猪囊尾蚴病诊断技术

猪囊尾蚴病诊断技术

国家标准 GB/T18644一2020 代替GB/T18644一2002 猪囊尾拗病诊断技术 Diugostictechmiquesforporcineeystieereosis 2020-12-14发布 2020-12-14实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/T18644一2020 目 次 前言 引言 范围 规范性引用文件 2 缩略语 显微镜检查 4.1试剂 4.2仪器设备 4.3虫体采集 4t 压片制备 As 显微镜检查 4.6 显微镜检查结果判定 PCR法 5.1试剂 5.2仪器设备 5.3引物 5.4样品 5.5PCR操作程序 5.6扩增产物电泳检测 5." 试验成立条件 5.8PCR结果判定 间接ELISA 6.1试剂 6.2仪器设备 6.3样品 6.4试验步骤 6.5试验成立条件 6.6ELISA结果判定 Dot-ABCELISA 7.1试剂 7.2 仪器设备 7.3样品 7.4试验步骤 7.5 试验成立条件 7.6Dot-ABC-ELISA结果判定 综合判定
GB/T18644一2020 附录A规范性附录生理盐水及猪囊尾恸头节形态特征 附录B(规范性附录PCR引物位置、溶液配制及电泳结果 0 12 附录c规范性附录ELISA试剂及其配制 附录D(资料性附录猪囊尾蜴TscC18重组蛋白的制备 16 附录E(资料性附录间接酶联免疫吸附试验的加样 17 附录F资料性附录猪囊尾勃TsCCI8和烯醇化酶单克隆抗体的制备 20 附录G资料性附录Dot-ABC-ELISA相关试剂配制及结果判定
GB/T18644一2020 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准代替GB/T18644一2002《猪囊尾恸病诊断技术》,与GB/T18644一2002相比,除编辑性修 改外,主要技术变化如下 -范围部分增加了PCR和Dot-ABC-ELISA技术见第1章) -增加了缩略语部分(见第3章); 增加了病原的PCR检测方法(见第5章); -修改了酶联免疫吸附试验的检测抗原和检测步骤,直接对血清样品进行抗体检测见第6章， 2002年版的第3章); 增加了检测航环抗原的-.ANC-ELIsA方法(见第7章)》 增加了综合判定(见第只章) 增加了生理盐水及猪囊尾蜥头节图片(见附录A),PCR引物位置、溶液配制及电泳图片(见附 录B),EL.IsA试剂及其配制(见附录C,2002年版的附录A),猪粪尾TscC18重组蛋白的 制备(见附录D),间接酶联免疫吸附试验加样示例(见附录E),猪囊尾蜥TscC18和烯醉化 酶单克隆抗体的制备(见附录F),DotABC-ELISA相关试剂配制及结果判定(见附录G). 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由农业农村部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(sAc/Tc181)归口 本标准起草单位;农业科学院兰州兽医研究所 本标准主要起草人;才学鹏、骆学农、,张少华、郑亚东、郭爱疆、侯俊玲 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 GB/T186442002
GB/T18644一2020 引 言 猪囊尾恸病(porcinecysticeros 7sis)是由猪带缘虫(Ta aeniasolium)的幼虫所引起的一种危害严重的 人兽共患寄生虫病 世界动物卫生组织将该病列为需申报的疾病之一 目前,该病广泛存在于发展中 国家,而且发达国家的病例也有逐年增加的趋势,不仅影响养猪业的发展,造成巨大的经济损失,而且还 严重威胁人类健康 猪囊尾恸病的诊断包括病原学诊断与血清学诊断 病原学诊断的目的在于确定临床剖检样本中虫 体的形态特征,在显微镜下观察头节顶突上有内外两圈排列整齐的小钩,即可判为猪囊尾呦 若囊尾呦 主要寄生于肝脏,则要注意与亚洲带缘虫囊尾恸相区别 目前,该病的生前诊断主要采用血清学方法 所用的抗原有虫体抗原,囊液抗原或分泌代谢抗原等,虽然这些抗原的检测敏感性较高,但特异性差,而 且抗原来源非常有限 鉴于以上原因,本次对GB/T18644一2002《猪囊尾恸病诊断技术》的修订,除间 接ELISA所用抗原改为猪囊尾恸期特异性18ku基因(Ts-CC18)重组蛋白外,还增加了血清循环抗原 cAe)检测方法和病原的PcR检测方法,以满足猪囊尾纷病流行椭学调查、药物治疗效果评价和动物 流通风险评估等不同需求 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到第日章间接酶联免疫吸附试验 ELIsA)相关的专利使用 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场 该专利持有人已向本文件的发布机构保证,他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下 就专利授权许可进行谈判 该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案 相关信息可以通过以下 联系方式获得 专利持有人姓名;才学鹏、张少华、景志忠、骆学农、郭爱疆、郑亚东、窦永喜 地址;甘肃省兰州市盐场堡徐家坪1号 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专 利的责任 IN
GB/T18644一2020 猪囊尾勃病诊断技术 范围 本标准规定了猪囊尾恸病的显微镜检查,聚合酶链式反应法(PCR法,间接酶联免疫吸附试验(间 接ELISA)、斑点生物素-亲和素复合物酶联免疫吸附试验(DotABC-ELISA)诊断技术及综合判定 本标准适用于猪和野猪的囊尾呦病诊断 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 CNAs-GL.029:2018基因扩增领域检测实验室认可指南 缩略语 下列缩略语适用于本文件 Avidin-HHRP;亲和素-辣根过氧化物酶(Avidin-HorseradishPeroxidase) DAB;二氨基联苯胺(3，3'-Diaminobenzidine' Dot-ABC-ELIsA;斑点生物素-亲和素复合物酶联免疫吸附试验(Dot-Avidin-IBiotin-Complex ELISA ELISA;酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay HRP辣根过氧化物酶(HorseRaddishPeroxidase) PTG;异丙基B-D硫代半乳糖苷(IsopropylB-DThiogalactoside) NC;硝酸纤维素(Nierocelulose) OPD邻苯二胺(O-phenylenediamine) PBSs;磷酸盐缓冲液(PhosphateBuferedSaline) PBST;洗涤液(PBScontaining0.5%Tween-20) PCR;聚合酶链式反应(PolymmeraseChainReaction) TMB四甲基联苯胺(3,3',5,5'-TetramethylBenaidine) 显微镜检查 4.1试剂 生理盐水配制见附录A中的A.1 4.2仪器设备 4.2.1正置生物显微镜 4.2.2手术剪、手术刀、毁子 4.2.3载玻片
GB/T18644一2020 4.2.4微量可调移液器(量程为20AL~200AL) 4.3虫体采集 肉眼观察舌肌、,咬肌、,内腰肌、隔肌、肩肌及心脏、肝脏肺脏等组织,采集有可疑虫体寄生部位的 肌肉或内脏组织,用手术刀将其切成约1cm厚的薄片,仔细检查切口有无虫体 成熟的猪囊尾恸为长 ~10mm)×5 椭圆形,大小为(6mm~ mm,半透明,囊内充满液体,上有一粟粒大小的白色头节 脑内寄 生的则为圆球形,直径8 mm10mm 以手术刀和锻子剥离肌肉等组织中的囊尾勃,用生理盐水 洗净 4.4压片制备 以手术剪剪开囊壁,取出完整的头节,以滤纸吸干囊液后,将其置于两张载玻片之间并压片 4.5显微镜检查 将压片置于低倍显微镜(40×)下,仔细观察虫体头节的形态和特征 4.6显微镜检查结果判定 如虫体头节的顶部有顶突,顶突上有内外两圈整齐排列的小钩,顶突的稍下方有四个均等的圆盘状 吸盘(见图A.1),即判为猪囊尾恸;如顶突无小钩则判为亚洲带缘虫囊尾恸 猪囊尾恸虫体应于 -20C或一70冰箱冻存 5 PCR法 5.1试剂 5.1.1CR试剂 5.1.1.110×PCR缓冲液 5.1.1.2dNTP预混液(2.5mmol/L 5.1.1.3MgCl(25mmol/L. 5.1.1.4ExTaq酶(5U/AL) 5.1.2电泳试剂 5.1.2.1电泳缓冲液:50×TAE贮存液(见附录B中的B.2.1),临用时加蒸憎水配成1×TAE缓冲 液(见B.2.2 5.1.2.2琼脂糖;核酸电泳用琼脂糖 5.1.2.3电泳加样缓冲液;见B.2.3 5.1.2.4 DNAMarker(DNA标志物):条带大小依次为100bp、250bp,500p、750bp、1000bp 和2000 bp 5.2仪器设备 5.2.1PCR扩增仪 5.2.2台式低温高速离心机 5.2.3稳压稳流电泳仪和水平电泳槽 5.2.4凝胶成像仪(或紫外透射仪).
GB/T18644一2020 5.2.5微量可调移液器(量程为0.1AL2.5L,0.5L10MlL10L~200L,100L1000L). 5.2.6无核酸酶的离心管与吸头 5.2.7PCR扩增管 5.3引物 5.3.1 上游、下游引物序列 根据猪带综虫线粒体ND1部分序列设计如下引物 上游引物:5'-CTAGGCCACTTAGTAGTTTAGTTA-3' 下游引物s'cATAAAAcAcTcAAAccTTATAGA PCR扩增片段的核苷酸序列及引物的位置见B.1 5.3.2引物储存液 用去离子水将每条引物配成100mol/1的储存液,置于一20C冻存 引物工作液 5.3.3 将上游、下游引物分别加去离子水配置为10mol/I的引物工作液 5.4样品 猪粪尾蝴虫体的采集,方法同4.3. 5.4.1 5.4.2阳性对照;用猪囊尾蝴虫体提取的DNA 5.4.3阴性对照;依据虫体采集部位,用未感染猪肌肉或肝脏提取的DNA 5.5CR操作程序 5.5.1NA提取 用DNA提取试剂盒提取囊尾劾和肌肉的基因组DNA DNA提取应符合CNAs-GL029:2018基 因检测实验室区域的设置原则 5.5.2PCR反应体系 采用50l反应体系,扩增体系包括 0×PCR反应缓冲液 5l dNTP(2.5mmol/L 4A MgCl.(25nmmol/L) 4L 上游引物工作液(10mol/L) ll 下游引物工作液(10mol/L) ll ExTaq酶(5U/L) 0.5L DNA模板 00ng 去离子水 补足至50L 5.5.3扩增程序 将PCR扩增管放人扩增仪中,设定扩增程序: 第一阶段,95C预变性3min:; -第二阶段,95C变性30s,45C退火40s,72C延伸60s,共进行35个循环
GB/T18644一2020 -第三阶段,72C延伸5min. 5.6扩增产物电泳检测 5.6.11.2%琼脂糖凝胶的制备;称取1.2g琼脂糖,加人100ml1×TAE缓冲液(见B.2.1和B.2.2) 中 加热融化后加5"I质量浓度为10mg/ml的澳化乙锭,混匀后倒人放置于水平台面上的凝胶盘 中,胶板厚5mn左右 依据样品数选用适宜的梳子 待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔) 放人电泳槽中,加1×TAE缓冲液浸没胶面约3mm 5.6.2加样取10nLPCR扩增产物和2AL加样缓冲液(见B.2.3)混匀后加人一个加样孔 每次电泳 同时设标准DNAMarker、阴性对照和阳性对照 5.6.3电泳检测;按5V/cm恒压电泳至澳酚蓝染料距离凝胶底部约1cnm时,停止电泳,取出凝胶置于 凝胶成像仪下观察 5.7试验成立条件 阳性对照样品有一条474bp扩增条带,阴性对照无条带或仅有引物二聚体条带(<100bp),则试 验成立 5.8PCR结果判定 待测样品有一条474bp的扩增条带,可判定该虫种为猪囊尾呦见图B.l). o 间接ELISA 6.1试剂 6.1.1包被抗原;猪囊尾蝴Ts-Cc18重组抗原 由构建的原核表达载体pET-28a(十)-Tscc18转化 大肠杆菌BL21(DE3),筛选高表达菌株进行诱导表达,采用Ni柱亲和层析纯化制备而成 使用时用碳 酸盐包被缓冲液(pH9.6)稀释至工作浓度 6.1.2阴性对照血清;健康猪血清 采自3月龄非疫区健康猪,剖检确认无猪囊尾劫感染;猪全血经自 然凝结法分离血清 检测时用样品稀释液稀释至工作浓度 6.1.3阳性对照血清;猪高免血清 由TsCC18纯化抗原免疫健康猪制备,检测时用样品稀释液稀释 至 工作浓度 6.1.4酶结合物;兔抗猪Ig(G-HRP结合物 检测时用样品稀释液稀释至工作浓度 6.1.5碳酸盐包被缓冲液:0.05mol/LNa,CO/NaHCO缓冲液(pH9.6),见附录C中的C.1 6.1.6洗涨缓冲液;含0.5%吐温-20的0.002mol/LPBs(pH7.2一7.4),见c.2. 6.1.7 mol/LPBS(pH7.27.4),见C.3和C.4 封闭被1含025%15A和0.235%重白等的00" 6.1.8样品稀释液;含0.5%BsA的0.02mol/LPBS(pH7.2~7.4),见C.5和c.6 底物溶液:oPD底物溶液,见c.7 6.1.9 6.1.10终止液;2.0mol/1的硫酸溶液,见C.8 6.2仪器设备 6.2.1台式低温高速离心机 6.2.2酶标仪(带450nm、490nm和630nm波长滤光片 6.2.3酶标板(96孔. 6.2.4与96孔酶标板配套使用的振荡器 6.2.5 血清稀释板
GB/T18644一2020 6.2.637C恒温培养箱、湿盒 6.2.7洗板机或洗涤瓶 nmL. 6.28单道可调移液器《量程为0.5AL~10l,I0儿L- 200L、100L1000L和1m5 6.2.9多道微量可调移液器(量程为20L300AL). 6.2.10与移液器匹配的各种吸头 6.2.11量筒(100mL和2000mL.) 6.2. 12 计时器 6.2.13贮液槽 6.2.14封板膜 6.2.15纱布和吸水纸等 6.3样品 采集猪全血,5mL/头,置4C析出血清后,3000离心15min,取上层血清作为待测样品 6.4试验步骤 6.4.1猪囊尾蜴Is-cc18重组抗原制备 构建原核表达载体pET-28a(十)-TscCI8,转化大肠杆菌L21(DE3),筛选的阳性菌株用终浓度 为0.5mmolL的异丙基碗代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,获得带6个组氨酸(His)标签的Ts CC18重组蛋白;采用NiSepharose6FF亲和层析法进行纯化 Ts-CC18重组抗原详细制备及鉴定方 法参见附录D. 6.4.2酶标板包被及封闭 将纯化的TsCC18蛋白按终浓度504g/ml稀释于pH9.6的碳酸盐包被缓冲液(见C.1)中;每孔 100AL加人96孔酶标板,4C包被过夜 PBST洗板3次后,每孔加120L封闭液1(见C.4)于37U 作用2h PBST洗板3次,在干净纱布或吸收纸巾上拍干 经干燥仪充分干燥,用真空包装机密封于 铝箔袋中(含干燥剂),贴签,4C保存备用 6.4.3样品 将待检血清及阴性、阳性对照血清用样品稀释液分别作1:50稀释(294L样品稀释液加血清 6L.),混匀备用 6.4.4加对照血清和待检血清 参照附录E中的图E.1加样示例图进行加样 ELISA板A1、A2和A3设为空白对照孔,A4A5 和A6加阴性对照血清;HH10、H11、H12加阳性对照血清;其余孔加待检血清样品,每份样品横向测3个 复孔,每孔100AL,用封板膜封口,37孵育60min 6.4.5洗涤 每孔中加300aLPBST,重复洗涤3次后在吸水纸上拍干 6.4.6加酶标抗体 用样品稀释液将兔抗猪酶标抗体稀释至工作浓度(1:20000),每孔100AL,封板后同前孵育 60min
GB/T18644一2020 6.4.7再洗涤 每孔中加300L的PBST,重复洗涤4次后在吸水纸上拍干 6.4.8加底物溶液 将分装冻存的OPD于37C水浴锅中避光溶化,每10mL溶液加人104L30%H,O混匀,每孔 加100AL,封板,避光37C孵育15min~20min 6.4.9加终止液和判读结果 每孔加50AL2mol/L的H,sO终止液,混匀后在分光光度计490nm/630nm下判读结果 6.4.10试验数据处理 6.4.10.1计算空白对照的平均OD值 6.4.10.2分别计算阴性和阳性对照血清的平均OD值 6.4.10.3分别计算每份待检血清样品的平均OD值 6.4.10.4根据公式(1)计算待检血清与阴性血清平均OD值的比值P/N P/N=(Ai一A,)/(A，一A 式中 待检血清样品平均oD)值 A A 空白对照平均OD值 -阴性对照血清平均OD,值 A 6.5试验成立条件 当空白对照平均OD值<0.10,阴性对照血清平均OD值<0.30,阳性对照血清平均OD值>1.0 时,试验成立. 6.6ELISA结果判定 待检血清P/N>2.1判定为阳性,P/N一2.1判为阴性 Dot-ABC-ELISA 7.1试剂 7.1.1生物素标记单抗BolIF1,IBio-215和Bio6G4单抗制备及标记参见附录下 7.1.2阴性对照抗原牛血清白蛋白,检测时用PBS稀释至工作浓度(50!g/mL). /mL),制 7.1.3阳性对照抗原;猪囊尾锄TsCCI8重组抗原 检测时用PBS稀释至工作浓度(504g/ 备方法参见附录D Avidin-HRP:亲和素-辣根过氧化物酶标记物 14 洗涤缓冲液;PBST,见C.2 ; 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.27.4):见C.3 7.1.720%三氯乙酸(TcA);参见附录G中的G.l.1. 7.1.8封闭液2;含1.0%明胶的0.01molL.PBs(pH7.2一7.4),参见G.l.2 7.1.9DAB底物溶液;参见G.1.3
GB/T18644一2020 7.2仪器设备 7.2.1NC膜(孔径0.45Am). 7.2.2圆形打孔器(直径6mm一8mm) 7.2.31.5mL微量离心管 7.2.4单道可调移液器(量程为0.5AL104L、,l0Al200l，和100Al10004L. 7.2.5与各移液器匹配的标准吸头 7.2.6台式低温高速离心机 7.2.737C恒温培养箱 7.2.837C恒温摇床 7.2.9平皿、锥形瓶 7.2.10量简(100ml和1000mL) 7.2.11暗盒 7.3样品 采集猪全血,5mL/头,置4C析出血清后,3000离心15nmin,取上层血清用等体积20%TCcA 室温沉淀20min,4C、10000 离心10mi,吸取上清干干净离心管中,作为待检样品 g 7.4试验步骤 7.4.1NC膜预处理 裁切NC膜,大小0.8emX10cm,可供检测10个样/条;点样处用圆形打孔器压迹,备用 7.4.2待检样品固定 取待检样品加至NC膜点样处,5AL/点,37C结合至少2h 7.4.3洗涤 将固定样品的NC膜置于干净平皿,PBST重复漂洗3次 7.4.4封闭 将NC膜置于封闭液2中,37C孵育1h 同7.4.3洗涤 7.4.5加生物素标记的单抗 将生物素标记的单抗Bio-1lF1、,Bio-21B5和Bio-6G4按1:1:1混匀,用PBS稀释(工作浓度均为 1:100) 将NC膜置于稀释好的抗体工作液中,37C摇床(50r/min)孵育1h,取出NC膜,用PBST 进行洗涤 7.4.6加亲和素-酶标记物 用PBS稀释Avidin-HRP(工作浓度1:500),与NC膜于37C摇床(50r/min)孵育1h 移去液 体,洗涤同7.4.3 7.4.7加底物溶液 min~5 将NC膜置于新鲜配制的DAB显色液中,避光反应3n tmin
GB/T18644一2020 7.4.8反应终止 显色后迅速取出NC膜置于PBST中终止反应,观察斑点显色强度 7.5试验成立条件 阳性对照孔出现棕色斑点,阴性对照孔无色或接近无色者试验成立 7.6Dot-ABC-ELISA结果判定 待检样品斑点显色者十十;棕色;十;浅棕色)判定为阳性,无色或接近无色者判定为阴性(参见 图G.1 8 综合判定 8.1受检样品经第6章ELISA检测出猪囊尾恸抗体的,判定为该动物猪囊尾勃抗体阳性 该结果可 用于猪囊尾恸病宰前检疫的初筛和流行病学调查、监测 受检样品经第7章DotAC-ELISA检测出猪囊尾纷抗原的,判定为该动物猪囊尾纷抗原阳性 8.2 该结果可用于猪囊尾蜴活虫感染的检测和药物疗效评价 8.3受检样品经第4章显微镜检查和第5章PCR法任一项鉴定为猪囊尾蝴虫体的,确诊该动物感染 猪囊尾劫 8.4检疫方法根据屠宰场具体条件进行选择
GB/T18644一2020 录 附 A 规范性附录 生理盐水及猪囊尾拗头节形态特征 A.1生理盐水 生理盐水配制如下 氯化钠 0.85g 去离子水 100ml A.2猪囊尾头节形态特征 猪囊尾拗头节形态特征见图A.1 顶突 吸盘 图A.1猪囊尾蝴头节形态特征
GB/T18644一2020 附 录 B 规范性附录) CR引物位置、溶液配制及电泳结果 B.1CR引物位置 7381AAAATAGTGATTTGTCTAGTCATAGATAGTAGTTTAATAACTAGGCCACTTAGTAGTTT 7441GTAAAATGATTATTTTGG IATTAGTGGTIIATGGGTTGTIAATTTGTTTATIA GT 7501ATTNTAGTTTTTTNTNTTAGGGGAACGTAAGATTTGGGTTXTTCTCAANTTTCGTAAG 7561GGTCCCTAANTAANGGTTGGTATTGTAGGATTGTTACAANGGTTTTCTG;ATTTATTAAAG:TTG 7621ATAATAAGTTTAAGATTGTGG;ATTCAGAGTCGTAGTTGAGTTGGTTTGTTGGGGTT 7681ATGTTGTGGTAGTTTAGTTTTATTTCATTTGTATATGGTGGTATTANTAGGTAT 7741AGGTTTAATTCTCTTT(TTTGTTATGGTTTTTGGTTATAACTAGATTTTGTAGYTTATTCG 7801ATATTATGTAGGG:TTGAGG;TAGiTTANTAAAAGiTTNTTCGTTTTAAG:TTCAANTTCG:TTGT 7861GCTTTTAGGTCTATAAGG￥TTTGAGGCTTGTTTTATGAGTATTATAATATTTACTGCATTG 注:阴影部分为引物的位置 B.2溶液配制 B.2.150×AE贮存液 三羚甲基氨基甲烧(Tris7 242.0g 乙 二胺四乙酸(E:DTA 18.6g 冰乙酸 57.1mL 加去离子水至 1000ml B.2.21×IAE缓冲液 使用前将50×TAE作50倍稀释即可 B.2.3电泳加样缓冲液 0.25g 溴酚蓝 甘油 30.0ml 70.0 去离子水 m B.3CR产物的琼脂糖凝胶电泳 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图B.1 10
GB/T18644一2020 1000bp 700p 500p 400p 300bp 200bp 100bp 说明 M -Marker(Marker为核酸分子量标准); 猪带缘虫; 阴性对照 图B.1PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 11
GB/T18644?2020 ? 淶??) ELISA? C.1?(CBs,0.05mol/LNa,co/NalHco,pH9.6) ??(Na,(CO 1.59g ??(NaHcCO 2.93g ?? 1000ml 2 8C1Ч C.2 PBSTpH7.2~7.4) 2.9 (NaHPO12H,O) g 0.2 (KHPO g 0.2g ?(KCI 8.0g ?(Na(CI g 0.5mL -20 1000mL ?? C.30.01mo/LPBSpH7.27.4) Na,HPO12H,.o 2.9g NaH.PO2H.O 0.3g NaCI 8.5g ?? 1000mL 03.4kPa?20min,4C?档 C.4?1 ???(BSA 0.25g ? 0.25" 2.0g 0.01mol/LPBS(pH7.2~7.4) 100mL Proclin300()0.1ml,?,4C-20C档 C.50.02mol/LPBs(p7.2~7.4 Na;HPO12H.O 5.8g NaH,PO2H,O 0.6g NaCI 17.0" 12
GB/T18644?2020 1000mL ?? 103.4kPa?20 ,4C?档 min,4 C.6??? 0.5 ???(BSA g 0.05mL -20 100mL 0.02mol/L.PBs(pH7.,27.4) Proclin300()0,1ml,?,4C-20C档 oPD? -? 1? 2? ??OPD 100ml ?? ?(5mL/?10mL/?),??20C档???,?10mL?10L 30%??(H,o.,),?á C.8??(2.0mo/L? ?112mL?(H,SO.)888mL??,,?±档 13
GB/T18644一2020 附 录 D 资料性附录) 猪囊尾蝴Is-cc18重组蛋白的制备 重组菌 D.1 将猪囊尾纷18ku糖蛋白基因(TsccI8)构建于pET28a(十)表达载体,并转化大肠杆菌BL21 DE3),命名为pET-28a(-Ts-CC18/BL21(DE3),一70保存 D.2Ts-cc18重组蛋白表达 D.2.1重组菌复苏 取一70C保存的pET-28a(十)-Ts-CC18/BL.21(DE3)重组菌按1:100的比例接种于10ml的 lB选择性培养基(含04g/ml卡那霉索),37c.,230，/min振摇过夜 D.2.2重组菌诱导表达 取D.2.1中过夜培养物10mL接种于1000mLLB选择性培养基中,37C、230r/min振摇至 OD为0.,51.0,加人IPTG至终浓度0.5mmol!/L,28C诱导表达6h D.3IS-CC18重组蛋白的纯化 D.3.1包涵体的洗涤及溶解 用25ml洗涤缓冲液(0.05mol/LTris-HCl,0.15mol/LNaCl,0.2%TritonX-100,1.4mlB筑基 乙醇,pH7.4)重悬菌体,一70C反复冻融3次,加人200L10mg/mL溶菌酶、,10AL100mmol/儿苯 甲基瞒酰氟(PMSF)及25ALTritonx-100,置37C培养箱温育15min后,在冰浴中超声破碎菌体 20min(功率600w,工作3s,间歇5s) 4、I3000片离心l10min收集沉淀 将收集的沉淀用洗涤 缓冲液充分重悬,加人终浓度为0.2%脱氧胆酸钠(D0C),混匀,室温静置20 min,13000离心 10min收集包涵体沉淀;反复洗涤3次 再以含终浓度2%D0c的洗涤缓冲液同上洗涤包涵体3次 在洗涤后的包涵体中加人结合缓冲液(0.05nmol/LTris-HCl,0.15mol/LNaCl,0.2%TritonX-100. 1.4mL疏基乙醇,10mmol/L 咪幽,8mol/L尿素,pH7.4)使沉淀慢慢溶解，室温静置约1 13000g离心10min,收集上清 D.3.2镍柱亲和纯化蛋白 按NiSepharose6FF说明书操作进行亲和层析纯化目的蛋白 每11培养物的包涵体裂解液中加 人2mLNiSepharose6FF填料进行结合,再用100mL结合缓冲液洗去杂蛋白 将200mmol/儿 400mm mnmdl/儿咪瞠梯度洗脱的Tsc18重组蛋白合并,浓缩后,用十二榄基碗酸钠-聚丙娇酸胶凝胶电 泳(SDS-PAGE)分析蛋白浓度及纯化效果 14
GB/T18644一2020 D.4Is-Cc18重组蛋白检测 D.4.1SDs-PAGE 取重组蛋白样品,加人2×蛋白上样缓冲液混匀,水浴煮沸5min上样 用80V电压电泳至澳酚 蓝到分离胶,把电压提高到120V,继续电泳至澳酚蓝到达凝胶底部 取下凝胶,用考马斯亮蓝染色2h 后脱色,待蓝色背景脱净后,观察和分析电泳结果 D.4.2纯化蛋白浓度测定 用紫外分光光度法测定Ts-CcC18重组蛋白浓度,根据公式(D.1)计算蛋白浓度 M=(l.45×OD一0.74×OD6×N D.1 式中: M -蛋白浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL); N -稀释倍数 以oD./OD.>1.6为蛋白纯度合格 15
GB/T18644一2020 录 附 资料性附录) 间接酶联免疫吸附试验的加样 图E.1为间接酶联免疫吸附试验加样示例图 10 12 空白 空白 空白 阴性 阴性 阴性 样品1 样品1 样品2 样品2 样品1 样品2" 对照 对照 对照 对照 对照 对照 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 10 10 10 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 1m 1m 12 113 14 11 12 12 13 14 13 14 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 15 15 15 16 17 17 17 18 18 18 16 16 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 19 19 19 20 20 20 21 21 21 22 22 22 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 23 23 214 25 26 23 24 24 25 25 26 26 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 阳性 阳性 阳性 H 27 27 27 28 28 28 29 29 29 对照 对照 对照 图E.1 ELISA加样示例图 16
GB/T18644一2020 附录 资料性附录) 猪囊尾Is-cc18和烯醇化酶单克隆抗体的制备 F.1免疫抗原 构建猪囊尾劫TsCc18和烯醇化酶TsENO基因原核表达载体pET-28a(十)-Ts-CCI8和pET 30a(十)-TsENO,分别转化大肠杆菌BL.21(DE3),筛选高表达菌株;以终浓度0.5mmol/L的IPTG诱 导表达TscC18和TsENO重组蛋白;采用NiSepharose6FF亲和层析法进行纯化获得TScC18和 TsENO蛋白,测定浓度分装，一70C保存 F.2动物免疫 采用常规方法免疫BALB/e小鼠,一共4次,免疫间隔21d 首次免疫取0.01mol/1PBS稀释的 抗原与等体积弗氏完全佐剂混合,充分乳化后,经背部皮下,腋窝、腹股沟多点注射,504g/只,共免疫 5只;第2次、第3次免疫将抗原与等体积弗氏不完全佐剂混合,充分乳化后，经背部、皮下及足跖部,注 射抗原量倍增;第4次经尾静脉注射进行加强免疫 F.3抗体效价测定 采用间接EL1SsA方法,以包被液将Ts-cc18和TsENo抗原均稀释至工作浓度(104g/mL),分别 包被96孔酶标板(防止产生气泡),每孔100AL,37C水浴作用2h后置4C过夜 以PBsT洗涤3次 在纸巾上拍干 每孔加人120Al封闭液1(见C.4),37C封闭2h,沥干;加人1;40~1;20480倍比 稀释的免疫小鼠血清,并以正常小鼠的血清作阴性对照 37C孵育30min,PHBST洗涤4次 加人羊 抗鼠IgGIHRP,37孵育30 min n,PBsT洗涤5次 以TMB显色液避光显色10min,2mol/I硫酸终 止反应 酶标检测仪测定OD.值;效价达到1:20480为免疫合格,取效价最高的小鼠脾脏进行细胞 融合 F.4杂交瘤细胞株的建立 F.4.1骨髓瘤细胞的复苏,培养和处理 将冻存SP2/0小鼠骨髓瘤细胞从液氮中取出后,立即放到37C温水中溶解,1000片离心10min 无菌条件下用吸管吸取上清,然后用无血清的RPMI-1640洗涤,混匀后加人细胞培养瓶中,用含20% 胎牛血清的RPMI-1640完全培养液进行培养 把细胞培养瓶置于5%cO.、37C恒温培养箱中进行传 代培养 每隔1d传一次，一瓶传两瓶 在进行传代培养的时候,用8-氮鸟喂吟进行处理,每瓶100AL 选择其中生长良好的骨髓瘤细胞进行融合 F.4.2饲养细胞的准备 在超净工作台上取健康的成年小鼠的腹腔细胞混于60mlHAT培养基中,按每孔100L转人 到96孔细胞培养板中,共6板 在显微镜下进行细胞计数,使饲养细胞的数量达到10个/mL,以促进 17
GB/T18644一2020 融合细胞的生长 F.4.3脾细胞的准备 在超净工作台上,取抗体效价最高的免疫小鼠脾脏,置于金属网中,用注射器芯轻轻研磨,并用 20ml无血清RPNM-1640培养基冲洗脾脏细胞 将脾细胞悬液转移到10ml离心管中,1000g离心 5 min,弃上清,用10ml无血清RPMI-1640悬浮,细胞计数 F.4.4细胞的融合 将培养好的6瓶~8瓶骨髓瘤细胞转移到50ml离心管中,l000片离心5min 弃上清,用10ml 无血清RPM-1640悬浮,显微计数 脾细胞与骨髓瘤细胞按10:1混合,以PEG4000融合后转人到 含有饲养细胞的96孔培养板中,每孔100AL,于37C在5%CO的细胞培养箱中培养 F.4.5杂交瘤细胞的筛选 观察杂交瘤细胞生长状况 第6天用HAT培养基进行第1次半量换液,在第8天左右,待细胞长 到1/4一13时以Tscc18和TsENo进行间接LIsA检测,选出阳性细胞进行后续克隆 F.4.6杂交瘤细胞的克隆化培养 将ELISA检测阳性的杂交瘤细胞用有限稀释法及时进行克隆,9d左右以间接ELIsA检测克隆细 胞上清;选择克隆数少,OD高的阳性孔将其再次克隆 经3次一4次克隆,直到阳性率100% F.4.7杂交瘤细胞的扩大培养 单克隆细胞株经过几次克隆阳性率达到100%后,将细胞从96孔培养板转人24孔培养板中,再由 24孔板转人细胞培养瓶中进行扩大培养 F.5单克隆抗体的大量制备 取BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡(高压灭菌),7d~10d后腹腔注人1×10'个~5×10个 杂交瘤细胞,注射后7d10d可见小鼠腹部明显膨大,进行无菌操作采集腹水 用吸管收取腹水 1000离心10min,弃去最上层的脂肪,收集中间层液体,即为单克隆抗体腹水 F.6单克隆抗体的鉴定 F.6.1腹水效价测定 用Ts-Cc18和TsENO抗原间接ELISA进行测定,腹水进行1010系列稀释 用酶标仪读取 OD的值,与小鼠阴性对照血清oD值进行比较,P/N比值>3的腹水最低稀释倍数,即为腹水 效价 r.6.2抗体亚类鉴定 亚类鉴定采用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒(IsoStripmouseMAbisotypingkit)进行鉴定,具 体步骤按试剂盒的说明书操作 18
GB/T18644一2020 F.7单克隆抗体的纯化 收集的腹水依次用50%及33%的饱和硫酸铵沉淀进行粗提纯化,透析后经HiTrapProteinGHP 纯化获得高纯度单克隆抗体 采用二隆咻甲酸(BCA)法进行抗体浓度测定 F.8抗原位点分析 用ELISA叠加试验进行抗原位点分析,用酶标检测仪测定OD值 按公式(F.l)计算叠加系数 叠加系数大于50%时各单抗即为针对不同的抗原位点 AI=[2×Aa3/A十A一1]×100% F.1 式中: AI 抗原叠加系数; A 单克隆抗体1的OD值; A 单克隆抗体2的OD.值; -单克隆抗体1和单克隆抗体2混合的OD,值 A们 F.9 单抗的生物素标记 用二甲基亚碱(DMSO)配制10mg/ml的N-羚琥珀酰亚胺生物素(NHSB),纯化的抗体按浓度 m(/ml~3ne/ml溶解于0.lmol/的碳股氢钠溶液(pH9.o)中 每毫克抗体加人5一250 Hg 的生物索酯,混匀后,室温作用4h 按每250g生物素酯加人20AL.1mol/L的NH,Cl终止反应,室 温放置10 在4笔下对0.01mol/LPBS(pH7.27.4)透析24h,期间换液4次,以除去未结合的 min 游离生物素 标记抗体分装后一20C冻存 19
GB/T18644一2020 附 录 G 资料性附录) Dot-ABC-EL.ISA相关试剂配制及结果判定 G.1Dot-ABC-ELISA相关试剂 G.1.120%三氯乙酸 称取20g三氯乙酸(TcA)溶于100ml去离子水中,4C保存 G.1.2封闭液2 明胶 1.0g 100mL 0.01mol/儿PBS(pH7.2~7.4) G.1.3DAB底物溶液 DAB底物溶液使用商品化试剂盒,操作步骤参照使用说明进行 G.2DotABC-ELISA的结果判定 Dot-ABCEL.ISA检测结果参见图G.1 ~5孔5份猪阴性血清样品 反应后版样处无明显探色"- 610n5份猪爽尾纷阳性血清样品 反皮应点样处是宗明就综色+) Dot-ABC-ELISsA检测结果 图G.1 20

猪囊尾蚴病诊断技术GB/T18644-2020的应用与进展

猪囊尾蚴病是由猪肉绦虫的幼虫感染引起的一种疾病，它会在猪的各个器官中形成液囊，导致猪的生长缓慢、瘦肉率降低，甚至死亡。传统的诊断方法主要是靠人工解剖检查，但这种方法存在操作复杂、耗时费力、易交叉感染等问题。近年来，随着分子生物学和免疫学的发展，新的诊断技术被广泛应用，使得猪囊尾蚴病的诊断更加快捷准确。

GB/T18644-2020是我国发布的关于猪囊尾蚴病诊断技术的标准，其中包括传统诊断方法和新的分子生物学、免疫学等诊断技术。以下是一些常用的诊断技术：

• PCR技术：PCR技术可以检测猪囊尾蚴病幼虫DNA，具有快速、敏感、特异性强等优点。
• ELISA技术：ELISA技术可以检测猪血清中的抗体，具有操作简便、高通量等特点。
• 免疫荧光技术：免疫荧光技术可以直接检测幼虫体内的抗原，适用于囊液、组织切片等样本。

以上诊断技术各有优缺点，在实际应用中需要根据具体情况选择合适的诊断方法。通过这些诊断技术，可以实现对猪囊尾蚴病的早期预警、定位和及时防控，有效提高养殖效益。

总体来说，GB/T18644-2020标准的发布和新技术的应用，为猪囊尾蚴病的预防和治疗提供了有力支持。未来，随着科学技术的不断发展，诊断技术将不断完善和更新，为保障畜牧业安全健康作出更大贡献。

猪囊尾蚴病诊断技术的相关资料

和猪囊尾蚴病诊断技术类似的标准

GB/T18644-2020

猪囊尾蚴病诊断技术

2022/7/17 21:29:25 现行