GB/T31807-2015
棉花根腐病菌检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofPhymatotrichopsisomnivora(Duggar)Hennebert
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2015-11-27
- 文件格式PDF
- 文本页数22页
- 文件大小2.62M
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棉花根腐病菌检疫鉴定方法
国家标准 GB/T31807一2015 棉花根腐病菌检疫鉴定方法 DetetionandidentifieautiomfMhymaoriehopisomniora(Duggear)Hleebert 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中毕人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管厘委员会国家标准
GB/T31807一2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAc/TC271)提出并归口
本标准起草单位;宁波出人境检验检疫局,珠海出人境检验检疫 局、检验检疫科学研究院
本标准主要起草人;张慧丽,张卫东,段维军,徐瑛、陈先锋、崔俊霞、杜洪忠,吴品珊
GB/T31807一2015 棉花根腐病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了棉花根腐病菌的检疫鉴定方法
本标准适用于棉花根腐病寄主植物的植株、种子及介质的检疫鉴定 仪器设备和主要试剂 2.1仪器设备 显微镜,解剂镜,天平(感量1A0e,10wR)pH计,制冰机,纯水仪,讽旋振荡器,台式离心 机、高速冷冻离心机、低温冰箱、冷藏冷冻冰箱、超净工作台、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪 微量移液器(2l.0l.0l.20Al.100l 2.2主要试剂 除另有规定外,所有试剂均采用分析纯
包括无菌双燕水,次氯酸钠,液氮,蛋白酶K、氯化镁,氢氧 化钠、醋酸铵、氯化钾、无水乙醇、溴化乙锭、三氯甲烧、异丙醇、异戊醇、TaoDNA聚合酶、dNTP混合 物、10×PCR缓冲液、琼脂糖、DNA相对分子质量标准物.cTAB、Tris/EDTA/SDS提取缓冲液 (TEs)、Tri、砌酸盐EDTA缓冲液(TBE)、Tris/EDTA缓冲液(TE)等
分离培养基、产袍培养基、 马 铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)配制方法及步骤见附录c 病菌的鉴定 3.1症状检查 将可疑植株的根部在解剖镜下镜检,将带有菌丝索或菌核的病根挑出
种子类样品,从中挑选夹带 的植株残体,尤其是根部病残体
介质土借助湿筛挑出其中的菌核(参见附录B)
3.2病原菌的分离培养 3.2.1病根上菌丝索的分离培养 在解剖镜下,将病根上覆盖的菌丝索挑下,用无菌水洗涤菌丝片段,洗净后置于分离培养基上 28C黑暗培养,每天观察,待长出菌丝后,挑取菌丝尖端转移到PDA平板上纯化
3.2.2病残体上病原菌的分离培养 在自来水下将病残体洗净,切取病健交界处组织.用1%次氯酸钠进行表面消毒3min,无菌水冲洗 3次,灭菌滤纸吸干表面水分后,置于分离培养基上,28C黑暗培养,每天观察,待长出菌丝后,挑取菌 丝尖端转移到PDA平板上纯化 3.2.3菌核上病原菌的分离培养 菌核上病原菌的分离培养方法同3.2.2
GB/T31807一2015 3.3分生抱子的诱导 将纯化好的菌株接种到产抱培养基上,28C,每天光照16h
每天观察,待产抱后，显微镜下观察 分生袍子的形态特征
3.4CR鉴定方法 PCR鉴定方法见附录D 鉴定特征 症状特点 4.1 寄主植物受侵染后,根的表面覆盖有棕褐色至金黄色菌丝索(参见B.1),根部变软,腐烂,皮层易剥 落,中柱变色或出现红褐色病斑(参见B.1),有时根表面还可以看到棕色至黑色的菌核
4.2病菌的形态特征 病菌在PDA平板上菌落初为白色,后变为污黄色(参见B.2)
分生袍子梗球形或椭圆形,大小 (12m~204m)×(20um~30um),少数情况下分生抱子梗呈棍棒状或串珠状,其顶部产生分生抱 子,外观上类似“担子”(参见B.2)
分生袍子单胞,透明,球形或卵圆形,着生于多分枝的菌丝上,直径 4.8 5.5 54m或(6m 8pm)x(Spm一6m)(参见B.2)
菌丝索褐色,直径约200pm,成直角伸 丛mm mm5mm,单 出侧枝,侧生菌丝呈十字形分枝(参见B.2)
菌核棕色或黑色,圆形或不规则形,直径1 生或串生,萌发后长白色菌丝,后变污黄色(参见B.3)
4.3CR特异性扩增 的特异性扩增片段为627bp P.onizora 结果判定 根据棉花根腐病菌的为害症状及病原菌形态特征对病菌分离物进行综合判定,分离物的为害症状 及形态特征与第4章各项鉴定指标吻合,判定为棉花根腐病菌,分离物的为害症状及形态特征不明显的 情况下,分离物需要进行PCR鉴定,PCR特异性扩增阳性,可判为棉花根腐病菌
样品保存与结果记录 样品保存与处理 经检验确定携带棉花根腐病菌的样品,视样品的状态采用相应的保存方式.妥善保存6个月.以备 复核
保存期满后,应经灭菌处理 6.2菌株保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为棉花根腐病菌的菌株,应妥善保存
对不需要长期保存的菌株应及时 高压灭菌处理
GB/T31807一2015 6.3结果记录与资料保存 需要保存的记录包括;样品的种类、自然状态,来源、被为害症状及为害程度(无症状也要说明),诊 断时使用的方法(包括质控物质,以及每种方法获得的结果).PcR检测应有电泳结果照片,鉴定实验室 的名称,负责人和鉴定人的签字等
GB/T31807一2015 懒 录 A 资料性附录 棉花根腐病菌相关信息 A.1背景资料 A.1.1棉花根腐病菌基本信息 r)Hennebert 学名:Phymatotrichopsisomniora(Du )uggar) 异名; uo/richuomnivorwDuggar,O:oniuomnioruShear,O:oniwauriomum" Phymn Iink 英文名;Phymatotrichumrootrot,Texasrootrot 分类地位:半知菌门(De Deuteromycota),丝抱纲(Hyphomycetes),丝袍目Moniliales),淡色抱科 Moniliaceae),拟瘤梗抱属(Phyme totrrichosis
传播途径;病原菌可通过病根、混有病残体和菌核的土壤等进行远距离传播
近似种;波状根盘菌(Rhisinaundaaa)引起的松苗根腐病,在地下产生菌丝索,覆盖在受侵染的 根表面,与棉花根腐病引起的症状相似,但是波状根盘菌在子囊盘上形成子囊抱子,抱子纺锤形或棱形 无分隔,两端突尖,含两个小油滴
A.1.2方法原理 根据棉花根腐病菌在寄主植物上的症状,对病原菌进行分离培养,采用形态学和分子生物学方法对 病原菌进行鉴定(参见附录B附录C A.2地理分布 非洲;利比亚
北美洲;墨西哥(北部)和美国西南部的9个州,包括亚利桑那州、阿肯色州加利福尼亚州、路易斯 安那州,内华达州,新墨西哥州,俄克拉荷马州、得克萨斯州,犹他州
中美洲;多米尼加共和国
南美洲;委内瑞拉
A.3寄主 主要寄主是棉花,还可以侵染2300多种双子叶植物,但不侵染单子叶植物(参见表A.1). 表A.1棉花根腐病菌的寄主 学名 中文名 学名 中文名 Abeliachinensis 糯米条 Acaeciafarnesiana 金合欢 AheliaXgrandifora Acaciagreggi 大花糯米条 猫爪相思树 铁览菜属 Abuiloincanumn 茴麻属一种 Aca/yphsp 背麻 异株五加 Abuiloheophrasn Aeanhopaa.rsiebollian4s
GB/T31807?2015 A.1() ? ? ?? Aeernegundn ?е Ahemisarensis Acersacchariu Antheiscotulea ? Acersaccharohornn Antirrhinaius Achilleamilleoiumn ? Apiosaericaa ? Aoc3yumandrosaemifoliumn ? Achras2apota cnidalamariscina ? Apocy ?? y71nca7nab1u7 Aconilwmsp ? Aguilegiacanadensis ?? ?? ? Aesculwshippocasaumn Arabissp. ?? 仨 Aesculuspaia Arachishypogaea ? Araliasi7osal Aesculwssp ? ? Agrimnoniapbescens Araucarriabrasiliana ? ? Sp Arbtsnen?iesi Agrostemnagihago ? Arrctimlapa Ailanhusalissima Arctiumminus С? ? ? Aleurilesfordi Arcosaphylosmanzanila Alioia ? Arctosfaphyossp. Sp. Alnusglutise ?? Arrctotisstoechhadlifolia ? ? ? Alsrubrra AreariaSp. A/nusteuiolia ?? Argeoneme.ricanad Ahaearosea Argeoeplatyceras aranthuscaudalus β? Argemonesp ? Amaranthuusgraecizans Argyreiaspeeiosa ? Aarathusretroflerus Aroraeiarstieaa ?? Aaranthussp Aroni1elacara ? Aarnttsspioss Arleisiabiei Amnbrosiaartemisiiolia Arlemnisiasp. Ambrosiabidentata ? Asclepias Ambrwsiapsilostachya Asclepiassriaca ? Ambrosi/ri/fida Asclepiastuerosd ? Asiniatrilob Amelanchieralmifolia ? Amorphasp .Astrugalwssp. ε ?? Atrile.2batulavarha.statal Anelhumgraeolens Atriplersp. ? AngelicaSp ? Baccharissp. Aoasgaosa
GB/T31807?2015 A.1() ? ? Bapisiasp. Caraganaarborescens Bellisberei Caricaaaya ? С ??? Berberiscandlesis Carissagrradliflorra ? ?С Berberisthbergin ariscaroliiaa Berberisulgaris ?С Caryaillinoensi ? Beauulgaris ? Car Belaulgarisvar.cicla ? CassiaJfasciculala ?? Belulanigra Cassiamarilandieau ?? Bidenssp Cassiaprocumbens ?? Boerh7icerecta Cassisp ? Boerhaiasp. Ca.ssiatora ? Casaneaumila 黹 BrassicacanpestrisVarnapobrassica ? Casaneasatiua ?? Br.ssicoleracevarbotrytis Catalpabignonioides ? Bbrassiaolerueavar.capiatad ? Ceraoiasilioua Celas/rwsorbiewlala Brussicaoleraceavar.gongylodes Celislaeigala Brassieaoleraceavaruirilis ? Celisoccidlentalis ? Brassicarapa Centaureaaericaa Brickeliasp ?? Centauresp ? Brousonetiaapyrijera ?? Cerra.sti41Uiscos4 Budlej4daidi ? Cerastiumuwlgalun ? Budalejasp. Cordiaboissieri ?? ? ? Cercidliuoridun Bumelialanuginosa ?? Cerciscaadlesi (Caesalpiniagilliesin 绨 ?? aesalpiiallcherria Cercisoccidenalis ? Cereisreni/ormi ?? Caianscaian Calendulaoficinalis ? Cereus Callirhoeinolwcrala ? Chaeomelessp. ? Callistephu4schinensis Chamueypari sP ? C'hamaee.yparishyoides Caloyctionaculeatum ?? Caassiasciloiles Chelidoiumaius Cansisradlicans Cheop0dliualbunn Cannabissatiua Chenoodiumambrosioide Capsicumfrulescens Chilopsislinearis ??
GB/T31807?2015 A.1() ? ? ?? Chioanthsirginicus Cornws4speriolia Crwsantheci1erarioli1 ?? Cornuslorida ? hrsanthenleucathem Cornussp. Corylusamericana ? Chrysantheorifolin ? Cowryluscornuta Cichorienira C'ichorium ? bipinnalws ? 17nlbS CoS710S Ciculamaculala ?? Cosmossulhurews ? CCinnaomumcamphoru Cuinuscogygria ?? Cisss Cotoeaster s9 ? (Crataegssp Cilrwllusvuwlgaris ??? Crotalariainteredlia Citrusaurantifolia C/rusaurantiumn . ??? Crotalaria Citruslimomn Crolalariaspectabilis ? Citrusnobiis ? Croomonanhogyn4s ?? 1 ??? Citrwsnobilisvarunshiu Crotonterensis Cirwssinensis Cryplostegiugraundilora У? Cuucuismelo Cilrwssp ? Citrsarradisi Ctucissatius Caytoniacaroliniana ?? Cucurbilama.rima Cemmatis Cucurbitamoschata ? Clethrualniolia ? Ccurbilaepo ? ? ? Calalspeeiosa Cwcwrbilapepovarmelopepo ? ? Celr Cubressusarionica sp. ? к? Citorialariana Cubressusseperuires ? ? Cnidoscolste.ras yaosistetragonolob Cydoniaoblonga ? Cocculscarolis Cocculustrilobus ? ? Cyarascol5s Codiaeumariegalum ?? Cyododaclylomn Conwlvwlusarvensis Cynoglossuoflieinale ? Coolwlusjaponicus Dahliauriabili ?? Cozoluulussebiu Dalea s? ? Dianthsbarbatus Datrra1eleloidles Dianthuscarohyllus ? Daturastramonium Coreopsissp. ?? Dacscarota ??
GB/T31807?2015 A.1() ? ? ? ?? Dacuscurolvarsativu Euonym4sjaponica ì Delphiniumajacis Euomymwssp ? Eubatoriumcoelestinum ? DelbhiniuSp. ? ? Desc4rrainiapinata4 Eupatorirugosm ? Euatoriun DeSoli4sp ? Euphorbiacorollala Dnntheraamer1ca7a Feijoasellowiana Euphorbiacyarissias ??? ? ? Fie4scaried Euhorbiaenlala ? ?? Eubhorbieaculeata Dianthusplumarius ? Euphorhiamarginala ? Dichodracarrolinesis Euhorbiamili ÷ Dierillalonicera Dierillasp. ? Euphorbiapulcherrima ? Dioscoreasp. Eo/lewlussp. Diosyrste.rana ? Eysenhardliao/ysachyu ? ? Diospyrosirginiana Feijasellowiaa ? ? Dipscwssylows/ri Fic4scarice ? ? Dolichoslablab Firiasiubler è? Foeiculnlgare Do.ranthaunguis-cali Ecehinacepururea ο? ? Forestierrqc'4inta Echinocactus Forsyhia Elaeagnsangustifolia ? Fouquieriasplendens ī? Elaegnssp. Fraserisp. Ehedlrasinica Fra.xinussp ? Epilobiumang4sti/olium Froeliehiasp. ? ?? Erechtiteshieracifolia Gaillarrdiaaristata - Gaillardiapulchella ? Erigeronann4u5 Erigerocanadlensis С?? Galiumsp. Eriowryajaoica Gardeniajasminoides ? ? ??? Garryalaescens Eriogomum SP. ?? Eryngiumsp Gaurubienis ? Gauracocceie ??- ? Eryhrinasp У ?? Gaturasp. Eucalypuscamaldulensis Eucalypt4slongirostri У? Gelsemiumsemberirens ? Euonyn4salropururews ?ì ?? (Geri41caroliia14
GB/T31807?2015 A.1() ? ? ?· ? Gewmcanadense" Hibiscuspalustris Gestriectu · ? Hibiscussabdarifa Hibiscussyriacu ? Gilia 5Y Ginkobilo ? Hibiscustrionumm Gledi/siatriacantho Hlieraeiumauruntiacwmn ?? Glolidium Hieracium ? es1car17mn Glycinema.x Housoniasp. ? Gnaphaliumsp. Hydrangeaaniculata ?? ?? Gordlonialasiaths HyudruangedAaniculaaacw.granadlora?? Gossypiumherbaceu7mn Iydrangeupeliolaris ? Grosspi41hirsutmn Hydrangeasp. ? ? Gossypinindlicmn Hdrastiscanadesis Hyeopappuscaroliniensis ?? Gossypiumn Grevwillearobusta Hypochaerisradieata è ? Grevillesp. lercassine ? Ilerdleeilua ? Grindeliasp. ? Ile.rzonitoria 趬 Gulierresiasp Gymn0cladusdioica ? Idligoferasp. Haplouppussp ? ? Ipooebattq Hederahelia ?? ??? Ipooeahederacea Heleniumautumnale ? 1pooeanil ?? ???? Heleniumtenuifolium ??? Ipooeapurpurea ??? Heliantheu1ulariu lpooeasp ?? Helianthsa4s Iza.ranhifolia ?? Jacarandaacuifolia Helianthsma.riiliani Helianhuseliolaris ? Jatrohasp. Helianhussp. ? Iuglansnigra ? Helianthustuberosus Iuglansregia Heliopsishelianthoides Juglanssp. ? Heliopsisscabra Jwmiper4schinensis Iuniberscounis ??? Hemereallissp ??? Heraclea.ri4 Inibershorizontalis ibiscuscanabin4s Juniperusachyhoea ?? Hibiscusesculenlus ?? JipersScoplorm
GB/T31807?2015 A.1() ? ? ?? Juniperwssilieieola Linumlewisin ? ? Juniperussp Linumrigidum ? ? Iinsulcal41 Jumiperusvirginiana Kalmialatilia ?? lipiaSp iquidambars/yracilua Kerriajapoica Kochiascoparia ? ILiriodendronluwlipi/eru ? Koelreuleriasp. Lihospermumarense" ? ? ? Kramerialanceolata Lobeliainlata ? ? Krigiasp. Lobeliasiphililica ? Kuhniasp Lobeliasp ? Lactalcasativa Loniceraorrowi ? ? seriola Loiceraseperuirens ? ? lagenariasiceraria Loicera Lagerstroemiaindica ? ?? l0iceratatarica ? ? Lantanahorrida Lwpurshianuas ? ?? Lappulaechinale Lupinuserenis ? IuinussD. ? Lappulasp ? ? Lari.rlaricia Luissubceross Lychnisalba ? ? Lathyrsoorats " laaterrasp. Lyci4crolini1 Lepidiumcampestre" ?в Lycopersicoesculenlum ?в Lepidiumdensiflorumn Lysimachiasp. ?в ? Lebidliusatiu Maackiaauresi Maeluraomifera ? в Lepidiumwirginicum ? Magolia a.grandiwa ILespedezaSp ? Malusuccata ? erellesp. Lesguere Lecohylumfrulescen3 ?? Malussp. ? Lia/rispycosachya ??? Malussylesris ? Libocedrwsdecurrens Ф Malusp ? Ligws/rwsp Malastrusp. Malauiscusdrummondim Lioniusp ? 廨? ? Linariasp. Maanillariasp. Mangiferaindlica ? Linarielgaris Linderasp ? Manihoesculenta ? 10
GB/T31807?2015 A.1() ? ? Mathiolaincana Passiflorusp. ? Pastiacasatiza ? Medicugoarabica ?? Melicagohisbiadla Pauloiatoentosa ? Medicagolupulina PaOiap. Medicagosativu ?? ? Pesteocobaea Meliaacedarach Penstemon Melilolusalu ??? Persea aeric71 ???? ? Melilousindica Pelalostemosp. ? Melilousofieinalis Petroselinumcrispum Phacelia ? Mentelialaeuiculis sp Phaseol4sacutioiu ?? lenteliasp. Mmosa ? Phaseol4saureus ? Mirabilisjalaa Phaseoluslimensis ? Mollugoerlicillala ? Phaseolusulgaris ? ?÷ Neriumoleander Philadelh4ssp. ? ?? NieandruMhysalodes Phlorpaniculata ? Nicotiagleauc Phoeni.rdlaaclvlifera ? Photiniaarbutiolia ?? icotiaatabcun ?? Photiniaserrwlata Nyssasp ?? Physalis ? Oeotherrlaciiata Oenothera ? Physocarpussp ? OHeaeuropaea Phytolaccaameriecana ? Ocobasbi1osa ? Piceaengelmanni ? ? Os1athhsilieifoliuu Piceasp. ? Pimpinellaanisum OtryaUirginiana ? Pin4seehinala ? Orybphs1cagine ?? Pin4snigra ? Oryedr44rrboremn Pachyrhizusangulalus Pin4sponderosa ? Paeonialacti/lorw Pin4staea ? ? Pakinsonia Pistaciachinensis sp. ? Pistaciesp. ? Partheniumargentatum ? Parthenisp. Pisaeciaera Partheocisusguinguefolia ?? Pisumsatiumn ? Parthenociss4stricusidala ? Pittosorumsp. ? 1l1
GB/T31807?2015 A.1() ? ? ?? ?? Plantagoaristata Psoralealenuilora ?? Plantagolanceolata Pleleatrifoliata ? ? Plantagosp. Puerariathunbergiana ? ? Platasoccidentalis Punicagranalum" Platanuswrighti ?? Pyracann athasp. Pa/y grandiflorumn ? Pyruscomm4nis 'c0o77 Pyrusmalus ? Plwmeria sp ? Polygonumavieulare Qwamoclipennata ?? Quercuscerri Polygonumlapathifolium ? Polygomwmersicariad Quercsmacrocarad Polygomsp Quercspalustris Poneirustrioliatla Quereushello5 ? Populusalha Quercsrinus ? Populwsdelloides ? Quercusirginiana ? ?? Populwsnigra Rawnculusrepens Raculus ? Populwssp. Sp. ? Pobulusxcanadlesi Raha1ssaliz ? Ratibidacolumnaris ?? Portulacagrani/lorau Polentillasp. ? ? Rhamnuscaroliniana Rheumrhaonticumn ?? Primwlaoonid Prooscideaouisianicd ? Rhododendroarborescens ?? ?? Prosopissp. Rhododendrocataubiense Rhscobali1 Prunusamygdalus ? Prusaeniaca Rhu.xlahra ? Rhussemeriren ? Prnscapulh ? Rhusto.ricodendron1 Prunuscerass ? Rhustriloala ? Pr41sdoestic4 ? Rhusyhina Pr1MslMrocer.suSsN η? Rh4seri1 'r1s1So11alHa Prunusbersica Ribessp. Prunsserotina ? Ricinscouis ? ? Prnssp. Riuinahmnilis Pseudosu tsugata.rifoli Robiniahispida ?? Psiiumgajata ? Robiniaseudoacacia ? 12
GB/T31807?2015 A.1() ? ? Robimisp. ? Silphiumsp. ? Solaucarolie1se Rosasp ? Solanelaeagnifoliun Rub4ssp Rudlweckiusp. ? Solanelogeavaresculentunn Rudleckiatriloua ? Solanmigrm Rumererisp4s ? Sulanum rOstral(m Rwmersp. ? Solanumtuerosum ??? Saccharumofieinaru Solidagoalissima -?? Salirmigra Solidagosp. ? Sali.rsp. Sonchusaspe7 ? ? Salsolakali Sonch4solerace4s Saliagreggi β? Sohoradlaidi ?? Salviasplendlens - Sophorajuponica Sambucuscanadensis ??? Sophorasecundiflora ? ??? ? Sambnuwpuhen Srbwsueriua ? Sbeculariainora ? - Sapindusdrummondi Sabiusebiferunn SbergulaarTesi ? Sphaeraleeanusti/olia Sapoariaoficinali Sassafrasalbidwmn ? Spinaciaoleracea Scabiosaatropurpurea ? 軨 Spiraea Scabiossp. 軨 Steironeacilialtumn ?? ? Schin4smolle Sieironemasp. ? Stellariamedia Schin4sterebimhifolius ? Stenolobiustan. Sculellariasp. ? ?? SeecioSp. Srillingialinearifolia ? ? Seguoiasemperuirens Slrophoslyleshelola ? Symplocostinctoria ?? Sesie.rallata Sesuiumporlulacasrum Syringaamuresis Shepherdiaargentea ?? Syringavwlgaris ? ? Sidahedleracea Syringa>ehimensis Sidlcerhonbifolia ?? Tabebuisp. ? ?? ? Sidlasbiosa Taaridlsidlica Sleneantirrhina ?? Tamnari.rsp. Silenesp ? Tara.racumofficinale ??? 13
GB/T31807?2015 A.1() ? ? ? Ta.rodiumsp. Vaceiniumarorewm ?? Valeriaella ± Tephrosiasp ? sp. Thuiaoccidetalis ??? Verba.scunblattaria Thujiaorientali ?? Verba.scthaps4s Tliaamericana ? Verbenabipinnatifida ?? Tra ? ? Verbena ? g1a Truagopogonorrifolius ?? Verbeahywrida ?? 筳 ?? Trifoliumincarnatum Veresinaencelioides ? Trifoliubratense Vernonia sp. ? ? Trifoliumrocumbens Veroicaarzensis Trifoliumrepen ? ? Veronicaofficinalis sugadiersifolia ??? Veronicaeregrina ? Tst Umusamericana Veroica Umuscrassifolia ? ?? Veroicsrmr7ic4mm ? Um4spumila Vinceto.ricumsp ? Umussp. Violaodorata iola Ulnushoasi - sp. Ungnadiasecioa ī? ?? Vileragn4-asus ? Urticadioica Vitislabrusca Urticagracilis ?? ? Vitisrupestris Urticasp ? Vitisiniera ???? ? Viciaangustifolia washingtoniasp. Vieiafaba ? Weigelasp. ?? wiseriasp Viciasatiza Vignacyindrica ü ? Xanthinsaccharrat4n Vigasiensi Zeamay ? Vignaunguiculala Zinniaelegans ? Viguierasp. ? 14
GB/T31807一2015 附 录 B 资料性附录 棉花根腐病菌为害症状及形态特征 说明: -受侵染的棉花根部,箭头示菌丝索; -去除表皮后皮层受害状 注:a引自s.M.MARKER2009,b引自s.R.UPPAL.APATI2010
图B.1棉花根腐病菌为害症状 说明 棉花根腐病菌在PDA上的菌落形态; 分生袍子梗和分生袍子,标尺为251 5m; 菌丝索,标尺为100继m:; 分生袍子在分生袍子梗上萌发,标尺为10丛m; 担子状分生抱子,标尺为10m 直角分支的菌丝,标尺为50Mm
c、d 注b一g引自s.M.MARKER2009
图B.2棉花根腐病菌形态特征 15
GB/T31807一2015 图B.3棉花根腐病菌针状分支菌丝体 说明 -湿筛法从土壤中获得的菌核" 菌核在分离培养基上萌发
注引自s.M.MARKER2009
图B,4棉花根腐病菌菌核及萌发 l6
GB/T31807?2015 ?c 淶?? ? c.1 ?(Agar) 20g ù(Streptomycinsulfate) 50mg ?(H.(O) 1000mL 121C?20min?47C??ù?, á ?[Ca(NO,;4H.o] 0.24g ?(KcD 0.65 (KH,PO) 0.01 (KNO. 0.07 ?(Mgso7H.,O) 0.04g ?(Ferrictartratey lg (Glucose) 20g ?(Agar) 25 g ?(H.O) 1000ml 121C?15nmin20min c.3?(PDA) (Potato) 200g (Glucose) 20g ?(Agar) 18 ?200g,???гС,?30min,??20g,?18g, ?1000mL,121C?20min 17
GB/T31807一2015 附录D 规范性附录 棉花根腐病菌的CR鉴定 D.1试剂 D.1.1Tris/EDTA/SsDS提取缓冲液(IEs 100mmol/LTri、-HCIpH8.0)、10mmol/LEDTA,20g/IsDs
D.1.2cTAB;/aC溶液 100g/LCTAB,0.7mol/INaCl D.1.3Iris棚酸盐EDTA缓冲液(TBE 这做在有熊.Tnw以后浦服织怎eaa几nrxmbwam.南倒水排是1we.md 使用 时稀释到0.5倍
D.1.4Iris/EDTA缓冲液(TE) 10mmol/1Tris-HCI,1mmol/LEDTA,pH8.0
D.2DNA提取 D.2.1收集经干燥过的菌丝约0.5只放人1.5mL浸在液氮里的离心管中,用塑料杵碾碎待用
D.2.2离心管中加人1mlTEs提取缓冲液,另加人1001 -200mg蛋白酶K,55C保温30min,期 mg 间轻轻混匀
D.2.3加人5nmol/LNaCl28l,cTAB/NaC溶液138Al,65C保温10min
D.2.44C13000g离心10min,保留上清液
D.2.5加人等体积的三氯甲婉:异戊醉(体积比24:1),轻轻混匀,冰浴30min; ;4c13000g离心 10min,保留上清液
加人50L5molL醋酸铃.冰浴至少30. D.2.6 min. D.2.7416000g离心10min,保留上清液
D.2.8加人约2/3体积的异丙醇沉淀DNA,13000g离心15min D.2.9 DNA沉淀用工n70%乙醉洗2次,窒阖干燥,用IwLTE缓冲液济解DNA备用
注:也可使用商业化试剂盒提取DNA D.3引物序列 P.omnivora的特异性引物的序列见表D.1 18
GB/T31807一2015 表D.1特异性引物序列 引 物 序列5'-3” 产物 PolTSA CCTGCGGAAGGATCATTAAA 627bp PoITSB GGGGGTTTTCTTTGTTAGGG 注引自s.M.Marek,2009
D.4PCR扩增 反应体系见表D.2,每个样品设2个平行处理
反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的 反应总体积进行适当调整
检测时以棉花根腐病菌DNA或含有棉花根腐病菌目标片断的质粒作为阳 性对照,以其他真菌菌株DNA作为阴性对照,以水代替模板作为空白对照
表D.2PCR反应体系 25反应体系 试剂名称 储备液浓度 加样体积/al 2.5 10×CR缓冲液 MgC 25mmol/L 1.5 dNTP混合物 2.5mmol/L TaqDNA聚合酶 5U/l 0.2 引物 10Mmol/I 各0.5 DNA模板 12 50ng/Al100ng/l ddHIO 补至25l PCR反应条件为:94c5min;94C30s.62C30s7230s.35个循环,72t10minm D.5产物检测 在0.5×TBE电泳缓冲液中,1.5%琼脂糖凝胶电泳,5V/cm,0.5%EB染色20min,凝胶成像仪分 析结果 D.6结果判定 在阴性对照和空白对照没有产生预期大小条带、阳性对照产生约627bp的预期大小条带情况下: -如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带,则为阳性; -如果检测样品没有出现与阳性对照大小一致的条带,则为阴性
GB/T31807一2015 参 考文献 ]方中达.农业植物病害[M].北京;农业出版社,1996;207 [2]cAIB.CropProteetionCompendium[EB/oL].[201107-09].htp: //www,cabi.org/epc/ [3]c.G.Cook,J.L.Riggs.IlsolationandldentificationofPh.ymatorichumOmniorumfrom KenafintheIowerRio-GrandeValleyofTexas,PlantDis,1993,77:1263-1263， [4]D.Dhingra,J.B.Sinclair.BasicPlantPathologyMethods[M].1995,2nded.lBoeaRaton;l.ewis Publishers. OEPP/EPPO.DatasheetsonquarantineorganismsNo.21,Ph.ymatotrichumomniwrum [5 BulletinOEPP/EPPOBulletin9(2). [6]s.M.Marek,K.Hansen,M.Romanish,R.G.Thorn.Moleceularsystematicsofthecottonroot rotpathogen,Phymatotrichopsisomniora].Persoonia.2009,22;63-74. [7]s,R.Uppalapati,C.A.Young,s.M.Marek,K.s.Mysore.PathogenprofilePhymatotrichum cottonrootrotcausedbyPhyatotrichopsisomnitora:retrospectsandprospects.Molecularplant pathology[].2010,11(3);325-334 [8]USDA-ARs.FungalDatabases,systematicMycologyandMlicrobiologyLaboratory[EB/ OL].[2011-07-09].http;//nt.ars-grin.gov/fungaldatabases/new_allviewgenbank.cfm?thisName Phymatotrichopsis%20omnivora&.organismtype=Fungus
棉花根腐病菌检疫鉴定方法GB/T31807-2015
棉花根腐病菌是一种会导致棉花根部坏死、叶片黄化、植株萎缩甚至死亡的细菌，对棉花的生产造成了严重的影响。为提高棉花产业的健康发展，中国通过发布《棉花根腐病菌检疫鉴定方法GB/T31807-2015》标准，制订了一套完整的棉花根腐病菌检测方案。
该标准的主要优点如下：
- 准确性高：该标准使用的鉴定方法经过多次验证，能够在不同环境下稳定地检测到棉花根腐病菌。
- 操作简单：该标准使用的步骤简单，无需专业技能，只需要普通培训即可掌握。
- 经济实用：该标准所需设备简单，成本低，适合于各种规模的农场和实验室使用。
该标准主要包括以下内容：
- 样品采集：按照规定的样品采集方法采集棉花根部和土壤等样品，并进行标识。
- 细菌分离：使用LB平板或选择性富营养培养基将样品中的细菌分离出来。
- 生化鉴定：通过测定细菌菌落特征、生理生化特性等方法对分离出来的细菌进行鉴定。
- 分子鉴定：使用PCR扩增和测序技术对细菌进行分子鉴定。
- 结果判读：通过比对阳性对照的鉴定结果，判断待测样品是否含有棉花根腐病菌。
总之，《棉花根腐病菌检疫鉴定方法GB/T31807-2015》标准的发布，对于保障我国棉花产业健康发展、维护农民利益、增加农产品出口均具有重要意义。
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