国家标准 GB/T32211一2015 液相色谱用可变波长光度检测器的测试方法 Standardpraeticefortestingvariable-wavelengthphotometrie detectorsusedinliquidchromatography 2015-12-10发布 2016-07-01实施中毕人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布中国国家标准化管厘委员会国家标准
GB/T32211一2015 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由机械工业联合会提出本标准由全国工业过程测量和控制标准化技术委员会(SAC/Tc124)归口本标准起草单位:仪器仪表行业协会、大连依利特分析仪器有限公司、计量科学研究院、北京创新通恒科技有限公司、华东理工大学、北京分析仪器研究所本标准主要起草人;马雅娟,张学云,陶红,沈志刚,张维冰,娄兴军
GB/T32211一2015 液相色谱用可变波长光度检测器的测试方法范围本标准用来指导可变波长光度检测器(VwPD)的性能测试,该检测器是液相色谱系统中在 190nm800nm波长范围内的一个或多个波长工作的检测部件为与GB/T32212一2015一致,通常测试波长使用254nm,也可选择其他波长进行测试本标准旨在描述检测器的性能,包括独立于色谱系统的静态性能及与流动相通过的动态性能关于液相色谱程序的总体说明,见参考文献[1]~[9] 关于液相色谱检测器的原理、结构,使用和评估的资料,见参考文献[10]、[11]以及[1][7]中涉及检测器的内容本标准并不涉及实际使用过程中有关的安全问题用户在使用前,确定本标准应用的局限性,并有责任制定适宜的安全及健康规范规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 AsSTME275紫外,可见和近红外分光光度计性能描述和测试方法(Praetieefordescribingandl ceofultraviolet,Visible,andnear-infrared trophotometers neasurn塔pertormance spect iauidchir termsandrelationships) AsTME682液相色谱术语(Practiceforlie tography hromat 术语和定义 ASTME682、ASTME275界定的以及下列术语和定义适用于本文件 3.1 吸光度校准absorbancecalibration 校正吸光度范围在士5%以内的验证程序 3.2 漂移drir 测量1h以上,用每小时吸光度单位(AU/h)表示的噪声包络线的平均斜率 3.3 动态dynamie 在流量为1.0mL/min下的状态线性范围linearrange 可变波长光度检测器的线性范围是流动相中测试物质在检测器上的响应值与浓度的比值恒定在士5%内所对应的浓度范围,图1中和7.2.2进行了详细说明线性范围是最高线性浓度与最小检测浓度或最小线性浓度中比值的较大者
GB/T32211一2015 1.06R R 0.95R R=响应常放 G=最小检测浓度 G=最小线性浓度 C=最高线性浓度线性范围对数浓度图1光度检测器线性图示例 3.5 长期噪声long-termnoise 在6周期/h一60周期/h(0.1周期/min1.0周期/min)频率之间,检测器随机信号的最大振幅的峰-峰值,用AU表示注这种噪声可能被误认为是后洗脱峰,该噪声仅表示观测到的噪声,但并不总能观测到. 3.6 最小检测限minimumdetectability 特定溶剂中特定溶质在光度检测器中产生的响应值为2倍检测器静态短期噪声的浓度注静态短期噪声是测量峰-峰值噪声,利用统计法测量噪声值时建议当噪声值等于3倍均方根(RMs)时可保证其值超过99%置信水平因为峰-峰值噪声接近5倍均方值噪声,所以本标准定义的最小检测限为保守的估算值响应时间输出速度responsetimme(speedofoutput) 在检测器线性范围内,当流动相组成以阶梯式从新的平衡值10%变化到90%时,检测器输出所需的时间注:因为检测器体积很小,传输速率不受扩散影响,一般响应时间足够快,可忽略不计通常将记录仪或数据处理装置)的响应时间与相关检测器电位差计和记录仪(或数据处理装置)放大器相比较,影响观测响应时间的因素包括实际检测器响应时间电子滤波和系统带宽 3.8 short-termnoise 短期噪声在1周期/min频率以上,检测器随机变化信号的最大振幅的峰-峰值,用AU表示注短期噪声值决定了用可变波长光度检测器测定的最小信号值和痕量样品可达到的精确定量限,并确定线性最低限本噪声仅对应于可观测到的噪声 3.9 静态statie 在无流量下的状态
GB/T32211一2015 3.10 波长准确度wavelenghaccuracey 测试样品的最大吸收波长与其已知最大吸收波长的偏差 3.11 波长重复性wavelenghpreeison 可变波长光度检测器再现到相同光谱位置能力的评估注:重复将检测器波长设定为已知样品的最大吸收波长处,考察测量已知样品吸收值的再现性重要性和用途 4.1在不同或特定条件下,有可能观测和测量到检测器的各种性能,但是本标准旨在相同工作条件下获得一套完整的检测器技术指标,也指出了为完整地描述检测器的能力,在检测器使用范围内的几种条件下测试它的性能本标准中使用的术语和试验方法普遍适用,不考虑最终工作参数 4.2使用的记录仪(或数据处理装置)或其他读数设备的线性和响应时间不应失真,否则会干扰检测器性能这需要调节增益、阻尼,校准到与制造厂的标准一致如果在检测器和终端读数设备之间使用辅助电子滤波器或放大器,也应首先确定它们的性能指标噪声和漂移 5.1 测试条件样品池中用适当级别的脱气纯甲醇充满如果有参比池,则选用空气或氮气充满高压设备可能使空气中产生臭氧,所以最好选用氮气保持整个系统温度稳定,防止基线漂移检测器应固定在测试现场,并且在测试开始前至少启动24h 预热不足会产生超出检测器真实值的漂移检测器波长设定在254" nm 5.2 测量方法 5.2.1在泵与检测器之间连接一个合适的装置,在1.0ml/min甲醇流量下,此装置可提供至少75kPa 的背压检测器出口连接一小段(大约100mm)内径0.25 1不锈钢管防止气泡形成将记录仪(或 mm 数据处理装置)连接到检测器对应的输出端注:推荐的设备包括: 长度2mm一4mm的内径0.1mm不锈钢管 a b 用扁口钳或切管器制成的长度250mm内径0.25mm0.5mm的不锈钢盘管固定在系和进样器间背压间 c 5.2.2用脱气甲醇反复冲洗溶剂瓶和色谱系统,包括检测器,去除系统中所有其他溶剂、可溶物质及夹杂的气体把甲醉注人溶剂瓶,并用泵带动甲醇冲洗整个系统至少30nmin,充分清洗系统 5.2.3如需要,参比池中注人空气或氮气确保池体清洁,没有尘埃并完全干燥 5.2.4进行静态测试时,停泵,让色谱系统在室温,无流量条件下稳定至少1h 设定衰减器在最大灵敏度(最小衰减量),也就是最小满度吸收值(AUFS) 调节具有可变响应时间的光度检测器的响应时间尽可能接近2s,记录使用的响应时间,调节检测器输出接近读数装置刻度中部在这种状态下,记录检测器信号至少1h,在测量过程中,环境温度变化不超过2C 注:时间常数可通过响应时间乘以放大因子2.2来换算电子滤波器对观测噪声的影响可以通过设定一系列响应时间进行重复的噪声测量来确定 5.2.5画几组长度在0.5min1nmin之间的平行包络线,观测任意15min周期内所有检测的随机变
GB/T32211一2015 化的框图(见图2) 这种画平行包络线的方法可以使每组平行线之间的距离最小计算出所有部分的平均值,以AU表示的距离值除以光程(em)得到静态短期噪声 5.2.6在15nmin静态短期噪声测量段的中间做标记,在中间部分的四周画一系列平行包络线组,每组对应10min长,选择线间纵向距离最大的一组平行包络线(见图2) 将纵向距离AU值除以光程(em 得到静态长期噪声 5.2.7画一组1h纵向距离最小的平行包络线(见图2),每根线的斜率为静态漂移,用AU/h表示 5.2.8在与5.2.15.2.3管路、溶剂、温度等相同条件下,设定系流量1.0mL/min,让系统稳定 15nmin,在此流量条件下,记录信号至少1h,在测量过程中,环境温度变化不超过2C 5.2.9画几组平行线按5.2.5描述的方法测量纵向距离,并计算动态短期噪声 5.2.10按5.2.6描述的方法测量动态长期噪声 5.2.11按5.2.7描述的方法,画平行线组,这些线的斜率就是动态漂移 5.2.12系统的实际噪声可能比检测值大或小,这取决于检测器数据采集或信号检测方法,因为检测到的噪声是与读数装置的频率、响应速度和带宽相关的函数中间值 15min Y/(光程x) 短噪 =0.5min1min 10min 10mn 长噪=Z/光程(Z个>z 漂移D 时间轴 60min 图2光度检测噪声和漂移测量示例(记录仪输出图
GB/T32211一2015 波长准确度和重复性 6.1概述可变波长光度检测器的波长准确度和重复性是色谱检测性能的重要参数在检测中选用的不同的波长检测不同吸收光谱的不同化合物如果波长不准确,测定的线性范围也可能不正确,从而影响检测检测器的波长重复性要按照已知的相同波长来调节可变被长光度检测器波长由检测器的单色仪光学校准由制造商提供，一般不需要调整某些检测器换灯后需要对灯校准本和光学校准来决定标准可用于验证已校准的检测器其波长准确度和重复性是否符合制造厂的技术指标 6.2波长准确度测量方法 6.2.1将已知最大吸收波长的化合物溶液注人检测池中,测定可变波长光度检测器波长准确度比较化合物最大吸收波长的测量值与已知值具有多种可用的化合物和溶剂推荐方法见G.2.2 6.2.5 注;推荐方法包含于美国专利4 4,836,673,本标委会不对本标准中任何条款有关专利权的有效性发表看法明确建" 议该标准的使用者确定这些专利权的有效性,侵权专利权的风险全部由本标准的使用者负责,否则考虑其他可替代方法 6.2.2测试溶液的配制,25ml水中溶解2六水合高氯酸饵,浓度为0.14mol/1 选择合适的滤膜过滤溶液,确保样品中没有不溶性杂质注:把水加人装2g六水合高氧酸饵的小瓶中溶解固体样品,转移到25ml容量瓶中,并用水定容最终溶液不需定量,转移溶液过程中应注意将溶解的高氯酸饵转移至容量瓶中 6.2.3打开检测器,按产品说明书预热用水彻底冲洗检测池,使用的水最好与配制测试溶液使用的水相同如果使用其他的测试化合物,确保使用与测试溶液相同的溶剂) 测试过程中设定检测器波长 ,将检测器归0(在变换波长后,有些检测器会自动归0) 用1mL以上的饵测试溶液冲洗检为250nm 测池,记录吸光度读数增加1nm波长,用1ml以上的水冲洗检测池,将检测器归零,用饵测试溶液冲洗池体,并记录吸光度读数每次增加0.5nm到1nm,重复上述步骤,直至260nm 6.2.4绘制吸光度与波长关系曲线,并测定出最大吸光度(见图3),将计算的最大吸光度与255nm时高氯酸饵的最大吸光度比较,记录测试溶液的理论最大值与计算最大值计算的最大值应在制造商规定的波长精度以内,如果检测器不符合规定,根据说明书调整光源或单色仪,或同时调整两者最大的波长 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 波长/nim" 图3波长精度测试图示例
GB/T32211一2015 注:因为可变波长检测器可有较大的带通,所以无需以分光光度计的标准来要求其波长准确度根据报道已知波长已全部接近nm 6.2.5可在379nm或522nm等波长处进行重复测试,如果有可见区的光源,则可用来测试522 nm 6.3波长重复性测试方法 6.3.1对于可变波长光度检测器的波长重复性的测定,操作者重新设置检测器波长后,重复测定一种化合物溶液在已知其最大吸收波长的吸光度本方法主要以机械和(或)电子方法确定检测器的波长位置,以下为推荐方法 6.3.2确认仪器波长准确度后,设定检测器的测定波长为被测物的最大吸收波长高氧氨酸饵溶液为 255nm n ),用1ml以上的水冲洗检测池,然后将检测器归0 用1mlL以上的高氯酸饵溶液冲洗检测池,记录吸光度重新设定检测器波长至与样品最大吸收波长相差10nm以上处,再恢复至最大吸收波长重复冲洗测试溶液,记录吸收值，直至最后得到5个样品吸光度值 6.3.3计算吸光度读数的相对标准偏差(RSD)来确定波长重复性,见式(1) RSD= -(/(A， -)AX100% 一A?/(n一式中: -单个吸光度值 A A 吸光度平均值试验次数最小检测限,线性范围和校准 7.1概述如果要确定某一种物质在光度检测器上的线性范围,则应确定这种测试物质的响应 7.2的方法已考虑为最差的情况 7.2测试方法 7.2.1在甲醇中溶解一种适合的化合物,其具有紫外吸收且吸收值随波长变化而产生显著变化选择一个预期超出线性范围的浓度,通常吸收值在2AU以上将此溶液准确稀释成能覆盖整个线性范围的系列溶液,也就是说,稀释到最小检测浓度用甲醇冲洗检测池,在检测池中为甲醉时将检测器读数调整为0 用最低浓度的样品溶液冲洗检测池至得到稳定读数,通常1nmL的冲洗量就足够记录检测器输出读数然后,用下一个浓度较高的样品溶液清洗注射器,依次将每份稀释得到的样品溶液注人检测池中在静态条件下测量,至少获得线性范围内的5个测量值 7.2.2计算每个样品溶液的检测器响应值(AU)与浓度(4g/L)的比值,将这些比值对浓度的对数绘图见图1) 线性区域定义为恒定响应较高浓度时,一般与线性有负偏差,而在低浓度时,出现正、负偏差均有可能 5%位置画水平线,测量恒定响应比线与一条5%范围线在高浓度端相交,交点所对应的浓度就是线性上限浓度线性下限浓度是最小检测浓度(见 .2.3)或恒定响应比线与一条5%范围线在低浓度端相交交点所对应的浓度,两者中较大者 7 7.2.3通过计算静态短期噪声2倍的浓度,确定试验物质的最小检测限,需标明溶剂和溶质 7.2.4计算线性上限和下限之间的比值得出线性范围,用一个数值表示因为此值是在最差情况下测量的,对在选择波长范围内具有宽谱带吸收的物质,其线性范围可能要比测试得到的更大 7.2.5绘制或计算检测器响应(AU)与已知摩尔吸光度测试物质浓度(4g/aL)之间的关系,找出通过坐标原点的最佳线段,按式(2)计算测试溶液的摩尔吸光度e:
GB/T32211一2015 slopXMw 式中 -线性部分斜率,单位为吸光度单位微升每微克(AUAL/4g); slop Mw -摩尔质量,单位为克每摩尔(g/mol) -制造厂规定的光程,单位为厘米(em) 将得到的值与实验测得的值或参考文献(见注)中的值进行比较,如果值相差大于5%,需要调整光度检测器具体操作查阅制造商说明书注:甲醉中的脉啖在254nm处摩尔吸光度是8.77×10',在280nm处是1.42×10';0.005mol/I硫酸中的重铬酸钾在254nm的摩尔吸光度是4.22×10=,在280nm是3.60×10 响应时间 8.1 概述当使用小粒径短柱和快速记录仪(或数据处理装置)时,检测器的响应时间就变得十分重要如果响应时间长,有可能降低检测噪声,增加线性范围尽管这对宽峰几乎没有影响,但是窄峰信号会明显下降如果响应时间可调,在其最大值和最小值处进行测试 8.2测试方法 8.2.1流动相组成可呈梯度变化,输出信号记录在快速响应装置上如果记录仪(或数据处理装置)响应时间不是远远小于检测器响应时间,那么只能得到检测器和记录仪(或数据处理装置)响应时间的叠加值,记录色谱图时也是叠加的响应时间 8.2.2设定流量为2.0mL/min. 8.2.3通过在泵和检测器之间安装有1mL定量环的进样阀(或者体积至少是4倍检测器输人端到输出端管路总体积的定量环),可获得信号值的阶梯式变化观察记录仪(或数据处理装置)谱图,确定其已达到稳定不稳定状态可能发生在响应时间为快速情况下,此时需要增加样品体积将定量环中充满一定浓度的检测物质的甲醇溶液(参考7.2.1),在适当的衰减值下能得到检测器满量程的50%~ 95%信号,此时可认为该浓度在线性范围以内 8.2.4以3.0mL/min流量重复上述测量如果测量值小于2.0mL/min时得到的值,那么在更大流量下重复测量,直到获得稳定的数值谱图上新平衡值信号从10%上升到90%时,所需要的时间为响应时间(见图4) 谱图采集速度 8.2.5 应足够快才能获得准确的测量结果
GB/T32211一2015 新建平衡 -4)/0 (d4一4)-(4一4g)=(4- 原始平衡 -响应时间时间/s 图4光度检测器与响应时间测量示例折光率(RI)灵敏度 9.1概述理想状态下,要使运行梯度时基线变化最小,紫外可见检测器应对流动相变化而引起的折光率变化不敏感在这种试验条件下,折光率的灵敏度是通过测量检测池中充满甲醇(n=1.329),然后充满环己炕()=1.427)时基线的变化得到的 9.2测量方法开启检测器,并使之稳定1h以上,或按制造厂规定时间预热 9.2.1 9.2.2设定波长280nm,检测器/记录仪(或数据处理装置)输出0.01AUFs 9.2.3设定绘图速率1cm/min 9.2.4用注射器向检测池注人至少1mL甲醇,使得检测池内充满甲醇将注射器继续连接在检测池人口,用一合适的盖或塞堵住检测器出口管来密封检测池 9.2.5记录至少5min的基线 9.2.6取下管盖或塞子,重复此过程,直至基线变化不超过0,001AU 9.2.7取下管盖或塞子,用注射器注人色谱级乙醇清洗检测池 9.2.8清洁、干燥,用注射器注人环已熔,重复9.2.49.2.6 9.2.9以AU为单位,测量并记录2条基线的差值(见图5)
GB/T32211一2015 乙醉冲洗甲醉环乙婉再充满再充满 20 25 时间/min 图5可变波长检测器折光率测量示例 10 补充说明 10.1 其他重要参数 10.1.1要对可变波长光度检测器(VWPD)进行更全面的评估,除上面描述的因素外，下列因素也很重要 10.1.2衰减范围;在标准输出电压下检测器输出的最大和最小电压值设置,用满刻度吸收单位表示 AUFSs) 此电压规定为记录仪(或数据处理装置)满刻度毫伏数mVFS) 当零点信号调整为记录仪 (或数据处理装置)的零点后,该AU准确地代表了记录仪(或数据处理装置)的满刻度值 10.1.3波长范围检测器可正常使用的波长范围 10.1.4带通:最大值一半时谱线的宽度,对于宽谱光源,由滤光片的带宽决定 10.1.5光程:光通过检测池中液体的轴向有效长度 10.1.6池体积检测池中产生光吸收的有效体积 10.1.7检测器体积;检测器人口与出口之间的总体积,人口端应可直接连接色谱柱,出口端可与另检测器人口端相连 10.2参比 10.2.1检测器采用单光束时,无参比 10.2.2检测器采用双光束时,其中有一个参比池应事先说明,否则参比为空气 10.2.3对于双光束仪器,如果样品光路与参比光路平衡时的光强比不是1:1,应事先说明 10.3监视器显示到达样品光能量的仪表或其他装置,应说明该仪表测量的量纲 10.4校准检查在不使用外部装置情况下,调节检测器输出至特定吸收值的装置
GB/T32211一2015 10.5灯类型检测器使用的光源种类 10.6灯预期寿命 5只或更多灯连续工作的平均寿命,通常是指光强度衰减到一半,而不是完全失效时的寿命 10.7压力限保证检测池正常工作而不产生损害或泄漏时的最大工作压力 10.8热交换器把流动相温度调整到与检测器池体温度相近的装置 10.9检测池接触材质检测池所有与流动相接触部位的材料 10.10输入管所有连接到检测池人口管路的材质、长度和内径 10.11 最大归零补偿检测器在微调或粗调和微调同时进行的条件下,检测器零点变化的最大量 10.12光电检测器光电检测器的类型 10.13杂散光滤光片如果有,说明其类型以及带通 l0
GB/T32211一2015 参考文献 [1]Englehardt，H.，ed.,PraeticeofHlighPerformanceLiquidChromatography,Springer rVer lag,NewYork，NY，1986. [2]Johnson，E.L，andsitevenson，R. BasieLiauidchromatography，Varian Association PaloAlto,CA，1978 [3]Parris，N.A.InstrumentalLiquidChromatography,JournalofChromatographyLibrary. Vol5，ElsevierSeientificPublishingCo.，Amsterdam,1976. [4]Scott，R.P.w.,ContemporaryLiquidChromatography，TechniquesofChemistry，VolXI ohnwiley &.Sons，Ine.，NewYork，NY，1976 alHighPerformaneeLiquidChromatography，Heyden.andSon [5]sSimpson,C.F.ed.，Practieal London，1976 Limited. Smith，R.M.，Gasand [6们 LiquidChromatographyinAnalyticalChemistryJohnwiley& Sons，Inc.，NewYork， 1988. Snyder，L.R.，andKirkland， [7刀 J.J. IntroductiontoModernLiquidChromatography，2nd 8 edition，JohnWile Sons，Inc.，NewYork，NY，1979. ALab Heftmann， [8] Chromatography HandbookofChromatographie and oratory ElectrophoreticMethods，3rdcdition，VanNostrandReinholdCo.，NewYork，NY，1975. Eds.，HlandbookkofChromat tography，VolI，CRCPress, ZweigG.，andsherma Cleveland，OH，1972. Scott，R.P.W.，LiquidChromatographyDetectors，JournalofChrom8 [10] atographyLibrary Vol33，ElsevierScientificPublishin ingCo.,Amsterdam，1986. [11] Vickrey，T.M.，ed.，ILiguidChromatographyDetectors，ChrommatographicScienceSeries， Vol23，MarcelDekker，NewYork，NY，1983. [12] Blair，E.J.，IntroductiontoChemicalInstrumentation，McGraw-Hill，NewYork，NY'， 1962，andPracticeE386onDataPresentationRelatin ingtoHighResolutionNuclearMagneticReso nanceNMR)Spectroscopy3 13 Esquivel，J.B.,“wavelengthAccuracyTestimgofUV-VisibleDetectorsinlLiquidChroma tography,”Chromatographia，Vol26，1988，pp.321-323. [l4]PfeiferC.D.LarsonJ.R.andRyderJ.F.“LinearityTestingofUItravioletDetectors p.l622-1624. inIiquidChromatography,”AnalyticalChemistry，ANCHA，Vol55，1983， GB/T322122015液相色谱用固定波长光度检测器的测试方法 151

液相色谱用可变波长光度检测器的测试方法GB/T32211-2015

什么是液相色谱用可变波长光度检测器？

液相色谱（HPLC）用可变波长光度检测器是一种常用的检测方法，可用于分析各种化学物质。该检测器可以通过不同波长的光束来探测样品中的化合物，从而实现检测目的。

GB/T32211-2015标准介绍

GB/T32211-2015是中国国家标准化委员会发布的关于液相色谱用可变波长光度检测器测试方法的标准。该标准规定了液相色谱用可变波长光度检测器的技术要求、试验方法、检验规则和标志、包装、运输和贮存。

液相色谱用可变波长光度检测器测试方法

液相色谱用可变波长光度检测器的测试方法主要包括以下几步：

样品制备：将待检测化合物从样品中提取出来，通常使用萃取、分离、浓缩等方法。
进样：将样品注入液相色谱仪中，通常采用自动进样器。
分离：将样品中的化合物分离开来，通常使用液相色谱柱进行分离。
检测：使用可变波长光度检测器进行检测。
数据处理：对检测结果进行数据处理和分析。

GB/T32211-2015标准的应用

GB/T32211-2015标准适用于液相色谱用可变波长光度检测器的检测方法。该标准的实施可以保证检测过程的准确性和可靠性，有助于提高检测结果的精度和可比性。