牛、猪的肝脏和肌肉中卡巴氧和喹乙醇及代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法

牛、猪的肝脏和肌肉中卡巴氧和喹乙醇及代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T20746一2006 牛、猪肝脏和肌肉中卡巴氧、隆乙醇 及代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Methodforthedetermination oftheresiduesofcarbadox，olaquindoxand relatedmetabolitesinbowineandporcineliverandmuscletissues LC-MS-MSmethod 2007-03-01实施 2006-12-31发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T20746一2006 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录 本标准由秦皇岛出人境检验检疫局提出 本标准由国家质量监督检验检疫总局归口 本标准起草单位:秦皇岛出人境检验检疫局、深圳出人境检验检 疫局 本标准主要起草人:;庞国芳、谢丽琪、欧阳姗、蓝芳、林黎涂小坷 本标准系首次发布的国家标准
GB/T20746一2006 牛、猪肝脏和肌肉中卡巴氧、唾乙醇 及代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了牛、猪肝脏和肌肉中卡巴氧及其代谢物脱氧卡巴氧、唾嗯琳-2-竣酸和唾乙醇代谢物 3-甲基唾嘻啾-2-梭酸残留量的液相色谱-串联质谱测定方法 本标准适用于牛、猪肝脏和肌肉中卡巴氧及其代谢物脱氧卡巴氧、呤恶啾-2-拨酸和眸乙醇代谢物 3-甲基咋恶嘛-2-酸残留量的测定 本标准的方法检出限:卡巴氧,脱氧卡巴氧、呤嗯啾-2-叛酸和3-甲基畦嗯琳-2-叛酸均为0.54g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分:总则与定义 (GB/T6379.1一2004,Iso5725-l:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,.ISO5725-2;1994,IDT GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T66821992, 1IsO3696:1987 ,neq 原理 用乙睛十乙酸乙酯(1+1)溶液提取肌肉和肝脏组织中的卡巴氧,提取液经正己炕脱脂后,旋转蒸发 至干,残渣用甲酸(0.1%)十甲醇(19十1)溶液溶解 样液供液相色谱-串联质谱仪测定,内标法定量 用甲酸溶液消化试样,使组织中天然存在的酶失活,然后加人蛋白酶水解,盐酸酸化,离心过滤后， 过ohuiMAx因相草取桂或相当者净化 先用二氧甲梳洗脱脱氧卡巴氧,再用2%甲酸乙酸乙酯游被 洗脱恶琳-2-竣酸和3-甲基畦恶琳-2-拨酸,氮气吹干洗脱液,残渣用甲酸十甲醇(19十1)溶液溶解,样 液供液相色谱-串联质谱仪测定,内标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 甲醇:色谱纯 4.2乙睛:色谱纯 4.3甲酸;色谱纯 正己婉 4. 4 4.5乙酸 4.6浓盐酸 4.7乙酸钠
GB/T20746一2006 4.8二甲基甲酰胶 4.9乙酸乙酯 4.10中性氧化铝;200目300目 4.11乙睛+乙酸乙酯溶液(1+1). 4.12甲酸乙酸乙酯溶液:2% 向400mL乙酸乙酯中加人10ml 甲酸,用乙酸乙酯定容至500mL 4.13甲酸溶液;0.6% 量取6.0mL甲酸,用水溶解、定容至1L 4.14甲酸溶液;0.1% 量取1.0ml甲酸,用水溶解、定容至1L 15 甲酸十甲醇溶液(19十1) 用190mL甲酸溶液(4.14)与10mL甲醉(4.1)混合 6 盐酸溶液;0.lmol/L 量取8.3mL.浓盐酸,用水溶解、,定容至1L 4.17盐酸溶液;0.3mol/L 量取25mL浓盐酸,用水溶解、定容至1L e蛋白酶;sigmaP5147或相当者,，一18C以下保存 4.18Protease 4.19蛋白酶水溶液:0.01g/ml 称取1.00gProtease蛋白酶(4.18),用水溶解、定容至100mL,4c 保存 4.20乙酸溶液10% 量取100mL甲酸,用水溶解,定容至1L 4.21乙酸钠溶液:0.05mol/L，pH=7 称取6.8g乙酸钠纳用800ml水溶解,再滴加10%乙酸溶液 以调节溶液pH=7,用水定容至1L 4.22乙酸钠十甲醇溶液(19十1) 用190mL乙酸钠溶液(4.21)与10mlL甲醇(4.1)混合 4.23甲醇水溶液(14) 4.24Tris碱SigmaT1503或相当者 4.25Tris溶液;1.0mol/L 称取121Tris碱,用水溶解、定容至1L,4C保存 卡巴氧、,脱氧卡巴氧,、呤嗜啾-2梭酸、3-甲基畦嘻曝-2梭酸、呤飕啾-2-梭酸-d4标准物质;纯度 4.26 >99% 4.27标准储备溶液;l00mg/L 准确称取适量标准物质,卡巴氧用二甲基甲酰胺溶解定容,其余标准 物质分别用甲醇溶解定容,配成100mg/1的标准储备液,在一18C保存,可使用1年 基质混合标准工作溶液;根据灵敏度和使用需要,用空白样品提取液配成不同浓度(4g/L)的基 4.28 质混合标准工作溶液,在4C保存,可使用1周 4.29内标工作溶液;准确称取适量内标标准物质,用甲醇溶解定容,配成1004g/L的标准工作溶液， 在4C保存,可使用1周 4.30阴离子交换柱:OasisMAx60mg,3ml,或相当者 用前分别用3ml甲醇和3ml水活化,保 持柱体湿润 4.31滤膜:0.2m 仪器 5.1液相色谱-串联质谱仪;配有电喷雾离子源 5.2固相萃取装置 5.3氮气浓缩仪 5.4液体混匀器 5.5分析天平:感量0.1mg和0.01g 5.6真空泵 5.7均质器 5. 1000 移液器:10L100L和100 kL 0l0
GB/T20746一2006 5.9聚丙烯离心管.50ml,具塞 5. .10pH计;测量精度士0.02pH单位 5.11低温离心机;可制冷到4c 5.12玻璃离心管:15mL 试样制备与保存 试样的制备 将牛,猪肝脏和肌肉组织样品充分搅碎,均质,分出0.5kg作为试样,置于清洁样品容器中,密封， 并做上标记 6.2试样的保存 将制备好的试样于一18c以下保存 测定步骤 7.1卡巴氧的前处理步骤 7.1.1称取5g试样,精确至0.0g 置于50ml聚丙烯离心管中,加人5g中性氧化铝(4.10). 7.1.2加人25mL乙睛+乙酸乙酯溶液(4.11),于液体混匀器上充分混合5min,以5000r/min离心 5nmin,将上清液移取至另一干净的50ml离心管,加人10ml正已烧(4.4)到管内,振荡2nmin,以 5000r/min离心5min,弃去上层正己婉.将下层清液转移至150mL鸡心瓶中 7.1.3重复7.1.2步骤一次,合并两次提取液于同一鸡心瓶中,加人一定量的畦飕琳-2-梭酸-d4标准 溶液(4.29),使其浓度为2.0ng/g,40C水浴,减压旋转蒸发至干 .1.4准确加人1.0mL甲酸十甲醉游被(.15)游解残渣,过0.2pm谴膜后,供液相色谱-申联质谱 仪测定 7.2脱氧卡巴氧,隆曝琳-2-羚酸,3-甲基唾腮琳-2-酸的前处理步骤 7.2.1称取5g试样,精确至0.01g 置于50m聚丙烯离心管中,加人10ml.0.6%甲酸溶液 (4.13),混匀后,置于(47士3)C振荡水浴中振摇1h;先加人3mL1.0mol/儿LTris溶液(4.25)混匀,再 加人0.3ml蛋白酶水溶液(4.19),充分混匀后,置于(47土3)C振荡水浴中酶解16h18h 加人 20 mL.0.3mol/几盐酸溶液(4.17) ),振荡5min,在10C以5000r/min离心15min,上清液过滤 将滤液(7.2.1)移人OasisMAx固相萃取柱(4.30)中，待样液全部流出后,用30ml.乙酸钠十+ 甲醉溶液(4.22)淋洗固相萃取柱,真空抽干15min. 7.2.3 在一支干净的玻璃管内加 定量的唾恶啾-2-叛酸-d4标准溶液(4.29),使其浓度为 2.0ng/g,再用4×3ml二氧甲婉将脱氧卡巴氧洗脱至管内,在45C用氮气浓缩仪吹干 7.2.4固相萃取柱再用3×3mL甲醇、3mL水、3×3mL0.1mol/L盐酸溶液(4.16)和2×3mL 甲 醇十水溶液(4.23)分别淋洗,真空抽干15min,然后用2mL乙酸乙酯再淋洗固相萃取柱,弃去全部淋 出液,最后用3ml 甲酸乙酸乙酯溶液(4.12)洗脱憧嗯啾-2-叛酸和3-甲基畦嗯啾-2-叛酸到7.2.3所用 试管中,在45C用氮气浓缩仪吹干 准确加人1.0mL0.1%甲酸十甲醇溶液(4.15)溶解残渣,过 0.2am滤膜,供液相色谱-串联质谱仪测定 7.3色谱测定 7.3.1液相色谱条件 色谱柱;lnertsilODs3，34m，100mm×2.1mm(内径)或相当者; a b)流动相甲醇、乙睛以及0.1%甲酸溶液,梯度洗脱条件见表1 流速;0.2ml/n c min;
GB/T20746一2006 柱温:30C; 进样量:30l 表1梯度洗脱条件 时间/nminm 甲醇/% 乙睛/% 0.1%甲酸/% 13 8o 40 5 15 10.0 10.1l 64 16 20 13.1 13 S 80 20,0 13 7.3.2质谱条件 离子源电喷雾离子源， a b)扫描方式;正离子扫描 检测方式;多反应监测; c d 分辨率;单位分辨率 电喷雾电压5000V; 雾化气流速;8.0L/min g 气帘气流速:7.0L/" min; 辅助气流速;5.0L/min; 离子源温度:450C 定性离子对、定量离子对及其他质谱参数见表2 表2各种化合物的定性离子对、定量离子对、去簇电压、碰撞电压、碰撞池出口电压 定量内标 碰撞池出 定性离子对 定量离子对 去簇电压聚焦电压碰撞电压 口电压 化合物名称 离子对 m/: m/:) m/ 31 4!9 120 263.2/90.1 卡巴氧 263,2/231.l1 179.2/133.2 263.2/231.1 31 19 18 120 12 175.0/129.2 23 26 120 呤嗯啾-2-叛酸 175.0/131.2 179.2/133.2 175.0/131.2 26 21 12 120 26 49 140 231.2/143.2 脱氧卡巴氧 231.2/143.2179.2/133.2 31 331 10 231.2/99.2 15o 26 23 12 120 189.2/143.l 3-甲基瞠啄啾2-梭酸 179.2/133.2" 189.2/145.1 189.2/145. 26 21 12 120 液相色谱-串联质谱测定 7.4.1 定性测定 每种被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同试验条件下,样品中待测物质的保留时间， 与混合标准工作溶液中对应的保留时间偏差在土2.5%之内,各分析化合物的参考保留时间见表3;样 品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比 较,若偏差不超过表4规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物
GB/T20746一2006 表3各分析化合物参考保留时间 化合物名称 卡巴钢 咋愿啾-2-梭酸 脱氧卡巴钢 3甲基唾嘻琳-2-梭酸 保留时间/minm 9.11 9.95 14.43 l0,97 表4定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 50 2050 1020 10 允许的最大偏差 士25 士30 士20 士50 7.4.2定量测定 用混合标准工作溶液(4.28)分别进样,以分析化合物和内标化合物的峰面积比为纵坐标,以分析化 合物和内标化合物的浓度比为横坐标作标准工作曲线,用标准工作曲线对样品进行定量,样品溶液中卡 巴氧,脱氧卡巴氧、唾嗯啾-2梭酸、3甲基瞠嗯啾-2叛酸的响应值均应在仪器测定的线性范围内 卡巴 氧、脱氧卡巴氧、憧嗯咻-2-拨酸,3-甲基憧恶咻-2拨酸的标准总离子流图见图A.1 7.5平行试验 按以上步骤,对同一试样进行平行试验测定 7.6回收率试验 阴性样品中添加标准溶液,按步骤7.1一7.4操作,测定后计算样品添加的回收率 结果计算 试样中每种化合物残留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算,计算结果应扣除空白值: x是xxI X=e,× 式中 试样中被测物残留量,单位为微克每千克(ug/kg); 基质标准工作溶液中被测物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/ml); 试样溶液中被测物的色谱峰面积 基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积; 试样溶液中内标物的浓度,单位为纳克每毫升ng/ml); 基质标准工作溶液中内标物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL) 基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积 试样溶液中内标物的色谱峰面积; 样液最终定容体积,单位为毫升(mL); 试样溶液所代表试样的质量,单位为克(g). m 注;计算结果应扣除空白值 精密度 本标准的精密度数据是按照GB/6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,重复性和再现性的值 以95%的可信度来计算 9.1重复性 在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,组织中四种分析化合物 的含量范围及重复性方程见表5
GB/T20746一2006 表5含量范围及重复性和再现性方程 含量范围 化合物名称 基质 重复性限" 再现性限R 4g/kg gr=0.8440lgm-1.0221 lgR=0.7889lgm-0.8393 猪肉 卡巴氧 0.5一5.o 猪肝 lgr=0.8338gm-0.8836 lgR=0.7944lgm-0.814 猪肉 gr=0,9146lgm一0.9994 lgR=0.9781lgm一0.7866 脱氧卡巴氧 0.55.0 猪肝 gr=0.7831lgm一0.9677 lgR=0,7412lgm一0,7812 猪肉 =0.8298lgm一0.9644 lgR=0.9405lgm一0.8263 gr 唾嘻琳-2梭酸 0.55.0 猪肝 g尸=0.8849lg朋-0.913 lgR=0.7935lg川-0.7782 猪肉 gr=0.9715lgm-0.976 IgR=0.7760lgm-0.7212 3-甲基畦喝啾-2梭酸 0.55.0 猪肝 lgr=0.8346lgm一0.9198 lgR=0.7555lgm-0.7238 注:朋为两次测定结果的算术平均值 如果差值超过重复性限,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 9.2再现性 在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,组织中四种分析化合物 的含量范围及再现性方程见表5
GB/T20746?2006 ? A ?? ?? 10.87 8.0e4 7.5e4 7.0e4 6.5e4 6.0e4 5.5be4 14.43 9.11 5.0e4 4.be4 4.0e4 9.95 3." 3.0e4 2.5e4 2.0e4 16.20 1.5e4 1.0e4 5000.0 0.0 11 12 13 15 16 17 18 1920 l/min ,9.llmin; -?-2-,9.951 min; -3-??-2-,l0,97nmin; -,14.43 ?A.1???
GB/T20746一2006 附录B 资料性附录) 回收率 本方法中卡巴氧、脱氧卡巴氧、唾嘻琳-2-梭酸、3-甲基呤恶啾-2-酸在四种基质中的添加浓度及其 平均回收率的试验数据,见表B.1 四种目标化合物添加浓度及其平均回收率的试验数据 表B.1 平均回收率/% 药物名称 添加浓度/g/kg) 猪肉 猪肝 牛肉 牛肝 0.5 79.8 80.2 81.4 84.8 89.0 l.0 89.l 90.1 89.7 卡巴氧 2.0 89.6 91. 92.0 92.3 5.0 87.2 89.2 85.8 86.8 83.0 82.2 81.8 78.8 0.5 92.1 91.6 87.3 87.0 脱氧卡巴氧 2.0 96.7 89.1 94.9 96.6 5.0 84.6 83.1 83.0 85.o 0.5 81.8 80.0 80.8 80.2 1.0 87.5 88.0 86.7 84.9 唾恶啾-2-梭酸 2.0 92.9 94.9 92.7 94.9 5.0 85.4 84." 86.0 82.8 0.5 76.2 77.6 78.0 76.2 1.0 86.4 84.8 83.2 85.2 -甲基瞠愿琳-2-梭酸 2.0 94.6 96.2 93.9 92.8 5.0 82.2 82.8 81.4 84.8