猪链球菌2型荧光PCR检测方法

猪链球菌2型荧光PCR检测方法

国家标准 GB/T19915.7一2005 猪链球菌2型荧光PCR检测方法 Methodofthereal-timePCRforthedeteetionofStreptocoeeussuistype2 2005-11-01实施 2005-09-27发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T19915.7一2005 猪链球菌2型荧光PCR检测方法 范围 本标准规定了猪链球菌2型荧光PCR检测方法 本标准适用于增菌培养物、疑似病料及生猪拭子、猪组织样品中猪链球菌2型的检测 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 GB/T19438.l2004 缩略语 本标准采用下列缩略语 荧光PCR 荧光聚合酶链反应 C值 每个反应管内的荧光信号量达到设定的值时所经历的循环圈数 DNA 脱氧核糖核酸 Ta酶 TaqDNA聚合酶 PBs 磷酸盐缓冲生理盐水 原理 采用TaqMan方法,在比对猪链球菌2型荚膜抗原2基因(c办s2)序列的基础上,设计针对该基 因的特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对 探针5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团 G用R表示),3'端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团(用Q表示),它在近距离内能吸收5'端荧光基 团发出的荧光信号 PCR反应进人退火阶段时,引物和探针同时与目的基因片段结合,此时探针上R 基团发出的荧光信号被Q基团所吸收,仪器检测不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时,Taq酶的5" -一3'的外切核酸酶功能将探针降解 这样探针上的R基团游离出来,所发出的荧光不再为Q所吸收而 被检测仪所接收 随着PCR反应的循环进行,PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系 猪链球菌2型荧光PCR检测实验室的标准化设置与管理 猪链球菌2型荧光PCR检测实验室的标准化设置与管理见GB/T19438.1一2004中附录C 试剂和材料 6.1试剂 除另有说明,所用试剂均为分析纯 6.1.1无水乙醇:一20C预冷 6.1.275%乙醉醇用新开启的无水乙醉和无DNA酶的灭菌纯化水配制,-20C预冷 6.1.30.01mol/LpH7.2的PESs.配方见附录A,(121士2)C、15min高压灭菌冷却
GB/T19915.7一2005 6.1.4猪链球菌2型荧光PCR检测试剂盒;试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录B 6.2仪器设备 6.2.1高速台式冷冻离心机;最大转速13000r/min以上 6.2.2荧光PCR检测仪、计算机 6. .2.32C~8C冰箱和一20C冰箱 .2.4微量移液器;0.5L~10L,5L一20L,20L一200L,200L~1000L 6 6. .2.5组织匀浆器 2. 混匀器 6 6 样品的采集与前处理 采样过程中样本不得交叉污染,采样及样品前处理过程中须戴一次性手套 7.1取样工具 7.1.1棉拭子,剪刀、慑子、研钵,Eppendorf管 7.1.2所有上述取样工具必须经(121士2)C、15nmin高压灭菌并烘干或经160C干烤2h 7.2采样方法 7.2.1生猪拭子样品 咽喉拭子采样,采样时要将拭子深人喉头及上聘来回刮3次一5次,取咽喉分泌液 7.2.2扁桃体、内脏或肌肉样品 用无菌的剪刀和锻子剪取待检样品1.0g于研钵中充分研磨,再加5.0mlLPEBS混匀,然后将组织 悬液转人无菌Eppendorf管中,编号备用 7.2.3血清或血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendo管中,编号备用 7.3存放与运送 采集或处理的样本在2C8C条件下保存应不超过24h;若需长期保存,须放置一70C冰箱,但 应避免反复冻融(最多冻融3次) 采集的样品密封后,采用保温壶或保温桶加冰密封,尽快运送到实 验室 操作方法 样本核酸的提取 在样本处理区进行 8.1.1提取方法1 8. 1.1.1取"个1.5ml灭菌Eppendor管,其中"为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之 和,对每个管进行编号标记 8. 1.1.2每管加人1.0ml.裂解液,然后分别加人待测样本,阴性对照和阳性对照各100L,一份样本 换用一个吸头;混匀器上震荡混匀5s 于4C25C条件下,10000r/min离心101 min 8 1.1.3取与8.1.1.1中相同数量的1.5mL灭菌Eppendor管,加人500L.无水乙醉(一20C预 冷),对每个管进行编号 吸取8.1.1.2离心后各管中的上清液转移至相应的管中,上清液要充分吸取. 不要吸出底部沉淀,颠倒混匀 8. 1.1.4于4C~25C条件下,5000r/min离心5min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放 置) 轻轻倒去上清,倒置于吸水纸上,吸干液体,不同样品应在吸水纸不同地方吸干 加人1.0mL 由指定单位提供,给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的认可 如果其他等效产品具 有相同的效果,则可使用这些等效产品
GB/T19915.7一2005 75%乙醇,颠倒洗涤 8. 1.1.5于4C25C条件下,5000r/min离心10min(Eppendor管开口保持朝离心机转轴方向放 置) 轻轻倒去上清液,倒置于吸水纸上,吸干液体,不同样品应在吸水纸不同地方吸干 8.1.1.64000r/min离心10s,将管壁上的残余液体甩到管底部,用微量加样器尽量将其吸干,一份 样本换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀一面,室温干燥5s~15s 不宜过于干燥,以免DNA不溶 8.1.1.7加人11L无DNA酶的灭菌纯化水,轻轻混匀,溶解管壁上的DNA,2000r/min离心5s、 冰上保存备用 8.1.2提取方法2 8.1.2.1取n个1.5ml灭菌Eppendorf管,其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之 和,对每个管进行编号标记 8.1.2.2每管加人100lDNA提取液1,然后分别加人待测样本,阴性对照和用性对照各10AL 份样本换用一个吸头,混匀器上震荡混匀5s,于4C一25C条件下,1300r/nmin离心10; min 8.1.2.3尽可能吸弃上清且不碰沉淀,再加人10LDNA提取液2,混匀器上震荡混匀5s 于4C 一25C条件下.,200/imn离心10s 8.1.2.4100C干浴或沸水浴10min;加人4OL无DNA酶的灭菌纯化水,l3000r/min离心10min 上清即为提取的DNA,冰上保存备用 8.1.3DNA提取后的处理要求 提取的DNA须在2h内进行PCR扩增或放置于一70C冰箱 8.2扩增试剂准备与配制 在反应混合物配制区进行 从试剂盒中取出猪链球菌2型荧光PCR反应液、Ta酶,在室温下融化后,2000r/min离心5s 设所需PCR数为n,其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和 每个测试反应体系需 使用15ALPCR反应液及0.3LTaq酶 计算各试剂的使用量,加人一适当体积试管中,向每个CR 管中各分装15L,转移至样本处理区 8.3加样 在样本处理区进行 在各设定的PCR管中分别加人8.1.1.7或者8.1.2.4中制备的DNA溶液 L.,使总体积达25L. 盖紧管盖后,500r/min离心30， 10 8.4荧光PCR反应 在检测区进行 将8.3中加样后的PCR管放人荧光PCR检测仪内,记录样本摆放顺序 反应参数设置 第一阶段,预变性92C3min 第二阶段,92c5s,.60C30s,5个循环,荧光收集设置在第二阶段每次循环的退火延伸时 进行 结果判定 9.1结果分析条件设定 读取检测结果 岗值设定原则以闯值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点,不同仪器可 根据仪器噪音情况进行调整 9.2质控标准 9.2.1阴性对照无C值并且无扩增曲线 阳性对照的cC值应之30.0,并出现特定的扩增曲线 9.2. 2 3 9.2 如阴性对照和阳性条件不满足以上条件,此次实验视为无效
GB/T19915.7一2005 9.3结果描述及判定 9.3.1阴性 无C值并且无扩增曲线,表明样品中无猪链球菌2型 9.3.2阳性 C值<30.0,且出现特定的扩增曲线,表示样本中存在猪链球菌2型
GB/T19915.7?2005 ? A 淶?? λ?? A.1A?0.2mol/L?? -?(NaH.PoH.O)27.6 E,?,?1o0mL. A.2B?(0.2mol/L?? ?(NaHPO" g,[??(NaHPo 7H.O)53.6 12H.O 71.6g?(NaHPO2H.O)35.6g]??,?1000ml A.30.01mol/LpH7.2λ? 14ml 0.2mol/LA? 0.2mol/LB? 36ml 8.5 ? g ??1 000mL
GB/T19915.7一2005 附 录 资料性附录 猪链球菌2型荧光CR试剂盒组成、说明及使用时的注意事项 B.1试剂盒的组成 试剂盒的组成见表B.1 表B.1猪链球菌2型荧光CR试剂盒组成 组成48tests/盒) 量 数 裂解液(提取方法1)或DNA提取液1(提取方法2),DNA48ml×1盒(裂解液)或5nml×1管(DNA提取液1). 提取液2(提取方法2) 1.6mL×1管(DNA提取液2) 750L×1管 猪链球菌2型荧光PCR反应液 Taq酶(5U/lL) 15nlL×1管 无DNA酶的灭菌纯化水 1mL×1管 管 阴性对照 1ml×1 阳性对照 1mlX1 说明 裂解液为DNA提取试剂,外观为浅绿色;DNA提取液1.,2为无色液体,-20C保存 B.2.1 无DNA酶的灭菌纯化水,用于溶解提取的DNA B.2.2 PCR反应液中含有特异性引物、探针及各种离子 B.2.3 B.3使用时的注意事项 B.3.1由于阳性样品中模板浓度相对较高,检测过程中不得交叉污染 B.3.2反应液分装时应尽量避免产生气泡,上机前注意检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄漏污 染仪器 B.3.3除裂解液外,其他试剂一20C保存,有效期为6个月