河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素残留量的测定液相色谱-串联质谱法

河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T22953一2008 河豚鱼鳗鱼和烤鳗中伊维菌素、阿维菌素 多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素残留量 的测定液相色谱-串联质谱法 Determinationofivermectinabamectin,doramectinandeprinomectin residuesinfugu,eelandbakedeel一LC-MS-MSmethod 2008-12-31发布 2009-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22953一2008 前 言 本标准的附录A,附录B为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准起草单位;秦皇岛出人境检验检疫局、广东出人境检验检 疫局 本标准主要起草人:林峰、吴映漩、姚仰勋、欧阳少伦、林海丹、庞国芳
GB/T22953一2008 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中伊维菌素,阿维菌素 多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素残留量 的测定液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中阿维菌素类药物伊维菌素(ivermeetin)、阿维菌素abamec tin),多拉菌素dorameetin)和乙酰氨基阿维菌素eprinomeetin)残留量的液相色谱-串联质谱测定 方法 本标准适用于河豚鱼肌肉、鳗鱼肌肉、烤鳗中伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素残 留量的测定 本标准的方法检出限;河豚鱼肌肉、鳗鱼肌肉,烤鳗中伊维菌素,阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿 维菌素均为54g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分:总则与定义 GB/T6379.1一2004,1IsO5725-1l:1994,IDT GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,I1sO5725-2:1994,IDT GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一2008,IsO3696:1987,MOD 原理 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中残留的伊维菌素、阿维菌素,多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素残留用乙睛提取 后,正已熔脱脂,中性氧化铝柱净化 样品溶液供液相色谱-串联质谱仪检测,外标峰面积法定量 试剂和材料 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 乙睛:色谱纯 4.2甲醉 4.3正己炕,使用前以乙晴饱和 4.4中性氧化铝;活度I级 4.5无水硫酸钠:经650C灼烧4h,置于干燥器中备用 4.6中性氧化铝净化柱:取一空的固相萃取柱管,下部填人少量脱脂棉,装人2g中性氧化铝(4.4),上 部再填充4g无水硫酸钠,使用前装填 伊维菌素、,阿维菌素、多拉菌素,乙酰氨基阿维菌素标准物质;纯度>99% 4.8100 /ml标准储备液;准确称取适量的伊维菌素、阿维菌素,多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素标 4g/ 准品(精确至0.1mg),用乙睛分别配制成1004g/mL的标准贮备液，一18C储存
GB/T22953一2008 4.90.5004g/mL混合标准工作液;准确吸取0.500mL伊维菌素,阿维菌素,多拉菌素和乙酰氨基阿 维菌素标准储备液(4.8)至100ml容量瓶中,以乙晴稀释并定容,此混合工作液的浓度为0.5004g/ml -20C储存 4.10基质混合标准工作溶液;根据需要,吸取不同体积的混合标准工作液(4.9),用空白样品提取液配 制成不同浓度的基质混合标准工作溶液,使用前配制 4.11滤膜:0.2Am 仪器和设备 5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪,配有电喷雾电离源 5.2分析天平:;感量0.1mg和0.01g 5.3组织捣碎机 5.4匀浆机转速大于或等于8000r/min 5.5离心机.转速大于400到min. 5. 超声被水浴 5了 液体混匀器 5.8固相萃取装置 5.9氮吹仪 试样的制备与保存 取样品约500g用组织捣碎机捣碎,装人洁净容器作为试样,密封,并标明标记,于一18C冰箱中 保存 制样操作过程中应防止样品受到污染或残留物含量发生变化 测定步骤 提取 准确称取2g组织样品准确至0.01g)至50ml 离心管中,加人8m乙晴(4.1),匀浆机上 8000r/min均质20s,4000r/min离心5min,上清液转移至50ml.离心管中;另取一50mL离心管加 人8ml乙晴,洗涤匀浆刀头10s,洗涤液移人前一离心管中,用玻棒捣碎离心管中的沉淀,液体混匀器 上振荡30s,生000r/min离心5min,上清液合并至50mL离心管,离心管中的沉淀再加人6mL乙睛 用玻棒捣碎离心管中的沉淀,液体混匀器上振荡30s,4000r/min离心5min,上清液合并至50ml离 心管中,乙睛定容至25.0mL刻度,混匀备用 7.2净化 向上述装有样品提取液的50mL离心管中加人10mL乙睛饱和的正己烧(4.3)脱脂,涡旋振荡 1min,4000r/min离心5min,弃去上层正己烧,重复此操作一次,下层乙晴溶液待用 将中性氧化铝净化柱(4.6)安置在固相萃取装置上,准确移取10.0mL已脱脂的样品提取液至中 性氧化铝净化柱中,控制流速在1nL/min~2mL/min,用2mLX2乙睛淋洗净化柱,收集全部流出 液,流出液转移至吹氮管中,50C下氮气吹至干,用1.00ml乙晴浴解残渣,并置超声波水浴中超声振 荡10min,0.2m滤膜(4.11)过滤,供液相色谱-串联质谱测定 7.3测定条件 7.3.1液相色谱参考条件 色谱柱:IntersilC8-3柱,5Am,1501 nX4.6mm(内径)或相当者; a mm b 柱温:40C; 进样量:25L; c
GB/T22953一2008 d 流速:0.8mL/min 流动相;甲醇十水,梯度洗脱,见表1 表1梯度洗脱程序 时间/minm 甲醇/% 水/% 0.00 75 25 3,00 100 10.00 1o00 75 25 10.01 75 15.00 25 7.3.2质谱参考条件 a)离子源:电喷雾电离源(ESI); D) 扫描方式;负离子扫描; e)检测方式:多反应监测(MRM); d)雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体;使用前应调节各气体流 量以使质谱灵敏度达到检测要求,喷雾电压、去集簇电压、碰撞能等电压值应优化至最佳灵 敏度; 监测离子对和相应的参考质谱参数,见表2 伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素的监测离子对和相应的参考质谱参数 表 定性离子对 定量离子对 采集时间 去簇电压" 碰撞能量" 化合物名称 m/ m/) ms 873.7/567.8 -37 75 伊维菌素 873.7/229.2 100 873.7/229.2 -50 871.7/565.2 40 阿维菌素 l00 -80 871.7/565.2 871.7/229.3 -54 897.6/591.4 -38 897.6/591.2 多拉菌素 100 897.6/229.0 -51 912.5/270.0 -49 乙酰氨基阿维菌素 912,5/565,4 100 -82 912.5/565，4 -37 7.3.3液相色谱-串联质谱测定 7.3.3.1定性测定 每种被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同试验条件下,样品中待测物质的保留时间 与标准溶液中对应的保留时间偏差在土2.5%之内;且样品谐图中各组分定性离子的相对离子丰度与浓 度接近的标准溶液谱图中对应的定性离子的相对离子丰度进行比较,偏差不超过表3规定的范围,则可 判定为样品中存在对应的待测物 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 以%表示 20GB/T22953一2008 质混合标准溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线 用标准工作曲线对样品进行定量,样品溶液中待测 物的响应值均应在仪器测定的线性范围内 四种阿维菌素的标准物质的多反应监测(MRM)色谱图参 见附录A中的图A.1~图A.4 四种阿维菌素的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见附录B中 的表B.1 7.4平行试验 按以上步骤,对同一试样进行平行试验测定 7.5空白试验 除不称取试样外,均按上述步骤进行 结果计算 河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素的残留量按式(1)计算 xYxH一 X= (1 式中: -试样中被测组分残留量,单位为微克每千克(4g/kg); -从标准工作曲线得到的被测组分亲液浓度,单位为纳克每毫升(ng/ml) -样品溶液最终定容体积,单位为毫升(mL) -样品溶液所代表最终试样的质量,单位为克(g) n 计算结果应扣除空白值 精密度 一般规定 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,重复性和再现性的值 以95%的可信度来计算 9.2重复性 在重复性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,被测物的添加浓度 范围及重复性方程见表4,表5,表6. 表4添加浓度范围及重复性和再现性方程(基质为河豚鱼肌肉单位为微克每千克 化合物名称 添加浓度范围 重复性限" 再现性限R r=0.243朋-0.242 R=0.273m 伊维菌素 550 阿维菌素 5~50 "=0.325m一0.76 R=0.26172m十0.277 多拉菌素 550 广=0.228m+0.072 gR=0.965lg川一0.591 5 乙酰氨基阿维菌素 50 lgr=1.39lgm一1.05 R=0.376m 43 注:m为两次测定结果的算术平均值 表5添加浓度范围及重复性和再现性方程(基质为鳗鱼肌肉单位为微克每千克 化合物名称 添加浓度范围 重复性限" 再现性限R r"=0.109m十0,367 R=0,217m-0.188 伊维菌素 550 550 片=0.234川-0,702 R=0,191m十0.149 阿维菌素 多拉菌素 550 r=0.229m一0.363 R=0,262m-0.587 乙酰氨基阿维菌素 5~50 广=0.199m一0.563 R=0.203m-0.240 "为两次测定结果的算术平均值 注;川n
GB/T22953一2008 表6添加浓度范围及重复性和再现性方程(基质为烤鳗 单位为微克每千克 化合物名称 添加浓度范围 重复性限r" 再现性限R 伊维菌素 550 lgr=0.883lgm一0.583 gR=1.15lgm一0.875 550 =0.252m-0.771 R=0,288m-0.775 阿维菌素 550 "=0.239m一0.020 R=0.232m+0.214 多拉菌素 乙酰氨基阿维菌素 550 r=0.295m-1.200 R=0.248m一-0.478 注:m为两次测定结果的算术平均值 如果差值超过重复性限,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 9 再现性 在再现性试验条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,被测物的添加浓度 范围及再现性方程见表4,表5,表6
GB/T22953一2008 附 录A 资料性附录 标准物质多反应监测(MRN)色谱图 伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素标准物质多反应监测(MRM)色谱图见 图A.1一图A.4 6. 1.5e4 1.0e4 5000.0 0.0 /minm 图A.1阿维菌素标准物质的多反应监测(MRM)色谱图 6,6 3000 2500 2000 50o 1000 500 /min 图A.2伊维菌素标准物质的多反应监测(MRM)色谱图 6.3 1.00e4 8000.00 导 6000.00 4000.00 2000.00 0.00 /min 图A.3多拉菌素标准物质的多反应监测(MIR色谱图
GB/T22953一2008 6.0 2.0e45 1.5e41 1.0e4 5000.0 o /min 图A 4乙酰氨基阿维菌素标准物质的多反应监测MIRM)色谱图
GB/T22953?2008 ? B ?? ??????????? B.1 B.1??????? ??? ? ??g/ke) ?% 101.2 10 l04.1 ? 20 103.0 99." 50 104.9 l10 964 ? 20 l04.4 50 l02.7 ? 92." 1o 964 20 93.2 50 96.1 101.7 85." 10 ??? 20 864 89.9 s0 95.7 99.2 10 ? 20 l00.0 50 104.6 95.2 1o 102.0 ? 2o 994 50 o1.6 ? 80.1 97." 10 20 102.0 s0 93.0 83.2 l10 92.6 ? 20 86.1 50 96.8
GB/T22953一2008 表B.1续 样品基质 添加水平/ 平均回收率/% 化合物名称 g/kg 96.7 10 l04.0 伊维菌素 2o 92.0 50 l03.0 105.0 10 98.3 阿维菌素 20 l06.0 50 106.0 烤鳗 85.3 1o 97.0 多拉菌素 20 91.3 50 o1.0 87.9 10 90.2 乙肤氨基阿维菌素 20 89.8 50 l04.0