国家标准 GB/T31801一2015 丁香疫霉菌检疫鉴定方法 DeteetionandidentifieationofPhytophthorasyringaeKIeb. 2015-07-03发布 2015-11-27实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/T31801一2015 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本标准起草单位;检验检疫科学研究院、天津出人境检验检疫局本标准主要起草人:杜洪忠,罗加风、吴品珊、严进
GB/I31801?2015 ù? Χ ?涨?ù?? ??ù?,???,?д?жù ? 2.1 ?,?,,?(1/1000g),?.,PCR,? PCR,?,,??,?? 2.2? ?,?,?,?,,?,,,?,,??,??,? ?,??,?,?? ?? 3.1? 4??,?ù(imariein),ù(ampialhim),?(ifampitin), nzene),ù(ymesxazol).caco,?,TrisHcl.MgCl.,Hcl.? (pentachloronitrobenm (EDTA),NaOH,NaOAc,KCI,Tris,???(CTAB),TAE,??(etha- nol),?(chloroform),(isopropanol),(isoamylaleohol),SYBRGreenl? ?K,TaqDNA??,dNTP,?ITS5ITS4,???PCRPS-FPSRTaq Man-MGB?PS-Pr. 3.2 ?,V8?,???,????? 3.3 PDA,V8,V8??,V8???,?PARPH-V8 ?μ?A ? 4.1 ?? ?????λ,п????,?Χ
GB/T31801一2015 的土壤和介质取样送实验室做进一步检验丁香疫霉菌为害症状参见附录A 4.2寄主组织分离培养可疑症状的根,茎,叶,果实用流水冲洗表面约15min,取根,茎、叶,果实果皮的病健交界处,剪成 5mm×5 mm小块,75%乙醇消毒30s,无菌水冲洗3次,吸干水分,置选择性培养基PARPHV8上 17C黑暗培养培养4d~6d后,组织周围培养基上长出稀疏菌落,挑取菌落边缘菌丝块转人V8培养基或PDA 培养基纯化,17C黑暗培养 4.3土壤和介质诱集称量土块或介质25g,碾碎放人500ml灭菌洁净烧杯中无菌水将土样或介质润湿无流动水) 保鲜膜覆盖封口,置于17C20C黑暗条件下放置3d5d 每份样品加灭菌燕窑水,水面距土表4.0cm,然后加人10片左右直径8mm一10mn的新鲜夏栎 Quercusrobur)叶片或未成熟的苹果或梨果实的小切片,切片大小以漂浮在水面为宜,Parafilm膜封口保湿,17C20C黑暗条件下放置 4.4 诱集检查和培养诱集2d3d后,观察夏栎叶片或苹果或梨附近是否有棕色病变区,从变色的病健交界处取5mmx 5mm小块,75%乙醇消毒30s,置V8培养基或选择性培养基PARPHV8,17C黑暗培养培养4d6d后,组织周围培养基上长出稀疏菌落,挑取菌落边缘菌丝块转人V8培养基纯化或 PDA培养基,17C黑暗培养 4.5抱子囊和菌丝膨大体诱发取纯化后菌落边缘菌丝块,置于盛有10mL无菌水的培养皿中,17C一20黑暗条件下诱发袍子囊和菌丝膨大体,48h后观察菌丝块周围弛子囊和菌丝膨大体产生情况 4.6卵抱子诱发取纯化后菌落边缘菌丝块,置于加人8谷笛醇醉(20mg/L)或植物油(玉米油,亚麻籽油,麦芽油)的 V8培养基中,黑暗条件下8C10C低温培养4周如果寄主材料是柑橘属的果实,则将纯化后菌落边缘菌丝块置于V8鲜橙皮培养基或V8杜鹃叶片培养基10C黑暗培养,7d后观测病菌卵抱子产生情况 4.7DA提取收集分离到的病菌菌丝,采用CTAB法提取核酸参见附录B 4.8实时荧光PCR检测实时荧光PCR引物序列为PS-F;5'-GTCTGGCTTcGGCTGGAT-3'和Ps-R;5'-AGTGGGC TACTAGCTCCAGGC-3',TaqMan-MGB探针Ps-Pr:5'-(FAMTGGCGACCGCTCTGANFQ MGB)-3',探针5'端标记的荧光报告基团为FAM,3'端标记的非荧光猝灭基团为MGB 反应体系(25AlL);样品DNA1AL,10×PCR缓冲液2.5AL,25mmol/L.MgCl,2L,2.5mmol/儿L ,10 dNTPs2L,10mol/LPrim 各1L mol/儿L探针PH-Pr1.5AL,5U/L TaqDNA聚合酶 imerS 0.3AlL,ddH.O13.7AL 反应循环为94C10min;94C15s,56C60s,循环40次
GB/T31801一2015 4.9ITs基因检测和序列比对分析可以选择利用真菌通用引物PCR扩增后测序比对的分子方法利用真菌通用引物ITs55'-GGAAGTAAAAGTcGTAACAAGG3'和ITS45'-TcCT CCGCTTATTGATATGC-3')进行扩增反应体系(25L):样品DNA1L,10×PCR缓冲液2.5AL,25mmc nol/LMgC12AL,2.5mmol/L dNTPs2AL,10mol/LPrimers各1L,5U/LTaqDNA聚合酶0.3L,ddH.O15.2AL 同时设置空白对照,以Tris-EDTA缓冲液代替DNA样品 PCR反应条件为;94C4min;95C1nmin,56C30s,72C45s,35个循环;72C10min;4 保存 PCR产物的检测,在1×TAE电泳缓冲液中,1.5%琼脂糖(含sYBRGreenI核酸染料)凝胶电泳 5V/cm,凝胶成像仪分析结果如有900p左右大小的条带出现,将扩增产物进行序列测定 s 将测序后的序列与NCBI网站Genl 6 中公开发表的Phytohthorasyringae的序列进行 i7 BLAST分析鉴定特征 5.1生物学特征 5.1.1菌落特征丁香疫霉菌在V8培养基和PDA培养基上生长较为缓慢在V8培养基上菌落稀疏,呈放射状,星状或菊花花瓣状,菌落的花瓣区域较尖、窄,菌落形态图参见附录C 在PDA上菌落边缘约呈花瓣状，乳白色,菌丝体浓密,菌落中央区域皱孔状 5.1.2病菌形态无性生殖阶段袍子囊梗呈单歧聚伞花序状分枝袍子囊具有不完全的乳头状突起,形状为卵形或 n)X 倒梨形,不易脱落,单独生在顶端或整个集结在一个袍子囊梗上袍子囊大小为(21.0m75.0 m 11.0 一120m),平均47.0mx 30.04m,长宽比在1.1;1至2.11之间袍子囊不易脱落,不 Am 增殖,但可直接在附近萌发产生一个新的袍子囊袍子囊具有平的盖,裂开释放游动袍子,游动袍子卵形,侧生二根鞭毛病菌易产生菌丝膨大体,念珠状,卵形、球形或不规则形,常萌发产生较细的菌丝,菌丝膨大体中的内含物最终会逐渐释放殆尽,成为空壳病菌为同宗配合,藏卵器球形,直径23.4m一40.0Am;卵袍子充满藏卵器,通常为圆形,黄色,大 34.7 小为20.lAm" 7Am;雄器单个或数个,平滑,多侧生丁香疫霉菌的形态图参见附录C 5.1.3与近似种的形态区别与丁香疫霉菌在形态上较为近似的是冬生疫霉菌(Phytophthorahibernalis) 主要区别为丁香疫霉菌落的花瓣区域较尖,窄,袍子囊不易脱落,具有菌丝膨大体,雄器多侧生;冬生疫霉菌落的花瓣区域较宽,袍子囊易脱落,无菌丝膨大体,雄器多围生,参见附录D. 5.2实时荧光PCR检测若阴性对照及空白对照的Ct值>40,供试菌C值<36,可判定为阳性
GB/I31801一2015 5.3IIS序列比对经BLAST分析,PCR扩增到的ITS基因序列与NCB网站GenBank中登录号为AF380146.1的 Phyophhorusyringae的序列同源性99%100%,则判定为阳性 6 结果判定病菌的培养性状和形态特征与5.1的描述一致,且实时荧光PCR检测结果呈阳性,或ITS序列比对99%~100%同源,可判定为丁香疫霉菌样品和档案保存 7.1 样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存对检出丁香疫霉菌的样品应保存于10C冰箱中,至少保存 6个月,以备复核该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理 7.2菌株保存与处理从检测样品中分离并鉴定为丁香疫霉菌的菌株,应妥善保存将菌株接种于PDA培养基斜面上 20C培养5d,10C黑暗条件下保存,定期(60d)转接防止病菌死亡,至少保存6个月保存期满后高压灭菌灭活处理 7.3结果记录与资料保存完整的实验记录包括:样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并应有实验人员和审核人员签字
GB/T31801一2015 附录A 资料性附录丁香疫霉菌相关信息 A.1背景资料 A.1.1病菌的基本信息英文名:Twigblightoflilac,Fruitrot 学名;PhyophthorasyringaeKleb. 分类地位藻菌界(Chromista),卵菌门(Oomycota),霜霉纲(Peronosporea),霜霉目(Peronospora- les),霜霉科(Peronosporaceae),疫霉属(Phytophthora) 传播途径;通过雨水和灌溉近距离传播,通过带菌苗木,果实或土壤进行远距离传播近似种与丁香疫霉菌在形态上较为近似的是冬生疫霉菌(Phytophthorahi/ ibenalis A.1.2方法原理根据丁香疫霉菌形态学特征和目标片段的序列特征为鉴定依据 A.2寄主范围 a),欧洲板栗(Castaneasatiza 欧洲丁香(Syringuwlguris),普通赤杨(A/nusglwimoa a),日本板栗 Castaneacrenata)，，火星山影掌(Cel 'reusnartiantu.s s)，四角山影掌Cereste/racanthus ),柑桔属 Cirusspp.),欧洲榛(Corylusaellana ),英国山楂(Cralaegus0ryucantha),巢荷包掌(Ecehiopsis syla ')yriesii),白冬石楠(Ericahiemalis),雪石楠(Ericanivai),水青冈(Fat utica,小茴香(Foe agus wlkure),金钟花(Forsyhairidisim na),迎春花(Jasminunudiflorwm),苹果Malus 1iuln bumila),辐射松Pinusradliata,李属Prunus p.),欧洲梨Pyr4scom1munis),栎树Quercus sPp sp.),树Tiliasp.)等 A.3病害症状丁香受害小枝、嫩枝枯萎,引丁香疫霉菌可为害多种植物,引起寄主的根、茎、叶、果实的多种病害起丁香的枝枯病(twigblighp);苹果,梨及其他茜微科果树受害,引起果腐病(ruitro)和颈腐病(colaer rot);西洋栗和山毛梯受害,导致根部腐烂症状,引致板栗和山毛桦树的根腐病(rootrot);柑橘属植物受害,出现果实褐腐、嫩枝和花瓣枯萎症状;茴香受害,叶片枯萎;仙人掌受害,茎部腐烂;豆科灌木受害树干和树枝上的树皮出现损伤,并呈现伤流溃扬病菌引发的根腐、茎腐及茎溃疡,导致植株长势衰弱,甚至死亡受侵染果实最初并不变软或溃烂，仍保持原形,只表皮有些变色,之后病部很快发展呈各种不同程度的黄色至褐色病斑不规则,与健康组织交界处界限不清晰,病斑处果皮呈皮革状,在潮湿的条件下,果皮上着生稀疏乳白色霉状物,病情继续发展,病果变成一团浆果图A.l~图A.5为部分病害症状
GB/I31801一2015 图A.1柑橘属果实症状注，引自T.colins 注，引自N.Grunwad. 图A.2海棠症状图A.3石楠症状注引自DaveBeyan. 注引自OregonSateUnivesiy 图A.4苹果果实症状图A.5梨果实症状 A.4分布美国,加拿大、秘鲁,德国、意大利,瑞士,英国、比利时、丹麦法国,希腊,爱尔兰,荷兰,葡萄牙,罗马尼亚、瑞典、捷克、立陶宛、前南斯拉夫、澳大利亚、新西兰、摩洛哥、南非
GB/T31801?2015 A.5 PDA;??200g,,?20min,??,?м 20g,?18g,???,?1000mL,121,20min. V8:V8?100mL,2.5gCaCO,15g?,900mL?,121C,20min. V8:V8?10g15g??,121C,201 min V8???:V8?5g????,121,20 min ?PARPH-V8;V8?50ml,1.25gCaCO,15g?,950ml??,121C 20min,?50C,?ù0,005g,ù0.25g?0,01g 0.025g,ù0,05g
GB/I31801一2015 附录 B 资料性附录 DNA提取方法刮取菌落上的菌丝体,放人1.5mL浸在液氨里的离心管中,用塑料杵碾碎待用离心管加人300nL500alLcTAB缓冲液(其中含0.1只蛋白酶K)混匀,65C水浴1h;13000发离心5min10min,保留上清液;加500L三氯甲烧:异戊醇(体积比为24:1)混匀.13000其离心 5min~10min,保留上清液;再加500l三氯甲炕:异戊醇(体积比为241)混匀,13000片离心 nmin~10min,保留上清液;加人1m异丙醉混匀,-20C过夜;l3000片离心30min,可见DNA沉 5 淀;70%乙醇洗DNA沉淀,室温干燥;用30l一50ALTris-EDTA缓冲液溶解DNA,待用
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GB/I31801一2015 附录 D 资料性附录丁香疫霉菌与近似种冬生疫霉菌的形态区别表D.1丁香疫霉菌与近似种冬生疫霉菌的形态区别病菌名称菌落特征袍子囊菌丝膨大体厚垣袍子有性袍子宽卵圆形或倒梨形至在V8培养基上菌落丁香疫霉菌椭圆形,不易脱落,他呈星状、菊花花瓣有 Phytophthora 子囊较大，平均大小无雄器绝大多数侧生状,花瓣区城较小 pmx30m,长宽比 syringae 较窄较小长卵圆形或椭圆形,具在v8培养基上菌落较长的袍囊柄.易脱冬生疫霉菌 Phytophthora 呈玫瑰花瓣状,花瓣落,袍子囊较小,平均无无雄器多围生,偶侧生区域较圆、较宽 hi/bernalis 大小40m×19m 长宽比较大
GB/T31801一2015 参考文献 [1]罗加凤,刘跃庭,廖芳等.进境美国加州脐橙中丁香疫霉Phytophthorasyringae的截获,菌物学报,2012,31(1):24-30. AndreDrenth，BarbaraSendall.Practical guide todetectionandideniicationof [2] hytophthora.CRCforTropiealPlantProteetion,2001,Version1.0. [3 declhnming Austrocedrus AlinaG.Greslebin,EverettM.Hansen.Phythphuhoraspeeiesfrom chilensisforestsinPat ,2005,97(1):218-228 atagoniaArgentina.Mycologia, [4们 Alvarez,I. .,Perez-Sierra， Garcia-Jimenez,J.andJavierAIvaJ.Bleedingcankeron mesquiteinPerucausedbyPhvobhthorasyringae.Plant.Disease.2007,91:226 [5” Abad,Z.G.,Creswell,T.,Jones,R.K.,andShew,H.D.Occur ofPhyophthora )ccurrence species onvarioushostsinNorthCarolina.Plant.Disease.1994,78:830. [6]B.HenricotI.waghornG.Dentona.M.PerezSierra.Firstreportofruitrotcaus usedyPh,yo phthorasyringaeonPyracanthaintheUK.PlantPathology,2004,53(6):805 HoH.H..Jongs.C.1993.Phytophthorahibernali、andP..syringae Mycotaxon47 439-460. [8]MartinF.N,TooleyP.w.IdentificationoPhytophthoraisolatestospecieslevelusingre strictionfragmentlengthpolymorphismanalysisofapolymerasechainreaction-amplifiedregionof mitochondrialDNA.Phyopalhoo4y y,2004,94(9):983-991. 9 CABInternational,2007.CropProtectionCompendium,2005Edition.Walingord,UK;CAB International. Erwin,D.,C.,Ribeiro,O.,K.PhytophthoraDiseasesWorldwide.St.Paul,Minnesota:The L101 AmericanPhytopathologicalSocety.1996:441-444.

丁香疫霉菌检疫鉴定方法GB/T31801-2015

丁香疫霉菌是一种潜在的有害真菌，对多种作物造成危害。为了防止其传播和扩散，对种子、苗木、土壤等进行丁香疫霉菌的检疫十分重要。

GB/T31801-2015《植物丁香疫霉菌检疫鉴定方法》是我国针对丁香疫霉菌的检测标准，该标准明确了丁香疫霉菌的检测方法和检测标准。

丁香疫霉菌的检测方法

丁香疫霉菌的检测方法主要有PCR法、荧光抗体法和生物学法等三种。

PCR法是通过检测样品中丁香疫霉菌的DNA来确定其存在，具有高灵敏度、高特异性等优点，是目前应用广泛的检测方法之一。

荧光抗体法是通过检测样品中丁香疫霉菌的抗原来确定其存在，具有操作简单、结果准确等优点。

生物学法是通过在特定培养基上培养样品中的丁香疫霉菌，观察其形态、生长速度等特征来确定其存在。

丁香疫霉菌的检测标准

GB/T31801-2015明确了丁香疫霉菌的检测标准，包括检测方法、样品处理、检测限、鉴定结果等方面内容。

其中，检测限是指能够检测到丁香疫霉菌的最低浓度，GB/T31801-2015规定PCR法的检测限为100pg/g，荧光抗体法和生物学法的检测限分别为1×10^6 CFU/mL和50 CFU/g。

鉴定结果分为阳性、阴性和可疑三种，阳性表示样品中存在丁香疫霉菌，阴性表示样品中不存在丁香疫霉菌，可疑表示检测结果无法确定是否存在丁香疫霉菌，需进行进一步检测。

结语

丁香疫霉菌检疫鉴定方法GB/T31801-2015的实施，对于保障种子、苗木等作物健康生长、预防病害传播具有重要意义。各地相关部门应该加强对丁香疫霉菌的检测和防控，确保农业生产健康发展。