水产源致敏性蛋白快速检测毛细管电泳法

水产源致敏性蛋白快速检测毛细管电泳法

国家标准 GB/T38578一2020 水产源致敏性蛋白快速检测 毛细管电泳法 Rapiddeterminationoftheallergenicproteinfromaquatieanimalsorigin- Capillarelectrophoresis 2020-03-31发布 2020-03-31实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/38578一2020 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由标准化研究院提出并归口 本标准起草单位:标准化研究院、绿城农科检测技术有限公司、浙江工商大学、北京工商大学、 北京萨姆伯科技有限公司集美大学、湖南农业大学、温州大学,荣成市华通海洋生物科技有限公司 本标准主要起草人;马爱进、王川丕、何晓明、周瑾茹、傅玲琳、贾英民、吴琦、郝帅、刘光明、周辉、 陈孝敬、王拙、刘翼翔、刘忠甫、王彦波
GB/38578一2020 水产源致敏性蛋白快速检测 毛细管电泳法 范围 本标准规定了用毛细管电泳法测定水产源致敏性蛋白的方法 本标准适用于甲壳类原肌球蛋白、甲壳类精氨酸激酶和鱼类小清蛋白含量的快速检测 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T30891水产品抽样规范 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 致敏性蛋白allergenicprotein 能够使机体产生过敏反应的蛋白质 原理 试样中的致敏性蛋白经蛋白提取液提取和阴离子交换层析纯化,采用毛细管电泳法测定,迁移时间 定性,外标法定量 试剂或材料 S 除非另有规定,仅使用分析纯试剂 5.1 水 GB/T6682规定的一级水 5.2甲醇 色谱纯 5.3三羚甲基氨基甲烧-盐酸缓冲液 三胫甲基氨基甲烧1.21g,加900mL双蒸水溶解,用6mol/L盐酸溶液调pH至7.5,用蒸僧水定 容至1000mL,用0.454m滤膜过滤,超声震荡(功率200w)30min,室温保存
GB/T38578?2020 5.4?? ?14.61g,???,500mL,0.454m?,(200w 30nmin,±档 5.5λ? ?8.00g,0.20g,1.44g,0.24g,?? ???1000mlL,6mol/?pH7.4,0.45m?,( 200W)30min,±档 5.6??????? 98% 5.7????? >98%. 5.8С嵰 >98% 5.9??? ????(????????С嵰)0.0010g,1mlλ ?1.5mL?,??,?1mg/mL???,?100L?1, ?20"C 5.101mol/? 4.00g,???100ml,0.45m?,(200w) 30min,±档 5.110.1mol/L? 0.400g,???100ml,0.45Mm?,(200w 30min n,±档 5.12-?? ??(NaBo.loH.o0.9525x8DmL??ν.1mal/? ?pH9.2,??100mL,0.45m?,(200w)30nmin, 档 5.13??? ????5AL10!L25L40AL50AL,?51.5mL?, 1mlλ?,??,????????54g/ml,104g/ml,254g/mL 40g/mL504g/ml.4C2? 5.14?? ?0.174g,10ml,??,?20
GB/38578一2020 5.15蛋白提取液 在预冷的1mL裂解液中分别加人1AL蛋白酶抑制剂、10L磷酸酶抑制剂及5L0.1mol/L苯 甲基磺酰氟溶液,混匀后置冰上保存待用 仪器设备 6 6.1高效毛细管电泳仪:配有波长范围为214nm一220nm的紫外检测器、正极高压组件、石英毛细管 总长45cm,内径75Am). 6.2低温离心机:13000片 pH计精密度0.. 6.3 6.4微孔滤膜:0.45m,水相 6.5分析天平;感量0.01g,0.001只和0.0001g 6.6蛋白纯化仪;配有自动分部收集器 试验条件 7.1毛细管柱处理方法 新毛细管柱活化 依次用甲醇冲洗10min,蒸懈水冲洗5min,0.1mol/L氢氧化钠溶液冲洗 30min,蒸水冲洗5min,最后再用碉酸-碉砂缓冲溶液冲洗20min 每种样品分析前,用砌酸-碉砂缓冲溶液冲洗毛细管5min 试验后,依次用蒸僧水冲洗3nmin 0.l1mol/L氢氧化钠溶液冲洗5min,蒸水冲洗3min 7.2测试操作条件 测试操作条件见表1 表1测试操作条件 鱼类小清蛋白 甲壳类原肌球蛋白 甲壳类精氨酸激酶 参数 波长/anm 214 温度/ 25 3447.5 进样压力/Pa 进样条件 进样时间/s 分离电压/kV 15 18 分析条件 检测时间/min 1015 10~15 10~15 8 样品制备 按GB/T30891规定,抽取具有代表性的水产源样本至少500g,用四分法缩减至100g;放置冰上 切成糜状,用液氮研磨至粉末状,低温保存备用
GB/T38578一2020 9 试验步骤 9.1蛋白提取 快速称取研磨后的样品0.100g放人1.5mL预冷离心管内,加人l.0ml蛋白提取液,漩涡混匀后 4！ C静置2h,10000r/min,4离心5min,取上清液,分装保存于-80,应避免反复冻融 提取蛋 白上清液后,再用阴离子交换层析(1mlDEAEsepharoseF.F.预装柱)纯化蛋白上清液,2ml蛋白上 清液以0.5ml/min的流速上样,再用40mL0.01mol/I三胫甲基氨基甲烧-盐酸缓冲液和0.5mol/I 氧化钠溶液线性洗脱,洗脱速度为1mL/min,根据出峰情况,收集蛋白洗脱液,所得样品一80C冷冻 备用 g.2蛋白提取率测定 在按第8章处理好的样品中,加人1mg致敏性蛋白标准品,用液氮研磨至粉末状 快速称取研磨 后的加标样品0.100g放人1.5mL预冷离心管内,加人1.0mL蛋白提取液,漩涡混匀后4C静置2h、 10000r/min,4C离心5min,取上清液,分装保存于一80C,应避免反复冻融 提取蛋白上清液后,再用 阴离子交换层析(1ml.DEAEsepharoseF.F.预装柱)纯化蛋白上清液,2ml蛋白上清液以0.5nL/min的 流速上样,再用40mL0.01nmol/L三羚甲基氨基甲烧-盐酸缓冲液和0.5mol/儿氯化钠溶液线性洗脱 洗脱速度为1mL/min,根据出峰情况.收集蛋白洗脱液,所得加标样品一80C冷冻备用 采用CA达 测定样品和加标样品的蛋白含量 蛋白提取率按式(1)计算 ×V Q1" X p×V +n 式中 X 蛋白提取率,%; 加标样品液蛋白质量浓度,单位为微克每毫升(g/mL.) 加标样品液体积,单位为毫升(mL); -样品液蛋白质量浓度,单位为微克每毫升(4g/ml); V 样品液体积,单位为毫升mL); 致敏性蛋白标准品质量,单位为毫克(mg) mn g.3测定 g.3.1取样品液200AL置于样品瓶中,压力进样5s后,采用毛细管电泳法分离测定,分析时间为 10min15min 9.3.2采用外标校准曲线法定量测定 以系列致敏性蛋白标准溶液质量浓度为横坐标,毛细管电泳峰 面积为纵坐标,作标准曲线线性回归方程,样品的峰面积与标准曲线比较定量 标准溶液和样品提取液 中致敏性蛋白的响应值应在仪器测定的线性范围内 标准溶液毛细管电泳图参见附录A 9.3.3如果样品中的质量浓度超过了标准曲线的最高点,进一步对样品进行稀释 9.3.4每个测试溶液至少2张电泳图 9.3.5在进行3个5个样品检测后,应在仪器进出口换上新的棚酸-碉砂缓冲溶液 10结果计算 0.1致敏性蛋白含量按式(2)计算
GB/38578一2020 exV 2 m× 式中: -致敏性蛋白的含量,单位为毫克每克(mg/g); 样品液中致敏性蛋白含量,单位为微克每毫升(4g/mL); p -样品液体积,单位为毫升(mL); -样品质量,单位为克(g); mn X 蛋白提取率,% 10.2计算结果以平行测定值的算术平均值表示,保留两位有效数字
GB/T38578?2020 ? A ??) ??????? ?????????A.1 A.1 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00. ??/min ?A.1???????? A.2????????A.2. 0.016 0.014 0.012 0.010 0.008 0.006 0.004 0.002 0.000 --0.002 ??/minm ?A.2??????? A.3С嵰??????A.3. 0.040- 0.035 0.030 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 ??/minm ?A.3С嵰?????

水产源致敏性蛋白快速检测毛细管电泳法GB/T38578-2020

水产产品中致敏性蛋白的存在是导致许多人出现过敏反应的主要原因之一。目前，常用的检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹法（Western Blot）等，但这些方法需要较长的检测时间，且操作复杂，严重制约了快速检测的应用。毛细管电泳法作为一种新型的检测方法，具有检测时间短、操作简单、准确度高等优势，已经被广泛应用于生物医学和食品安全领域。

毛细管电泳法是一种利用电场作用将荷电生物大分子在毛细管中进行分离的技术。其原理是将待检样品注入带电毛细管中，在高压电场的作用下，不同质量和电荷的蛋白分子会在毛细管中向不同方向迁移，从而实现分离和检测。相比其他检测方法，毛细管电泳法具有操作简便、灵敏度高、分辨率好、自动化程度高等特点，逐渐成为水产源致敏性蛋白检测中的一项主流技术。

GB/T38578-2020标准规定了水产源致敏性蛋白的快速检测方法，并详细介绍了毛细管电泳法的应用。该标准要求使用专业的毛细管电泳仪器进行检测，同时需要对仪器进行相关的校正和验证，以保证测试结果的准确性。在具备上述条件的情况下，使用毛细管电泳法检测水产源致敏性蛋白的效果尤为显著。

总之，毛细管电泳法作为一种新型、高效、精准的检测方法，在水产源致敏性蛋白的快速检测中具有广阔的应用前景。随着技术的不断发展，相信毛细管电泳法将能够更好地服务于水产产品质量与安全的保障。

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