国家标准 GB/T38172一2019 蛋白A亲和层析介质 ProteinAaffinitychromatographicmedium 2019-10-18发布 2019-10-18实施国家市场监督管理总局发布币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/38172一2019 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由标准化研究院提出并归口本标准起草单位:科学院过程工程研究所、标准化研究院、中科森辉微球技术(苏州)有限公司本标准主要起草人;黄永东、赵岚、朱凯、吴学星、马光辉、苏志国、巩方玲、马爱进、杨维兴、王少云、秦佳
GB/38172一2019 蛋白A亲和层析介质范围本标准规定了蛋白A亲和层析介质的技术要求、检测方法、检验规则、标签、标志、包装运输和贮存本标准适用于蛋白A亲和层析介质的生产与检测规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T191包装储运图示标志 GB/T5475离子交换树脂取样方法 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法术语和定义下列术语和定义适用于本文件 3.1 蛋白A亲和层析介质preinAafmilychromawgraphiemedm 将重组蛋白A偶联至琼脂糖分离介质上制备的一类层析介质技术要求 4.1外观要求蛋白A亲和层析介质应球形饱满、表面光滑,在光学显微镜下应具有透明性 4.2性能要求应符合表1中的规定表1蛋白A亲和层析介质的主要性能要求项目指标范围粒径比(W载轻/% >90" 粒径平均粒径(a/am 90,0士13,5 300 最高流速"/(cm/h 配基密度(p)/mg/ml) 48 >40 动态载量(Q>7mg/mL》
GB/T38172一2019 表1续项目指标菌落总数/(CFU/ml 100 pH3.0 S0.1 5-痉甲基糠醛脱落量/(4g/ml) pH13,0 s0,1 粒径在45.0m165.0Hm范围内试样颗粒的体积与全部试样颗粒体积之比在0.10MPa压力下可达最高流速每毫升介质对人免疫球蛋白(hlgG)的吸附量 5 检测方法 5.1外观 5.1.1样品处理按照GB/T5475直接从产品中抽取5m样品,置于50mL.G3型号砂芯漏斗中抽干5min 用符合GB/T6682的三级水清洗5次,每次2mim.最后用真空系在0.1MPa压力下抽干5mim 将洗净的介质置于烧杯中,向其中补加三级水.,保证介质上应有2cm的三级水混匀后得到蛋白A亲和层析介质与水的混合体系 5.1.2样品观测用塑料吸管吸取混合体系置于载玻片上,调整显微镜放大倍数以视野里80%以上面积均为蛋白亲和层析介质为标准,用塑料吸管增减载玻片上的蛋白A亲和层析介质,最后用盖玻片压上调节 A 光学显微镜焦距,使视野中的影像清晰拍摄蛋白A亲和层析介质照片并保存 5.2粒径 5.2.1样品处理方法同5.1.1 5.2.2样品检测设置激光粒度仪参数如下;测量颗粒类型为通用型,分散剂类型为水,分析模式为单峰模式,添加样品进行测定 5.2.3结果计算 5.2.3.1 范围粒径比按式(1)计算: I65 w鞋路 w 式中 W粉范围粒径比,%; 粒径
GB/38172一2019 w 粒径为k(m)颗粒的体积与全部试样颗粒体积之比,% 5.2.3.2平均粒径按式(2)计算: 习" a= 2 N 式中: 所统计的一定数量介质颗粒的平均粒径,单位为微米(m); -单个颗粒的粒径,单位为微米(um) d -所统计的介质颗粒的数目 N 在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10% 5.3最高流速 5.3.1样品处理方法同5.1.1 5.3.2样品装柱选用中1.60cm×20.00cm的层析柱,将介质与水的混合浆液倒人层析柱中,堵住柱子出口,静置控制介质床层高度为10.00.cm士0.20.cm,柱子上蹦充满水打开柱子人口,以0.5ml/min的流速连续向柱中通人10个柱体积的三级水,床层稳定后即可进行测试 5.3.3样品测定将层析柱连人中低压层析系统测定时,从零开始设定一定流速,ml/min),保持该流速5mim 后,记录此时柱压户,MPa) 继续增加流速,并测定相应流速下的柱压直到压力达到0.10MPa为止,此时对应流速记录为Ua1 5.3.4结果计算按式(3)计算 60vo.1 3 nmnx 式中: F 最高流速,单位为厘米每小时(em/h); 在0.10MPa压力下的体积流速,单位为毫升每分(mL/min): Uo.1 -层析柱截面积,单位为平方厘米(em'); 6o 分钟转化为小时的换算系数在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10% 5.4配基密度 5.4.1溶液配制 5.4.1.120g/L础酸溶液准确称取20.00g棚酸于250ml烧杯中,加人三级水溶解后定容至1000mL
GB/T38172一2019 5.4.1.2甲基红-澳甲酚绿指示剂准确称取3mg甲基红,lmg澳甲盼绿于50ml烧杯中,加人乙醉溶解后定容至100ml 5.4.2样品处理按照方法5.1.1处理介质样品接着进行硝化处理,准确称取1.00g样品,移人干燥的100mL凯氏烧瓶中,加人50mg晒粉和 5mL浓硫酸置于电炉上加热先用小火慢慢加热2h至液体呈透明淡绿色,然后改用大火继续加热 30min，当液体澄清透明后停止加热,并自然冷却至室温 mL、准确称量10.0mg蛋白A,溶于1mL水中同时配制10.00g/mL、6.00mg/mL、3.00mg/ .25mg/mL蛋白A标准溶液，各取1mL进行硝化处理 5.43样品测定准确称取1ml硝化后样品,移人干燥的100ml.凯氏定氮瓶中加人10ml40%的氢氧化钠溶液,蒸汽浴进行反应用25mL20g/儿碉酸溶液(加人5滴一6滴甲基红-溴甲酚绿指示剂,浅紫色)收集僧出液,冷凝器的出液口浸于棚酸溶液液面以下碉酸溶液的体积达到45ml.时冷凝器的出液口离开液面,用去离子水冲洗冷凝器的出液口,至最终体积为50mL时停止收集用0.05mol/L的盐酸标准溶液滴定上述砌酸溶液至灰色或蓝紫色为终点,并记录消耗盐酸标准溶液的体积建立蛋白A质量-消耗盐酸体积标准曲线同时取1.00g空白介质进行上述操作,做空白对照 5.4.4结果计算按式(4)计算: 11一n Xl.4 式中蛋白A亲和层析介质配基密度,单位为毫克每毫升(mg/mL) 蛋白A亲和层析介质上测定出的蛋白A质量,单位为毫克(mg); m 空白介质上测定出的蛋白A质量,单位为毫克mg); m 蛋白A亲和层析介质质量,单位为克(g); mn -蛋白A亲和层析介质质量转化为体积的换算系数在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10% 5.5动态载量 5.5.1溶液配制 5.5.1.1缓冲液A,pH7.0 准确称取4.17g十二水合磷酸氢二钠,1.27g二水合磷酸二氢钠和8.78gNaCl于500mL烧杯中,加人三级水溶解后,调pH为7.0,最后定容至1000mlL,用0,45m过滤膜进行过滤 5.5.1.2缓冲液B,pH3.0 准确称取7.51g甘氨酸,加人三级水溶解,调pH至3.0,最后定容至1000ml,用0.45m过滤膜进行过滤
GB/38172一2019 5.5.1.3h-lgG样品(纯度98% /mL 用缓冲液A将hlgG蛋白稀释,使用分光光度计在280nm处进行测定最终浓度稀释至3.00mg/ 采用吸光系数[1.33mLmgcm)]计算蛋白浓度 5.5.2样品处理方法同5.1.1 5.5.3样品装柱选用1.60em×20.00cm的层析柱,将介质与水的混合浆液倒人层析柱中.堵住柱子出口.静置控制介质床层高度为5.00em士0.20cm,柱子上端充满水打开柱子人口,以2.0mL/min的流速连续向柱中通人10个柱体积的三级水,床层稳定后即可进行测试 5.5.4样品测定将层析柱连在层析系统中.并检测280nm处紫外线(U)信号,对载量测定过程进行监控动态结合载量用10%穿透值表示测量并记录样品hlIgG的100%UV信号,包括不结合到介质上的IgG亚类的紫外吸收用缓冲液A以2.0ml/min的流速平衡层析柱至紫外基线平衡，以 2.0mL/min的流速上样,待流穿曲线中h-lIgG的UV信号浓度为10%的样品浓度时上样结束,记录上样体积上样结束后用缓冲液A以2.0ml/min的流速平衡紫外信号至基线;用缓冲液B以2.0ml/min 的流速进行洗脱计算动态载量非保留条件下穿透体积测定;将层析柱连在层析系统中,并检测280nm处UV信号，上样104l 1%丙酮,记录出现UV信号时的体积 5.5.5结果计算按式(5)计算: C,(V一V ) Q Q0% Rel 式中: Qo -动态载量.单位为毫竟每毫升(m&/mb 蛋白起始浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL) C -柱出口蛋白浓度C达到人口蛋白浓度C 的10%时流出液体积,单位为毫升(mL); V 非保留条件下穿透体积,单位为毫升(mL) 介质体积,单位为毫升(mL). V e 在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10% 5.6菌落总数 5.6.1样品前处理方法同5.l1.l 5.6.2样品测定参照《药典(2015年版)(1105)非无菌产品微生物限度检查微生物计数法进行取lmL抽干介质,加人lml三级水,采用涡旋混合器混匀样品将含有30nmL胰蛋白脓大豆脉
GB/T38172一2019 脂培养基的锥形瓶121C灭菌20min,放人40.0C恒温箱中,待培养基冷却到40.0C时,用微量移液器吸取1ml混匀后的样品加人该锥形瓶中,混匀,把混合物倒人培养皿中,盖好上盖在室温下使混合物凝固把培养皿置于恒温箱中35C孵育5d 5.6.3结果计算孵育期后检查培养皿计数菌落形成单位数(CFU 在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值应不超过5CFU/mL悬浮液 5.75-羚甲基糠醛脱落量 5.7.1溶液配制 5.7.1.110%体积分数)甲醇水溶液准确量取100ml色谐纯无水甲醉,与900mL二级水混合均匀,再用0.22m孔径的滤膜过滤,超声除气泡 5.7.1.25-羚甲基糠醛标准储备溶液准确称取适量的5-羚甲基糠醛标准物质于100ml容量瓶,用10ml10%甲醇水溶液溶解,定容配成0.20mg/mL的标准储备液 5.7.1.31mmo/L，盐酸溶液,pH3.0 量取0.083mL浓盐酸(12mol/L)稀释定容为1000mL,调节pH为3.0 5.7.1.4100mmol/L氢氧化钠溶液,pH13.0 称取4.00只氢氧化钠固体,溶于100mL三级水中,待冷却至室温后用三级水定容为1000ml.,调节pH为13.0. 5.7.1.5标准工作溶液分别吸取5-羚甲基糠醛标准储备溶液5L、15AL、25L、40AL,50L、100AL、1mL、2mL至 100mL容量瓶中,用10%甲醇水溶液稀释至刻度,配成0.014g/mL,0.034g/mL,0.054g/ml、 0.084g/mL,0.104g/ml,0.20"g/ml,l.004g/ml2.004g/m标准工作溶液现配现用 5.7.2样品处理清洗方法同5.1.1 取若干份1.00g抽干蛋白A亲和层析介质置于带盖玻璃试管内分别取 10mlpH3.0,pH13.0的溶液置于各试管内,样品管在40.0C条件下培养 7d后,将上层清液转移到干净的试管内上层清液经旋转蒸发(60,50r/min),定容至2mL,加人等体积12mol/L盐酸,100C水解1h. 定容至5ml 用0.45m的滤膜过滤,得到样品待测液 5.7.3样品测定高效液相色谱条件:色谱柱选择C8,5m,250mm×4.6mm(内径) 流动相是10%甲醇水溶液流速1.0mL/min 检测波长285nm 柱温30C 进样量10L 以上述高效液相色谱条件对标准工作溶液和样品待测液进行检测记录标准工作溶液的保留时间以及峰面积,以峰面积对相应浓度绘制标准工作曲线以标准工作溶液的保留时间对样品进行定性,并
GB/38172一2019 记录下该保留时间处峰的面积,用标准工作曲线对样品进行定量 5.7.4结果计算按式(6)计算 CV X 6 m×1.4 式中 x 每毫升介质中5-羚甲基糠醛的脱落量,单位为微克每毫升(4g/mL) 从工作曲线求得的试样溶液中5-羚甲基糠醛的浓度,单位为微克每毫升(4g/mL); 试样经盐酸水解后最终的定容体积,单位为毫升(mL); 称取的蛋白A亲和层析介质的质量,单位为克(g) 7 -蛋白A亲和层析介质质量转化为体积的换算系数在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10% 检验规则 6 6.1组批同一工艺周期生产,质量均一的产品为一批 6.2抽样按GB/T5475的规定进行 6.3出厂检验每批产品出厂前应进行检验,检验合格的产品方可出厂出厂检验项目为第4章中规定的粒径、最高流速、配基密度、动态载量和菌落总数 6.4型式检验 6.4.1正常生产时,每半年应进行一次型式检验,有下列情况之一时应进行型式检验: 新产品试制鉴定时; a 正常生产后,如原料、工艺、设备有较大变化,可能影响产品性能时; b 产品停产半年以上恢复生产时 c 出厂检验结果与上次型式检验有较大差异时 d 监督机构提出要求时 e 6.4.2型式检验项目为第4章中规定的所有项目 6.5判定规则 6.5.1出厂检验判定和复检出厂检验项目符合6.3中项目要求,判定本批为合格品 6.5.1.1 -2项不符合要求,应复检,复检后如仍有1项不符合要求,则判定该批为不合 6.5.1.2出厂检验项目1 格品 6.5.1.3出厂检验项目超过2项不符合要求,判定该批产品为不合格品
GB/T38172一2019 6.5.2型式检验判定和复检 6.5.2.1型式检验项目符合6.4中项目要求,判为合格品 6.5.2.2型式检验项目13项(含3项)不符合要求,应复检,复检后如仍有1项不符合要求,则判定该批为不合格品 6.5.2.3型式检验项目超过3项不符合要求,判定该批产品为不合格品标签、标志包装、运输和贮存 7.1 标签应至少包括以下内容 a) 产品名称; b 型号; 体积 c 生产批号 d 生产组织 e) f 生产日期有效期; g h 注意事项 7.2标志包装储运标识应符合GB/T191的规定 7.3包装宜选用塑料瓶包装,包装材料应确保产品在运输、贮存时不被污染和泄漏 7.4运输应在常温环境下运输,避免过冷或过热,且采取措施防止产品失水 7.5贮存应在4C一8C环境下贮存,有效期为五年,超过有效期可按本标准规定进行复验,若复验结果符合标准要求,仍可使用

蛋白A亲和层析介质GB/T38172-2019介绍

一、定义

蛋白A亲和层析介质是一种具有特异性识别重组或天然蛋白A的多孔材料，用于分离和富集含有相应目标蛋白的混合物。蛋白A是从金黄色葡萄球菌中提取的一种蛋白质，可以结合IgG类免疫球蛋白。

二、分类

根据不同的结构形式和制备方法，蛋白A亲和层析介质可以分为以下几类：

手性蛋白A亲和层析介质：采用手性识别原理实现对目标蛋白的高选择性捕获；
多点共价蛋白A亲和层析介质：通过多点共价结合蛋白A实现对目标蛋白的高选择性捕获；
交联亲和层析介质：采用聚合物交联技术制备的，具有更好的力学强度和稳定性；
其他形式的蛋白A亲和层析介质：如基于表面改性、离子交换等原理制备的介质。

三、性能指标

蛋白A亲和层析介质的性能指标包括以下几个方面：

静态结合容量：介质在饱和状态下能结合的目标蛋白的最大量；
动态结合容量：介质在一定流速下能结合的目标蛋白的最大量；
选择性：介质对目标蛋白与其他蛋白的选择性；
再生性：介质的可再生性及重复使用次数等。

四、GB/T38172-2019标准

GB/T38172-2019是中国国家标准化委员会发布的关于蛋白A亲和层析介质的行业标准。该标准规定了蛋白A亲和层析介质的命名、分类、性能指标、测试方法、使用要求等内容，为保证蛋白A亲和层析介质的质量和应用提供了重要依据。

五、总结

蛋白A亲和层析介质是一种重要的生物化学分离材料，广泛应用于药物研发、生物工程、生物检测等领域。GB/T38172-2019标准为行业提供了一致的标准规范，将有助于推动蛋白A亲和层析介质的研究和应用。