苹果锈果类病毒检疫鉴定方法

苹果锈果类病毒检疫鉴定方法

国家标准 GB/T31804一2015 苹果锈果类病毒检疫鉴定方法 DeteetionandidentifieationofApplescarskiniroid 2015-07-03发布 2015-11-27实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T31804一2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位检验检疫科学研究院、珠海出人境检验检疫局、中华人民共 和国厦门出人境检验检疫局、农业科学院植物保护研究所、北京出人境检验检疫 局青岛市农业科学研究院、山东出人境检验检疫局 本标淮主要起草人;张永江.廖力、廖富荣、辛言言、邓丛良、李世访马荣群、李明福、李桂芬、魏梅生、 张成标,吴兴海
GB/T31804一2015 苹果锈果类病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了基于寄主植物症状及基因组特征的苹果锈果类病毒检疫鉴定方法 本标准适用于可能带有苹果锈果类病毒的植物材料的检测鉴定 仪器设备、用具及试剂 2.1仪器设备 电子分析天平(0.001g),垂直电泳槽、小型离心机,台式冷冻离心机,普通PCR仪,实时荧光PCR 仪.电泳系统,pH计、凝胶成像系统、4C冰箱,超净工作台、一80C超低温冰箱,高压灭菌锅,制冰机、 涡旋振荡器、微波炉等 2.2用具 可调移液器(2.5L,l0L,20aL,.I00AL.1000L),吸头,离心管(0.2mL.0.5mLl.5mL)及研 钵等 2.3试剂 除有特殊说明外,所有试验用试剂均为分析纯或生化试剂 R-PAGE试剂见附录B;RT-PCR试剂见附录C;实时荧光RT-PCR试剂见附录D 检测方法 3.1R-PAGE测定 R-PAGE测定见附录B 3.2RI-PCR检测 RT-PCR检测见附录C 3.3 实时荧光RT-PCR检测 实时荧光RT-PCR检测见附录D 结果判定 样品经第3章中任意两种不同原理的方法检测为阳性,即可判定样品带有ASSVd
GB/I31804一2015 样品保存与结果记录 5.1样品保存 结果判定为阳性的样品应妥善保存,并作好登记和标记,以备复核用 保存期满后,需经灭活处理 5.2结果记录 完整的试验记录要包括;样品的来源、种类,时间,试验检测时间,地点、方法和结果,并有试验人员 的签字;RPAGcE测定应有银染色结果图片,RTPCR检测应有电泳结果图片,实时荧光RrR检测 应有扩增曲线结果图片
GB/T31804一2015 附 录A 资料性附录 苹果锈果类病毒相关资料 A.1背景资料 A.1.1苹果锈果类病毒基本信息 中文名称;苹果锈果类病毒 学名:Applescarskinviroid 缩写:ASsVd 异名;苹果斑纹类病毒(Dappleappleviroid),梨锈皮类病毒(Pearrustyskinviroid)Japanesepea fruitdimpleviroid,Apple'sabi-ka'viru、和Manshuringosabi-kabyo. 分类地位;马铃薯纺锤块茎类病毒科(Pospiviroidae),苹果锈果类病毒属(Apscaviroid. 传播途径;可通过嫁接、病健根系自然接触及带毒繁殖材料传播 A.1.2方法原理 根据Assvd在寄主植物上的症状进行初步判定;根据RNA自然状态和变性后的不同结构分子在 聚丙熔酰胺凝胶电泳中迁移率的差异进行往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(return-polyacrylamidegel electrophoresis,R-PAGE)检测;根据其核酸序列的特异性进行常规PCR或实时荧光PCR检测,通过 电泳条带大小或扩增曲线的变化进行结果判定 A.2寄主范围 仅限于蔷薇科(Rosaceae)的苹果属(Malus)和梨属(Pyrus)植物 很多苹果栽培品种能用作该类病毒的繁殖寄主 A.3地理分布 世界;美国、印度、日本、加拿大,英国意大利、阿根廷及波兰等国家和地区 ;江苏,安徽、山东,辽宁,新疆和陕西等苹果主产区 A.4基因组特征 AssVd为一共价闭合环状的单链RNA分子,长约330bp,分子质量为1.1×10u A.5症状 A.5.1锈果型症状;先从幼果果顶部出现淡绿色水溃状斑块,而后向果梗扩展成木栓化锈斑与纵纹(见 图A.1 A.5.2花脸型症状:病果在着色前无明显变化,着色后果面表现红绿相间的花脸状(见图A.2)
GB/I31804一2015 A.5.3锈果-花脸复合型症状:呈现既有锈斑又有花脸的复合型症状(见图A.3 图A.1 图A.2 图A.3 注:图A.2和图A.3引自http://www-intranet.angers.inra.r/dossiers/virus/
GB/T31804?2015 ?B 淶?? ????(R-PAGE B.1? B.1.1?? (GITC)4mol/L;0.5%?(CHaNNaO);0.1%?-100(Triton- 100);?(NaCI)10mmol/L;25mmol/(C,H.Na.O,)?(pH7.0);2%? ?(PVP);(CarierRNA)15"g/mL. B.1.20.5mol/1.??(NaEDTA2HO,pH8.0) ??(NaEDTA2H.O)186.1g,700mL?,(NaOH) pH8.0,?1000mL B.1.3?(DEPC)? 100ml?,??(DEPC)50Al,??,121C?20 min B.1.45???-(TBE)?? ??(Tris)27g,(H,BO.)13.75g,?0.,5mol/I? ?(NaEDTA2H.o,pH8.0)10mL,??400mL?,500mL B.1.530%? ??(CH,NO)29g,N,N'-????(C,HN,O)1g,?100mL, ?C档 B.1.610%??( ?0.1??[(NH,).s.o],?1mL. B.1.7???(TEMED) B.1.8?? ??(C,H,oH)30mL(C,H,O.,)3mL,?300mL B.1.9??? ?(AgNO))0.6g,??,300mL B.1.10??( amL?,?(N.oH3?HeHo1nL.?. B.1.11?? ??(Na,CO.)3.7g,??,300mL ?;?????(c,HNo)??,??,?? B.1.12?顣 鲽 B.2 B.2.1?RNA? ?0.1g?,2.5mL??,?5mL?,4C,5000r/min,
GB/I31804一2015 心5min,留上清液备用 取2mg纳米磁珠于1.5mL的离心管中,离心管置于磁性分离架上,吸附纳 米磁珠,弃上清液 向含有纳米磁珠的离心管中加人800L备用上清液,用枪反复吹打至没有明显结 再向离心管中加人400gL无水乙醉,颠倒混匀,室温放置5mim一10min,放置期间颠倒混匀几次 块 将离心管瞬离后,置于磁性分离架上,吸附纳米磁珠,弃上清液 向离心管中加人150L70%的乙醇 用枪吹打混匀,将离心管置于磁性分离架上,吸附纳米磁珠,弃上清液,并重复2次一5次,至上清液没 有明显颜色 将离心管瞬离后,置于磁性分离架上-吸附纳米磁珠,完全弃除上清液 向离心管中加人 约50AL无RNase的水,用枪反复吹打重新悬浮纳米磁珠,室温放置2; min5min 将离心管置于磁 性分离架上,吸附纳米磁珠,将含有RNA的上清液转移至一无RNA酶污染的离心管中,-80C冰箱 保存备用 注:或者选择市售商品化RNA提取试剂盒完成RNA的提取 B.2.2电泳 凝胶制备 B.2.2.1 聚丙烯酰胺凝胶浓度为5% 在小烧杯中按顺序加人双蒸水18.77mL.30%凝胶储备液5mL.5× TBE缓冲液6mL,TEMED20aL,l0%过硫酸铵(现配现用)210L,充分混匀后灌胶 然后插人样品 梳 待胶完全凝聚后在电泳槽内加人1×TBE电级缓冲液,然后轻轻拔掉梳子 B.2.2.2第一向电泳 常温下进行,电泳缓冲液为1×TBE,电泳方向从负极到正极,恒压200V 上样量为6L 10aL 当二甲苯晴示踪染料迁移到离凝胶底部3cm4cm处停止电泳 B.2.2.3第二向电泳 将正向电泳缓冲液倒出,然后把电泳槽放到70C一80C的烘箱中预加热,样品变性30nmin 同时 将倒出的电泳缓冲液在微波炉中加热到80 倒人电泳槽中,变换电极进行反向电泳 当二甲苯腊示 踪染料迁移到凝胶板顶部时,停止电泳,进行凝胶染色 B.2.3染色 B.2.3.1 固定 将凝胶浸泡在盛有300ml固定液的容器中,轻缓振荡20min后,倒掉固定液,用蒸憎水洗胶2次 每次1min. B.2.3.2染色 向容器中加人300ml染色液,轻缓振荡20min后,倒出染色液 用蒸憎水冲洗胶板,反复冲洗 4次 B.2.3.3显色 加人300mL核酸显色液,轻缓振荡,直至显现清晰的核酸带,然后用自来水冲洗,反复冲洗4次 B.2.3.4终止 将胶板放人300mL终止液中终止反应
GB/T31804一2015 B.3结果判定 在凝胶板下方四分之一处的核酸带为类病毒核酸带,与上部寄主核酸带之间有一定距离,二者可明 显分开 以电泳时载人的阴阳性样品作为对照,进行结果判定;满足前面条件,并出现与阳性对照一致 的条带则判定为阳性;没有相应条带出现为阴性
GB/I31804一2015 附录c 规范性附录 RT-CR检测方法 C.1试剂 C.1.1RRNA提取试剂 研磨缓冲液同B.1.1 C.1.25×TBE电泳缓冲液 同B.1.4 C.2引物 上游引物AssVdF:5'-ccGGATcCGGTAAACAcCGTGCGGTcCC-3 下游引物ASsVdR:5'-CcGGATcCGGGAAACAcCCTATTGTGTTT-3” 扩增产物长度为330bp C.3核酸提取 方法同B.2.1 C.4cDNA合成 0.2mLPCR管中加人总、RNA1AL,dNTPs(10mmol/L)1AL,DEPC处理水10AL,AsSSVdR (20mol/L)2AL,70保温5min,冰上放置5min;再加人5×缓冲液4AL,RNasin(40U/L)1AL M-MIv(200U/aL)1l.,42C保温1h,得到eDNA后用作PCR的模板 设置阳性对照,阴性对照及 空白对照 C.5CR扩增 0.2mLPCR管中加人10XPCR缓冲液(含Mg+)2LdNTPs(10mmol/L)0.6L..AssvdF及 AsSVdR(均为20mol/L)各0.5HL,2U/lTaq酶1AL,模板2AlL和DEPC处理水13.4AL 设置 阳性对照、阴性对照及空白对照 反应程序;94C5min;94C30s,54C30s,72C30s,20个循环;72C7nmin C.6琼脂糖凝胶电泳 制备1%的琼脂糖凝胶,按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR扩增产物,用DNAMarker作为分子
GB/T31804一2015 量标记,进行电泳分析 电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA 条带,并拍摄记录 结果判定 C.7 c.7.1阳性对照在330bp左右处有扩增片段,阴性对照和空白对照无特异性扩增,待测样品出现与阳 性对照一致的扩增条带,可判定为阳性 C.7.2阳性对照在330bp左右处有扩增片段,阴性对照,空白对照及待测样晶无特异性扩增,可判定 结果为阴性
GB/I31804一2015 附录D 规范性附录 实时荧光RT-CR检测方法 D.1主要试剂 研磨缓冲液同B.1.1 TagManO)ne-stepRT-PCRMixture D.2引物探针 上游引物ASSVdF2-144:5'-GTTCCGCTGTGGGTTcGCCTAC-3 下游引物ASsVdR2-246;5'-CACCCGGAGTCCGCTCGACTAG-3 探针ASsVdProbe-196;5'-FAM-CGCTGcGCTGCCACCTACTcT-TAMRA-3' D.3核酸提取 方法同B.2.1 D.4实时荧光RT-PCR反应 反应体系.0.2ml离心管巾加人2xOmesrepRTPCR缓冲液川10AL..E，TunHs(sU/L) 0.4AL,PimeSeripRTEnymeMixI0.l.,AssVaFP2-144(10pmol/L)0.4L,AssVdR2246 104mol/L)0.4l,ASsVdProbe-196(104mol/L)0.6l,ROXReferenceDyeI0.4L,模板NA 2L.补DEPC-H.0至20L 设置阳性对照,阴性对照及空白对照 反应程序:42C10min;95C10s;95C15s,62C60s,共40个循环 注:PCR反应体系中各种试剂的量可根据具体情况进行适当调整,也可采用商业化试剂盒 D.5结果判定 在空白对照及阴性对照无C值且无扩增曲线、阳性对照c值<30并出现典型扩增曲线的条 件下 待测样品的Ct值>40时,判定ASSVd阴性 a b待测样品的Ct值<35时,判定ASSVd阳性 待测样品的3540时,判定Assva 阴性;如果重新测试的cC值一40,则判定Assvd阳性 10o

苹果锈果类病毒检疫鉴定方法GB/T31804-2015

苹果锈果类病毒是一种常见的苹果病毒病，会导致苹果树叶片、果实和花朵等部位出现锈迹，影响苹果产量和果品质量。目前，已经建立了苹果锈果类病毒的检疫鉴定方法，其中主要包括样品采集、病毒RNA提取、RT-PCR扩增和结果判定四个步骤。

首先是样品采集，根据病情选择合适的组织部位进行取样，例如叶片、果实、花朵等，使用离心管或其他容器保存，并送到实验室进行检测。

其次是病毒RNA提取，将样品经过粉碎、离心和加入酚/氯仿之类的试剂进行提取，最终得到病毒RNA。

接着是RT-PCR扩增步骤，通过特异性引物扩增病毒 RNA，得到相应的 PCR 产物，再通过电泳或其他方法进行鉴定。

最后是结果判定，参照GB/T31804-2015标准中所规定的方法，对比标准曲线、阳性对照和阴性对照等，判断扩增产物是否为苹果锈果类病毒。

总体来说，GB/T31804-2015所规定的苹果锈果类病毒检疫鉴定方法具有灵敏度高、特异性好、重复性强等优点，能够有效地为苹果种植业的生产提供保障。

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2022/10/25 2:51:12 现行