA 形态观察 实验 鉴定 化实验 反应实验 结果全部相符者 结果不全部相符者 报告阳性 报告阴性 图1斑点叉尾窦嗜麦芽寡养单胞菌检验程序
GB/T27635一2011 操作步骤 7.1样品处理液的制备 以无菌操作取出有病症鱼体,直接从鱼体肝、肾等组织中采样 如果是体长小于4cm的幼鱼取整 条鱼,如果是体长4cm一6cmm的鱼取内脏 将鱼体或内脏25 区均质于225nL营养肉汤中,8C土1c. 需氧培养24h,无菌取培养液作为样品处理液 7.2细菌的分离 将24h普通营养肉汤增菌液划线接种于VIA,置于28需氧培养24h,显微镜观察,背景未变化 的单个优势菌落为可疑菌落 7.3可疑菌落筛选 挑取背景未变化的单个优势可疑菌落于大豆胰蛋白陈琼脂或普通营养琼脂或者普通羊血平板,置 于28C需氧培养24h 观察菌落的大小,形态 在普通营养琼脂上菌落呈灰白色,圆形,表面光滑,边 沿整齐的半透明菌落;在大豆胰蛋白陈琼脂TSA)平板上形成圆形,表面光滑,边缘整齐,直径 0.18nmm1.12nmm的透明的无色菌落;在普通羊血琼脂平板上出现明显的溶血环,且溶血环呈草 绿色,有强烈的氨味 符合以上菌落特征的为可疑菌 7.4嗜麦芽寡养单胞菌的鉴定 7.4.1革兰氏染色 对可疑菌落进行革兰氏染色,嗜麦芽寡养单胞菌为G杆菌,无荚膜,无芽袍,极生端鞭毛,鞭毛数 不小于2. 7.4.2氧化酶实验 使用铂/镶接种环或玻璃棒,挑取单个可疑菌落,然后接种到用氧化酶试剂润湿的滤纸上,如果在 10s内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性,不变色为阴性,嗜麦芽寡养单胞菌为阴性 7.4.3麦芽糖氧化实验 将可疑菌落无菌挑取到麦芽糖发酵管,28C士！C培养2h一3h,观察结果 嗜麦芽寡养单胞菌为 氧化麦芽糖强阳性 7.4.4NA酶反应实验 在以甲基绿为指示剂的DNA酶培养基的试管或平m上检测DNA酶活性,在该培养基上,围绕 DNA酶阳性的细菌菌落的周围有一个清亮的环 将可疑菌落接种到上述DNA酶反应培养基中,28C 需氧条件下培养72h,观察结果 嗜麦芽寡养单胞菌为DNA酶反应阳性 7.4.5其他生化反应 7.4.5.1API20E鉴定 对上述均符合的可疑菌株用API20E生化鉴定试剂条鉴定,具体操作按照产品说明书进行
GB/27635一2011 7.4.5.2微量反应生化管实验 除API20E鉴定方法外,也可以利用微量反应生化管,做乳糖,水杨昔、乙酸盐、丙酸盐、戊酸盐、丙 二酸盐,琥珀酸盐、,延胡索酸盐、L-苹果酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、2-酮戊二酸盐、丙酮酸盐、L丙氨酸、 D丙氨酸、L谷氨酸盐、L-组氨酸和L脯氨酸生化实验 嗜麦芽寡养单胞菌均可以利用上述有机物,反 应均为阳性 结果报告 可疑菌落全部符合7.4中的报告阳性结果“检出嗜麦芽寡养单胞菌”,否则报告阴性结果“未检 出嗜麦芽寡养单胞菌”
GB/T27635一2011 附 录A 规范性附录 培养基与试剂 A.1普通营养肉汤 A.1.1基础培养基成分 蛋白陈 10g 牛肉膏 3g 氯化钠 5g 1000ml 蒸憎水 A.1.2制备 用蒸僧水溶解培养基基础成分,调节pH7.4,选取合适大小的三角瓶分装此基础培养基,121C 15min高压灭菌 A.2大豆胰蛋白陈琼脂(TSA A.2.1基础培养基成分 胰陈 15.0g 植物蛋白胯 5.0 g 氯化钠 30.0g 琼脂 15.0g 燕僧水 1000ml A.2.2配制 用蒸水溶解培养基基础成分,调节pH,以确保灭菌后pH为7.2士0.2(25C),选取合适大小的 三角瓶分装此基础培养基,121C15nmin高压灭菌 A.2.3制备 当基础培养基的温度降至47C50时,混匀 倾注15ml基础培养基于灭菌平皿中,静置 使凝固 A.3普通营养琼脂培养基(NA A.3.1基础培养基成分 12g 蛋白陈 氧化钠纳 5g 3g 牛肉膏粉 酵母膏粉 3g
GB/T27635一2011 琼脂 3g 蒸馏水 1000mL A.3.2配制 用蒸僧水溶解培养基基础成分,调节pH,以确保灭菌后pH为7.2士0.2(25C),选取合适大小的 三角瓶分装此基础培养基,121C15min高压灭菌 A.3.3制备 当基础培养基的温度降至47C一50C时,混匀 倾注15ml基础培养基于灭菌平皿中,静置 使凝固 普通羊血琼脂 A.4.1基础培养基 A.4.1.1成分 动物组织酶解物 23.0g 淀粉 1.0g 氯化钠 4.0g 琼脂 8.0g~18.0g 1000 水 ml A.4.1.2配制 将基础组分溶于水,加热以促进溶解 调节pH,使培养基在高压灭菌后,在24C时的pH为7.3 士0.2,选取适当三角瓶进行分装 121C15min高压灭菌 A.4.2合成培养基 A.4.2.1组分 basicmedium(基础培养基,见A.4.1) 1000m steriledefibrinatedhorse/sheepblood(无菌脱纤维马/羊血 50ml A.4.2.2制备 当基础培养基的温度降至47C一50C时,加人无菌脱纤维马/羊血5mL/100mL，混匀 倾注 15mL合成培养基于灭菌平皿中,静置使凝固 A.5VIA A.5.1基础培养基 A.5.1.1成分 蛋白陈 0.0 牛肉浸膏 1.0g D-甘露醇 0.0
GB/T27635一2011 氯化钠 5.0g 琼脂 15.0g Q.06g 嗅百里酚蓝 A.5.1.2配制 将基础培养基组分溶于水,加热以促进溶解 调节pH,使培养基在高压灭菌后,在25C时的pH 为7.3士0.2,选取适当三角瓶进行分装 121C15min高压灭菌 A.5.2抗生素溶液 A.5.2.1成分 vancomycinhydrochloride(万古霉素 5mg/L imipenem亚胺培南 32mg/I amphoterieinB两性霉素B 2.5mg/L A.5.2.2制备 用水溶解上述成分并且过滤除菌 A.5.3合成培养基 A.5.3.1成分 基础培养基(见A.5.1),抗生素溶液(见A.5.2) A.5.3.2制备 当基础培养基的温度降至47C50C时,加人抗生素溶液,混匀,形成合成培养基 倾注15nmL 此合成培养基于灭菌平皿中,静置使凝固

斑点叉尾鮰嗜麦芽寡养单胞菌检测操作方法GB/T27635-2011

1. 引言

斑点叉尾鮰是一种重要的水产养殖物种，其肉质白嫩、营养丰富，深受消费者喜爱。然而，随着水产养殖业的不断发展，斑点叉尾鮰的疾病问题也越来越突出。其中，嗜麦芽寡养单胞菌是一种常见的病原微生物，能引起斑点叉尾鮰的败血症、脓毒症等严重疾病。因此，对斑点叉尾鮰嗜麦芽寡养单胞菌的检测具有重要的意义。

2. 检测原理

嗜麦芽寡养单胞菌的检测是通过分离培养、生化试验等方法来完成的。具体步骤如下：

1. 样品采集：从斑点叉尾鮰体表或器官（如肝脏、脾脏）取样。
2. 分离培养：将样品接种到相应的寡养培养基上，经过一定时间的培养，通过形态学和生理生化特征进行初步鉴定。
3. 进一步鉴定：对初步鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌的菌株，进行进一步的鉴定，包括形态学、生理生化特征、分子生物学等方面。

3. 检测操作

斑点叉尾鮰嗜麦芽寡养单胞菌的检测操作方法如下：

1. 样品采集：从斑点叉尾鮰体表或器官（如肝脏、脾脏）取样。
2. 处理样品：将样品进行处理，去除附着在体表的杂质和细菌。
3. 分离培养：将处理后的样品接种到相应的寡养培养基上，经过一定时间的培养，得到纯净的细菌菌落。
4. 生化试验：对细菌菌落进行生化试验，包括氧化酶试验、嗜热性试验等。
5. 进一步鉴定：对初步鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌的菌株，进行进一步的鉴定，包括形态学、生理生化特征、分子生物学等方面。

4. 结论

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