可可丛枝病菌检疫鉴定方法

可可丛枝病菌检疫鉴定方法

国家标准 GB/T36809一2018 可可丛枝病菌检疫鉴定方法 DeteetionanlidentifieationofMoniliophthorapernieiosa 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/36809一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位:广东出人境检验检疫局、海南出人境检验检 疫局 本标准主要起草人:冯黎霞、王卫芳、何日荣、魏霜,刘福秀、何瑞芳
GB/36809一2018 可可丛枝病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了植物检疫中可可丛枝病菌(MMoniliophthoraermiciosa)的检疫鉴定方法 本标准适用于可可丛枝病菌的检疫鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 SN/T1538.1培养基制备指南第1部分:实验室培养基制备质量保证通则 方法原理 可可丛枝病菌在寄主上的为害症状、病菌形态学特性与培养特征及分子生物学特征是制定本标准 的主要依据 该病菌的分类地位、,寄主范围,分布和为害症状等背景资料参见附录A 设备用具 4.1仪器设备 体视显微镜、生物显微镜,电子天平(感量0.001g),高压灭菌器,超净工作台,生物培养箱、PCR s1 仪电泳仪和凝胶成像系统 4.2实验用具 标签,定性滤纸、样品袋、保鲜袋手持放大镜、锻子,解剖刀,酒精灯,接种针,培养皿(直径9.0em) 烧杯,量筒、三角瓶、载玻片、盖玻片,可调移液器(可调范围2.5AL1000L)、离心管 试剂和培养基 5.1试剂 青霉素,链霉素、无水乙醉、马铃薯、葡萄糖、琼脂、70%乙醇、无菌双蒸水、2%cTAB提取缓冲液、 10%sDS溶液、3mal儿醋酸钠游液、.PCR试剂(包括Taq聚合酶、dNVTP,缓冲液),苯酚,三氧甲婉异 戊醇、Tis-Hcl,EDTA(乙二胺四乙酸),琼脂糖,分子量标准物、TAE电泳缓冲液 5.2培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):200只去皮马铃薯,20g葡萄糖,18只琼脂,加水至1000mL 121C高压灭菌20min. PDA选择性培养基;高压灭菌后的PDA冷却至45C50C,无菌操作条件下1000mL.培养基
GB/T36809一2018 中加人0.3g链霉素和0.3g青霉素,混匀,倒平板,静置备用 燕麦可可培养基;21gCaSO,517g干燥的可可枝条研磨成粉末状),l38g燕麦粉,700ml.水 混匀后分装到三角瓶中,121笔高压灭菌20min,静置冷却备用 配制培养基时,按照SN/T1538.l的要求 检验鉴定方法 6.1症状检查 6.1.1可可种子症状检查 将待检样品倒人洁净白瓷盘内,检查种子是否有粘附,挑选干瘪、弱小,畸形、变色的可疑病种子,用 手术刀剥离种皮和种子,检查病部是否有菌丝体(症状特点参见附录B图B.1) 无症种子随机取样后 待保湿培养 6.1.2苗木症状检查 仔细检查植株枝条有无徒长、变色、肿胀,树皮有无变色、开裂、溃疡、腐烂,枝条、腋芽、叶片等部位 有无异常增殖,枝条是否从顶端开始干枯死亡,肉眼或显微观察干枯枝条树皮内层是否有菌丝,帚状老 枝上是否有真菌担子果(症状特点参见图B.1、图B.3,图B.4),担子果下方枝条上是否有白色的袍子堆 将可疑枝条和种子样品懂回实验室作进一步检验,记录样品品种、数量.米解国及取样地点.取样人和取 样日期等信息 6.2实验室鉴定 6.2.1直接检验 观察记录病组织的外观及剖面症状特点.将有明显病征的病枝与病果置于体视显微镜下检查,挑取 病部菌丝体、抱子堆,制成玻片,置于生物显微镜下镜检 6.2.2保湿培养 如病枝或病果上只有可疑病状而无明显病征,则将病枝(剥开树皮,用剪刀剪成0.4cmX0.4em)或 病果(用手术刀剥离种皮和种子)置于样品袋中,于25在黑暗条件下保湿培养,5d后,观察症状的变 化,进行显微镜检及病原菌的分离培养 6.2.3菌丝体分离培养 直接挑取病部的子实体或袍子团,置于PDA选择性培养基平板上;或采用组织分离培养法,用 70%乙醇对植物组织表面消毒30s,风干后用消毒过的刀片切取病健交界处组织,切成0.4cmx0.4cm 小块后放置于PDA选择性培养基平板上,在黑暗或弱光条件下28C培养5d15d,定期观察,将菌落 边缘菌丝体置于新鲜的PDA平板上进行纯化,以便于后续的形态学和分子生物学鉴定 6.2.4担子果和担抱子纯化培养 挑取PDA平板上培养的菌丝块,植人无菌燕麦可可培养基,28C、黑暗或弱光条件下保湿培养 30d,放大镜或肉眼观察是否有担子果产生,担子果下方是否有白色的担抱子堆 6.2.5病原菌形态和培养性状观察 PDA上纯化菌落生长7d后,体式显微镜下观测菌落中是否有病菌抱子形成,记录菌落培养性状
GB/36809一2018 包括菌落生长速度、颜色、形状等,如有袍子产生,则将培养皿放在显微镜(100×)或(200×)下观察袍子 生长方式,并挑取少许制片,在生物显微镜下镜检,观测菌丝、袍子形态特征 显微镜(1000×)下测量 抱子的形状大小、抱子抱壁厚度等 在28、黑暗或弱光条件下,观察菌落生长速度、颜色变化、担子 果和担弛子的形成情况 相似致病菌可可链疫抱荚腐病菌的菌丝体和菌落特征与可可丛枝病菌有显著 不同,两者的异同点是鉴定区分两病菌的关键(两者异同点参见附录C) 6.2.6分子生物学鉴定 6.2.6.1DNA提取 采用附录D的方法提取病菌基因组DNA 6.2.6.2rPCR检测及Irs基因分析 采用附录D扩增检测病菌基因组DNA中的ITS基因,测序后进行BLAST与系统发育分析 鉴定特征 7.1病菌形态 新鲜菌丝无色，呈弯曲膨大状态,菌丝间相互缠绕,菌丝宽5Am50 wm.为单核前丝;,随时间推 移,菌丝变细窄,菌丝宽1m一34m,成长为双核菌丝,并开始出现锁状联合(菌丝体形态参见图B.2) 在适当的湿度条件下,产生担子果,呈蘑菇状,菌盖粉红至深红,(314m一32um)×(7um~94mm),担 袍子纯白色,半透明,(74mm~l14m)×(4m54m) 7.2菌落特征 菌落在PDA平板上初为纯白色,后为奶油色,圆形,不隆起,菌丝致密,平铺于培养基表面形成毡 状菌丝层,打开培养皿盖,菌落有蘑菇气味 7.3IIs序列特征 PCR扩增产物大小约为650bp,在GenBank中进行BLAsT分析,病菌与已知的可可丛枝病菌菌 株的ITS1-18s,5.8S-IST2、28s区域序列GQ919138,GQ919120,GQ919118,EU047930,EU047936等 的同源性最高,系统发育分析显示病菌菌株与可可丛枝病菌聚在同一簇 结果鉴定 8 符合下列任一种情况均可判定为检出可可丛枝病菌: 如果病部有明显的病状和病征,病菌形态学特征与鉴定指标7.1吻合,扩增得到的ITS序列在 系统发育树上与可可丛枝病菌聚在一簇; 如果病部有病状但无病征,经保湿培养和/或分离培养所产生的病菌形态学特征及培养性状与 鉴定指标7.1~7.2吻合,并且扩增得到的ITs基因在系统发育树上与可可丛枝病菌聚在 -簇
GB/T36809一2018 o 样品和资料的保存 g.1样品的保存 样品经标注菌株来源、寄主、分离时间、鉴定人后置于4C冰箱保存;可可丛枝病菌纯分离物标注 后,菌株在含30%甘油的冻存管中于-80笔保存,或将菌株转接在PDA斜面上培养,待菌丝体长满斜 面后,置于4C下保存,并定期(180d)转管 对鉴定为可可丛枝病菌的样品至少保存6个月,以备复核谈判和仲裁,样品保存期满后,应无害化 处理 9.2检验资料的保存 妥善保存检验资料,以备复核,谈判和仲载 检验报告应注明检验时间,方法和结果等,并有检验检 疫员的签名;检验图片包括症状、病菌等
GB/36809一2018 附 录 A 资料性附录 可可丛枝病菌技术性资料 A.1分类地位 学名:Moniliophthoraernieiosa(StahelAime&.Philps-Mora(2005) 异名:MarasmiuserniciosusStahel1915);CrinipelierniciosaStahelSinger(1942) 英文名;witehes’broomdisease(wBD),erinipellispodrot 分类地位:真菌界(Fungi),担子菌门(Basidio iomycota),担子菌纲(Ba.sidiomycetes),伞菌亚纲 Agariomyetdae),伞菌目(Agarieale).口游科(Tridhoomataceae),链疫抱属(Moniliophthwra). 寄主范围 可可(Theobroacacao .raorellana ,尖叶异翅木(Heteropterysacutilia)、红木(Bian ,辣椒(Ca户 番茄(Solau 、茄子(s. melongena、洋茄(s.ycocarpum,锥花茄 Sic1a7nm anum1lycoperSicum cernuun、Boutelouua 、Arrabidaeazuerrucosa S，bniculatn1 1,以及可可属Theobre ra eriopola、 茄科Solanaceae 紫蕨科Bignoniaceae)、 金虎尾科Malpighiaceae)、梧桐科Stereuiaceae) Herania属其他一些植物 A.3地理分布 主要分布在拉丁美洲及加勒比海地区;巴西,巴拿马、秘鲁、哥伦比亚、玻利维亚、厄瓜多尔、委内瑞 拉、伯里兹、多米尼加、格林纳达、圣文特森、特立尼达与多巴哥、丰亚那、苏里南 A.4危害症状 可可丛枝病菌在可可营养生长时期,花期、结荚成熟期都可以侵染,侵染部位为叶、茎、荚果、种子和 花序 侵染后,茎干外部褪色溃疡,生长不正常,枝条肿大，感病植株在茎,叶片等部位产生丛枝症状 腋芽丛生 果实、花序发生肿大、畸形,病部有变色坏死症状 叶片生长不正常,叶柄,叶枕肿大致叶片 成三角形.有时叶脉及叶肉肿大,叶片坏死 果实肿大畸形,果肩宽,向下渐窄如胡萝卜状,果实/果荚有 褪色现象,坏死组织有黑褐色或黑色边缘,流出不正常粘液,种子粘连在一起 感病植株枝条干枯坏死 后会长出菌盖为粉红色至深红色的子实体,菌盖颜色随时间推移而变暗 A.5病害循环 可可丛枝病菌病害循环具明显的寄生和腐生两个生长阶段 首先病菌担抱子产生芽管通过气孔侵 人植物分生组织,引起植株增生和畸形,失去顶端优势形成丛枝,病菌在植物细胞间营活体寄生生活,此 时菌丝体为单核菌丝,菌丝弯曲呈波纹状,较宽,无锁状联合,人工接种条件下,活体寄生阶段可以持续 60d左右;在病菌危害组织坏死、死亡前或后,菌丝体发展为双核菌丝,较窄,具锁状联合,病菌侵人细 胞内,营腐生生活,在干湿度合适的条件下,产生担子果,并形成担抱子,完成病害循环
GB/T36809一2018 A.6传播途径 可可丛枝病菌主要通过果荚内部组织和种子表面粘附的袍子和菌丝远距离传播,病菌也能侵染植 株,随苗木远距离传播 由子实体产生的担抱子可以在高湿度的情况下经由空气传播,担袍子产生芽抱 通过气孔侵染寄主的根,茎,花及幼果 病菌在田间不能够通过茄属植物进行传播
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GB/T36809一2018 不同发育阶段的担子果 释放抱子后的担子果 田间可可上的担子果 a b 图B.3M perniciosa担子果形态 100dn 30dpk 80dpi 270dpl b a)接种30d后茎 接种80d后接种部位 接种100d后茎尖坏死 d)接种270d后干枯 尖轻微肿胀增大 明显肿胀增大并有腋芽丛生 枝条上的担子果 图B.4可可苗接种M.pernicios后不同时间阶段的症状变化
GB/36809一2018 附录 C 资料性附录 可可丛枝病菌与可可链疫跑荚腐病菌的比较 可可丛枝病菌与可可链疫抱荚腐病菌异同见表C.1 表c.1可可丛枝病菌与可可链疫袍荚腐病菌异同 项目 可可丛枝病菌 可可链疫袍荚腐病菌 MomiliophhorupericiosStahelAime8 Philips M.roreri(Ci.H.C.Evans,Stalpers,Samson & 学名 Mora2005)=MarasmiusernieiosusStahe1915 Benny1978 CrinielisroreriCif. H.c.Evans=MoniliaroreriCf Crimijpelis/erniciosa(Sahel)Singer(1942) 面丝均有叩核和双核两种肥式 单核西丝脚胀、弯曲然单核面丝不具锁状联合菌丝体有肿胀,相互 绕、不具有锁状联合,比较宽大,宽度为5m20m缠绕,菌丝层或假子座串生有念珠状分生袍 无性态 存在于细胞间 侵染组织25d一40d后,顶端组织死子,分生抱子壁厚,淡黄色至棕色,球形或近球 亡,双核菌丝出现,菌丝直,常具锁状联合,菌丝宽度变形,分生袍子具桶孔隔膜,大小为(5Am~ 窄,宽度为1Am~34m,存在于细胞内 11m)×(84m一204nm) 有性态有性态为担袍子,由伞盖状担子果产生 不具有性态 菌落在PDA平板上初为纯白色,后为奶油色,圆形,不 菌落在PDA平板上初为白色后为奶油色至 菌落特征隆起,菌丝致密,平铺于培养基表面形成毡状菌丝层,打 深褐色 开培养皿盖,菌落有蘑菇气味 生长温度最合适温度为25 适宜生长温度22C一33 巴西、巴拿马、秘鲁、哥伦比亚、玻利维亚、厄瓜多尔、委分布范围较小,巴西、巴拿马、秘鲁、哥伦比亚、 分布 内瑞拉伯里兹、多米尼加,格林纳达,圣文特森、特立尼玻利维亚、厄瓜多尔,委内瑞拉,哥斯达黎加、 达与多巴哥、亚那、苏里南 尼加拉瓜、洪都拉斯、危地马拉、墨西哥 可可(T.cacao)、尖叶异翅木(Heterobterysacutiolia 红木(Biranrlama)辣椒(Capsiun anuwm)、番茄 melonena)、洋茄(s Solancopersic latau COD 锥花茄 D7 e77t2 可可T，cacao)、野生HerramiasPp.、野生 寄主 ,Arrabidaeaerrwcox,以及可可属Theobronagileri、Theobromasp Bowleloa 紫 Theoroa Solanaceae 藏 茄 (Bignoniaeeae)、金虎尾科Mapighiaceae)、梧桐科 属其他一些植物 (Sterculiaceae、Herrrania 在可可开花期、果实生长期、幼苗期都可以危害,可侵染 危害果荚,不侵染植物的嫩芽等分生组织 为害 植株的叶片、嫩枝、花序、幼嫩果肉、种子和果荚 病菌侵染后,主一般经过30d50d后显 病菌侵染后,寄主一般经过14d21d后显症 在茎、症 果荚变形、早熟,表面形成棕色病斑,形成 症状 叶片等部位产生丛枝症状,腋芽丛生 感病植株枝条干有奶油色至黑色粉状的抱子堆 荚果内部具 枯坏死后,会长出菌盖为粉红色至深红色的大型子实体典型的组织坏死,周围包围有一圈腐烂水淋 物质
GB/T36809一2018 附 录 D 规范性附录) PCR检测鉴定方法 D.1DNA提取-CIAB法 采用常规CTAB法提取病菌基因组DNA作扩增模板,分离材料可选寄主病部的菌丝体,担子果或 担抱子堆,也可选分离物菌落边缘新鲜菌丝(PDA培养基、25、黑暗条件下培养5d)20mg 加人 570AL.2%CTAB提取液,30"L.10%SDS溶液,充分研磨,65C水浴30min,加人600AL.酚氯仿液 酚;三氯甲炕:异戊醉25;24;1)抽提2次,l1000片常温离心5min,取上清液,加人1/10体积 3mol/几L醋酸钠溶液和2倍体积无水乙醇混匀,室温静置20 min,l1000！4C离心10min,弃上清液 沿离心管壁加人1ml70%乙醉溶液清洗DNA沉淀,ll0004C离心5min,弃上清液,加人40AL TnEDTA缓冲液游解,置于一20七备用 也可用商品化的适合真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌 丝DNA D.2PCR反应 PCR引物:ITS6(5'-GAAGGTGAAG;TcGTAACAAGG;3')(Cooke，1997),ITs4(5'-TccTc CGCTTATTGATATGC)(white，1990)PCR反应体系见表D.1 每个样品设2个平行处理 反应体 系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整 PCR反应条件;95C3min; 95C50s,58C50s,72C1min,30个循环;72C7min延伸 表D.1CR反应体系 名称 储存液浓度 加样量/AL PR缓冲液(含MgCl) 10× 2.5 dNTPs 10mol/L 104mol/L ITS6 ITS！ 104nmol/L TaqIDNA聚合酶 5U/aL. 0.5 DNA ddH.(O 补ddH.O至25Al D.3PCR产物检测 用1×TAE配制1.2%琼脂糖凝胶,加热溶化后冷却至55C左右 将5AL澳化乙锭(EB)加人到 配制好的100mL凝胶中 将凝胶倒人凝胶槽中,插上样品梳子 冷却凝固后拔掉梳子,在电泳槽内加 人1×TAE,缓冲液要没过凝胶表面约1mm,冷却静置 将加样缓冲液与样品混合后加人样品孔,同时 设计PCR的阴性对照和阳性对照,并加人分子量标准物(Marker) 接通电源,以3V/em~5V/cm电 场强度进行电泳,0.5h后观察结果 电泳结束后,将整个凝胶置于凝胶成像系统上观察,记录结果 10
GB/36809一2018 D.4PCR产物测序、ITSs序列BLAST及系统发育分析 PCR产物纯化后测序,测序结果与NCBI/GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较,确定 与实验菌株亲缘关系最近的种 从GenBank获得与实验菌株ITs序列同源性较高的相关种属的ITS 序列,构建系统发育树 用MEGA 4.0.1进行进化分析,进化树的构建采用Neighbourjoining verSion 方法,设置均为默认值,同时计算进化距离及各分支的置信度
GB/T3680g?2018 ofwitchesbroomandfra ofcacao [1] AimeMC,MorawP.The causalagents rostypodrot ofMarasmiaceae chocolateTheobromacacaoformanewlineage [J].Msycologia,2005,975) 1012-1022. [2]CookeDELDuncanJMPhylo logeneticanalysisofPhytophthora speciesbasedonITs and1TS2 oftheribosomalRNA generepea[].MycologicalReearch,1997,101.667-677 sequences LyndelwMM.Johanm of aRBryanAB,etal.Moniliophthoruperniciosdthecausalagent witchesbroomdiseaseofcacao:what's ''snewfromthisoldfoe?[.MolecularPlan ntPathoogy." ,2008,9 (5):577-588 bhiology ofMoniliophthoraperni- [4]MarelliJP,MaximovasN,GramachoKP,etal.Infection ciosaontheobromacacaoandAlernateSolanaceousHosts[J].TropiealPlantBiology,2009,2: 149-160. [5]ScarpariIM,MeinhardtLW,MazzaferaP,etal.Biochemicalchangesduringthedevelop mentofwitchesbroom diseaseofcocoainBrazilcausedbyCrinipellisperniciosa themostimportant ].JournalofExperimentalBotany,2005,56(413):865-877. 6]WhiteTJ,BrunsTD,leeS,etal.Amplificationanddirectsequencingoffungalribosomal DNAgenesforphylogenetics[].AcademiePress,1990,315-322.

可可丛枝病菌检疫鉴定方法GB/T36809-2018

可可是一种重要的经济作物，但由于其易感性和扩散性，常受到多种病害的危害，其中丛枝病是最为严重的病害之一。为了保障可可生产的健康发展，GB/T36809-2018标准制定了可可丛枝病菌检疫鉴定方法。

该标准主要涉及到样品采集、处理和检测等方面的内容。在样品采集方面，需要从可可果实、芽切口和病斑处选择不同部位的组织进行采样，并储存在密封袋中。在样品处理方面，首先需要将样品表面的杂质和污染物清除干净，然后再进行病原体分离和纯化。最后，通过PCR技术检测可可丛枝病菌的存在与否。

该标准的制定对于保障我国可可生产的质量和安全具有重要意义。首先，可以通过及时发现和鉴定病原体，采取有效的防治措施，减少病害造成的损失。其次，加强对可可种子、苗木等关键物料的检测和监管，避免病原体的传播和扩散。最后，提高了可可产品的质量和安全水平，推动了我国可可行业的健康发展。

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