明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法

明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法

国家标准 GB/T25165一2010 明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法 Protelofidentifieaton.ofbovine.caprine.ovineandporeinederived aterialsingelatin一RealtimePCRmethou 2010-09-26发布 2011-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T25165一2010 前 言 本标准由农业部提出 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口 本标准起草单位;检验检疫科学研究院 本标准主要起草人:陈颖,吴亚君、袁飞、王晶徐宝梁、张舒亚、杨海荣,王斌、赵勇胜
GB/T25165一2010 明胶中牛羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法 范围 本标准规定了明胶中牛,羊,猪源性成分的实时荧光PCR检测方法 本标准适用于明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测 该方法的检出限为0.1% 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB6783食品添加剂明胶 GB/T14699.1饲料采样 GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 3 实时荧光CRrealtimePCR 在cR反应体系中加人荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个eR扩增过鞋 3.2 ct值eyelethresholad 每个反应管内的荧光信号达到设定的闵值时所经历的循环数 原理 利用实时荧光PCR技术,根据不同物种的特异性基因序列对牛、羊、猪源性成分进行鉴定 利用裂 解液破碎细胞,厨、三氨甲烧抽提蛋白质,异丙醉沉淀得到DNA;以提取的DNA为模板进行内参照基 因的实时荧光PCR检测,以确定样品DNA的提取效率;通过特异性引物和标记荧光物质探针进行牛、 羊,猪源性成分的实时荧光PCR扩增,根据PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的强弱判定,实 现对明胶中牛,羊、猪源性成分的定性分析 检测用引物和探针 内参照引物探针序列及牛,羊、猪特异性引物探针序列见表1
GB/T25165一2010 表1检测用引物和探针 名 称 序 列 目的基因 5'-CcTGAGAAACGGCTACcAT-3" 内参照5'端引物 真 核生物 内参照3'端引物 5'-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3 18SrRNA基因 内参照探针 5'-(FAM)-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-(TAMRA)-3 牛5'端引物 5'-CCGATGGATGTGTTCAGAGCT-3 生 3'端引物 生长激素基因 5'-G;CCAAATGTCTGGGTGTAGATACC-3" 牛探针 5'-(FAM)-TGGGCTTTAGGGCTTCCGAATGTGAA-(TAMRA)-3 羊5'端引物 5'-ACACAACTTCTACCACAACCC3" 线粒体细胞色 羊3'端引物 5'-AAACAATGAGGGTAAcGAGGG3" 素b基因 羊探针 5'-(FAM)-ACACCGAAACAAAATACTCCTTGAGAAACA-(TAMRA)-3 猪5'端引物 5'-TTTGTGCATGACTGCGTCAAC3 5'-cTTGGTGGTCGTGGTCACTGT-3 猪3'端引物 肮蛋白基因 猪探针 FAM)-CACCGTCAAGCAGC-(NFQ)(MGB)-3 试剂 苯酚(Tris饱和酚,pH8.0)、三氯甲婉、异戊醇,无水乙醇、异丙醇、70%乙醇 除另有规定外,所有试剂均为分析纯 实验用水符合GB/T6682中二级水的要求 配制溶液 7.1裂解液 成分包括:2%质量浓度)CTAB(cetyltrithylammoniumbromide,十六烧基三甲基嗅化铵). 100mmol/1Tristrishydroxymethylaminomethane，三羚甲基氨基甲炕)，1.4nmol/INaC. 20mmol/1EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸),用Hcl调至pH8.0 实时荧光PCR反应混合液 12.万L反应体系包括;1U一2u(Unm,脖学单位)的T.n孵.1XcRbufer.3.了mma/几一 4.0mmol/L的Mg+,0.2U1U的UNG酶,0.2mmol/L的d(A,C,G)TPs,0.2mmol/L 0.4mmol/L.dUTP、400nmol/LROX染料(某些荧光PCR仪不需要ROX校正) 仪器设备 8.1实时荧光PCR仪 8.2恒温水浴锅 8.3离心机:离心力不小于3000g" 8.4微量移液器;0.5AL10AL,10L100AL,20AL200AL,200AL1000L 8.5核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 8.6pH计 8.7天平;感量0.01g 样品采集 按照GB6783对食用明胶采样,按照GB/T14699.1对饲料明胶采样,将实验样品粉碎,充分混合 均匀后待用 2
GB/T25165一2010 10 检验步骤 10.1NA提取 称取样品500mg于50mL离心管中,加人5mL裂解液,室温过夜后置于65C恒温箱中温育 1h一2h，取出后迅速加人与裂解液等体积的室温酚-三氯甲烧-异戊醇(25;24;1)注意:如果样品因 温度下降凝固而无法获得上清,可将样品再次放人65C恒温箱中使其重新液化),颠倒混匀,室温下 12000g离心10min,转移上清至另一灭菌的离心管中,加人等体积的三氯甲烧-异戊醉(24:1),颠倒 mm.转移上清至另一灭菌的离心管中,加人0.恳信异丙孵或2倍体积的 混匀,室温下12000g离心10m 预冷无水乙醉混匀,-20笔放置0.5h~1h,4C下12000g离心10min~15min,弃上清,用70%乙醉 一次,4C下120g 洗涤沉淀- 离心10min,弃上清，室温下晾干 加人50AL双蒸水,溶解沉淀 20C保存 也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA DNA提取过程中以水代替样品设置提取空白对照,并置于每个提取系列中的最后 10.2实时荧光CR扩增 反应体系的体积为25L体系组成见表2 表2实时荧光CR检测反应体系组成 试剂名称 贮备液浓度 加人PCR反应体系的体积/Al. 反应混合液 12.5 5'端引物 04mol/L 3'端引物 10mol/L 探针 104mol/L 模板 补足至总体积为25 双燕水 实时荧光PCR反应条件随仪器不同略有改变，一般为:50C2min;9510min;95C15s60g nmin45个循环 检测过程中分别设阳性对照,阴性对照和提取空白对照 用分别含牛、羊、猪成分的样品作阳性对 照,用不含牛、羊、猪成分的样品作阴性对照 样品设3个重复,对照设2个重复,以Ct平均值作为最终结果 结果判定 11 11.1PCR有效性判定 空白对照;无FAM荧光信号,相应Ct值>40.0 阴性对照;无FAM荧光信号,相应Ct值>40.0 阳性对照:有FAM荧光信号，且FAM通道出现明显的扩增曲线.Ct值<36.O 否则判定为CR无效 11.2DNA提取有效性判定 在同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常的情况下,被检测样品应有FAM荧光信号检出 且FAM通道出现明显的扩增曲线.Ct值<40.0 否则DNA提取无效,应重新提取DNA,直至Ct值<40.0. 11.3检测结果判定 在符合11.1和11.2的情况下,使用牛、羊、猪特异性引物和探针对被检样品进行检测:
GB/T25165一2010 如有FAM荧光检出,且C值<36.0,则判定样品含有相应的动物源性成分 如C值>40.0,则判定为不含相应的动物源性成分 如36.0