GB/T28984-2012

香蕉苞片花叶病毒检疫鉴定方法

DetectionandidentificationofBananabractmosaicvirus

本文分享国家标准香蕉苞片花叶病毒检疫鉴定方法的全文阅读和高清PDF的下载,香蕉苞片花叶病毒检疫鉴定方法的编号:GB/T28984-2012。香蕉苞片花叶病毒检疫鉴定方法共有11页,发布于2013-06-012012年第41号公告
  • 中国标准分类号(CCS)B16
  • 国际标准分类号(ICS)65.020.01
  • 实施日期2013-06-01
  • 文件格式PDF
  • 文本页数11页
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香蕉苞片花叶病毒检疫鉴定方法


国家标准 GB/T28984一2012 香蕉苞片花叶病毒检疫鉴定方法 Detectionandidentificationofbananabractmosaicvirus 2012-12-31发布 2013-06-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T28984一2012 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位;宁波出人境检验检疫局、上海出人境检验检疫 局、检验检疫科学研究院、浙江出人境检验检疫局 本标准主要起草人:闻伟刚、郭立新、杨翠云、陈先锋、雷荣张永江、张明哲、徐瑛、崔俊霞、张慧丽
GB/T28984一2012 香蕉苞片花叶病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了香蕉苞片花叶病毒血清学和分子生物学特征的检测方法 本标准适用于香蕉组培苗和植株等芭蕉属寄主植物材料中香蕉苞片花叶病毒的检测,也适用于蚜 虫等传播媒介中该病毒的检测 香蕉苞片花叶病毒基本信息 中文名;香蕉苞片花叶病毒 学名:bananabractmosaievirus 缩写;BBrMV 属马铃薯Y病毒属(Po(,yvirus),香蕉苞片花叶病毒其他信息参见附录A 方法原理 利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(Doubleantibodysandwichenzyme-linked immunosorbentassay,DAs-ELISA、体外DNA合成技术的反转录聚合酶链式反应Reverse transeriptionpolymeraseehainreaction,RT-PCR、实时荧光反转录聚合酶链式反应real-time luorescentRT-PCR)进行检测鉴定 仪器设备、用具和试剂 4.1仪器设备 常规PCR仪、实时荧光PCR仪,超净工作台电子天平(感量:0.001g)电泳仪、电泳槽、凝胶成像 系统,高速冷冻离心机,超低温冰箱(一80C)、高压灭菌锅、小型食品加工机、微波炉,酶标仪 4.2用具 可调式微量移液器(2pL.10L.I00lL.200L1000L5000pL)及相应的无RNase吸头,无 RNase离心管,PCR管和研钵等 4.3试剂 主要试剂和缓冲液见附录B和附录C 检测 样品制备 取0.5g10g畸形、变色等症状的叶片或其他植物组织,在研钵或小型食品加工机中充分研磨,
GB/T28984一2012 取五分之一量的均匀后样品,转人离心管中,按1:10(质量:体积)加人样品提取缓冲液振荡混匀 媒 介昆虫按1;l0(质量体积)加人样品提取缓冲液研磨混匀 2000g离心10min,上清液即为 DAS-ELISA,RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测粗提液 注:提取液在3h内使用,否则保存在4条件下 5.2检测方法 5.2.1双抗体酶联免疫吸附测定方法(DAs-ELISA DASELISA检测应设置对照,用健康的植物组织作阴性对照,用感染BBrMV的植物组织作阳性 对照,用样品提取缓冲液作空白对照 其中,阴性对照材料应该尽量与所检测样品一致 具体操作步骤见附录B 当使用商品化检测试剂盒时,参照试剂盒使用说明进行操作 5.2.2RT-PCR方法 RT-PCR检测应设置对照,用健康的植物组织作阴性对照,用感染BBrMV的植物组织作阳性对 照,用ddH.0作空白对照 具体操作步骤见附录C 当使用商品化检测试剂盒时,参照试剂盒使用说明进行操作 5.2.3实时荧光R-PCR方法 实时RT-PCR检测应设置对照,用健康的植物组织作阴性对照,用感染BBrMV的植物组织作阳性 对照,用ddH.O作空白对照 具体操作步骤见附录D 当使用商品化检测试剂盒时,参照试剂盒使用说明进行操作 6 结果判定 样品经DAs-ELISA与RT-PCR检测,结果均呈阳性,可判定样品携带香蕉苞片花叶病毒 样品经DAs-ELISA与实时荧光RT-PCR检测,结果均呈阳性,可判定样品携带香蕉苞片花叶 病毒 样品保存与记录 样品保存 一80C冰箱中,并做好登记和标记工作 样品保 经检测确定携带香熊苞片花叶病毒的样品保存在- 存期限至少1年 7.2结果记录与资料保存 完整的实验记录包括,样品的来源、名称-唯一性标识.检测时间、地点、方法和结果等 血请学测定 需有酶联反应吸光值的原始数据,RT-PCR检测需有电泳结果图片,实时荧光PCR需要有荧光曲线图 与C值 结果记录与资料保存期限至少1年
GB/T28984一2012 附 录A 资料性附录 香蕉苞片花叶病毒相关资料 A.1名称 中文名:香蕉苞片花叶病毒 学 名:bananabractmosaievirus 缩写:BBrMV 分类地位;马铃薯Y病毒属(Poyoirus A.2寄主范围 目前只发现芭蕉属(Musaspp.)植物为其自然寄主 A.3为害症状 病毒侵染香蕉植株后,病叶上沿着叶柄产生深绿色或褐色的梭条斑 而病株花序苞片上则出现黑 色斑点,这些症状常常十分明显,引起香蕉减产和品质下降 A.4分布地区 该病毒主要分布于菲律宾和印度等国,在我国尚未见发生 A.5传播方式 可由玉米缢管蚓(Rhapalaiphaurnmadia)和棉蚜(Aphiswsypi)以非持久方式传播.长距离扩 散则随感病植株的无性繁殖材料传播 A.6粒体形态 病毒粒子线形,长660nm一760nm,直径12nm A.7基因组 能被sDS降解,用硫酸艳溶液提取时,多数粒子的相对分子质量为38KDa,少数为55KDa;用蔗 糖溶液提取时,除上述分子外,还有少数相对分子质量为66KDa和21KDa的分子存在
GB/T28984?2012 s ? 淶?? ??(DAS-ELIsA) B.1? B.1.110PBST?(plH7.4 ?(NaCl 80g (KHPO) 2g (NaHPO, 1l.5 g 2g KCD (Tween-20 5ml 900mL?,?(HHCI)pH7.4,1000ml B.1.2???(pl7.4 (NaSO. 1.3g 20 ?(PVP) g (NaN,) 0.2g Tween-20 20mL 900mL1PBST,HCpH7.4,1000ml B.1.3建?(plH9.6 ?(Na,cO. 1.59g ?(NaHcO 2.93g ?900ml?,?(HCI)pH9.6,1000ml B.1.4??建?(pH7.4) 1PBST? 800ml ???(BSA 2g PVP(MW2400040000 20 ??1000mL B.1.5(pNPP)?(plH9.8 ? 97nmL NaN 0.2g ?600mL?,?(HCI)pH9.8.?1000mL B.2 B.2.1 ??BBrMV尴??,??,100AL/,·2h4C ?
GB/T28984一2012 B.2.2加样 清空酶联板孔中溶液,用PBST缓冲液清洗6~8次,在吸水纸上拍干 每孔加人100AL制备好的 样品检测粗提液,每个样品设2个重复 同时,设置阴性对照,阳性对照和空白对照 室温孵育2h或 4C过夜 B.2.3加酶标抗体 用酶标抗体缓冲液将酶标抗体按说明稀释 清空酶联板孔中溶液,用PBST缓冲液清洗68次, 在吸水纸上拍干 每孔加人100AL酶标抗体溶液,室温孵育2h B.2.4加底物 将底物NPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用) 清空酶联板孔中游液用 PBsT缓冲被清洗6一8次,在吸水纸上拍干 每孔加人100L底物溶液,室温避光孵育至阳性对照孔 显色明显(约30min一60min) B.2.5吸光值的测定 用酶标仪在405nm波长下测定各孔的吸光值并记录 B.3结果判定 B.3.1质量控制要求 缓冲液孔和阴性对照孔的oD值小于0.15,阴性对照孔的oD值小于0.05时,按0.05计算 阳性 对照有明显的颜色反应,孔的重复性以样品OD值的平行允许率控制,按照式(B.1)进行计算; OD一OD ×100% B.1 P= -oDOD? 式中: 平行允许率; OD 重复样品1 OD -重复样品2. 当重复检测样品OD值平行允许率(P)小于20%时,判定检测结果有效 B.3.2若满足不了B.3.1的质量要求,则不能进行结果判定 B.3.3在满足了B.3.1的质量要求后,则按如下原则作出判定 样品oD/阴性对照oD值>2,结果判定为阳性; 样品ODs:/阴性对照OD值<2,判为阴性
GB/T28984一2012 c 附 录 规范性附录 RT-CR方法 C.1主要试剂 C.1.1lRNA提取试剂 Trizol,三氯甲烧、异丙醇、70%乙醇、焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的ddH.O. C.1.2RT-PCR反应试剂 -步RT-PCR反应试剂amv反转录酶(5U/4L)、RNA酶抑制剂(40U/aL)、amv-Optimised Tu/聚合隙(sU/AL),10XRT缓冲液(含0mm/L的Me”),NTP混合物(各10 mmol/L) c.1.3电泳缓冲液TAE(50× 三羚甲基氨基甲烧(Tris) 242g 冰乙酸 52.1ml 乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA2H.O 37.2g 用灭菌蒸僧水定容至1000 0ml 用时加灭菌蒸圜水稀释至1×TAE C.1.4澳化乙锭(EB)溶液(10Hg/L 20 溴化乙锭 mg 灭菌去离子水 20mL c.2RNA提取 取100AL样品检测粗提液到1.5mL离心管中,再加人700L.Triaol和200AL三氧甲婉上 C.2.1 下颠倒混匀5min;410000片离心10min.小心吸取上层无色水相到新离心管中 c.2.2加人等体积异丙醇,混匀,4C静置10min;4C10000离心10nmin,弃上清液 C.2.3加人700Al70%乙醇清洗一遍沉淀 RNA沉淀干燥后,加人20l焦碳酸二乙酯(DEPC)处 理的ddH,O溶解 注;在保证能够得到质量满意的总RNA情况下,也可以采用其他总RNA提取方法 C.3引物序列 BBrMV1;5'-gctgaggcatacataacaatgg-3 -3 BBrMV2;5'-cccaagcagagagtgcatatcac-" 预期扩增片断长度为287p RT-PCR扩增 反应体系如下:10×RT缓冲液(含50mmol/L的Mg+)2.5L、dNTP混合物各10mmol/L
GB/T28984一2012 2.5LRNA酶抑制剂(40U/L)0.5L,amv反转录酶(5U/AL)0.5AL、amv-OptimiedTa聚合 酶(5U/alL)0.5AL、BBrMV1引物20mol/L)0.5AlL、,BBrMV2引物20mol/L)0.5AlL、总 RNA1l,RNasefreedHl.O16.5L,总体积25Al 使用One-stepRNAPCRkit试剂盒或其他等 效产品,也可采用两步法RT-PCR反应试剂,操作步骤按使用说明进行 每个样品设2个重复,同时设 置阴性对照,阳性对照和空白对照 反应条件50CcDNA合成30min,94C预变性2minm n;94C变性30s,60C复性30s,72延伸 ,35个循环;最后72C延伸5 mln. min C.5琼脂糖凝胶电泳检测 C.5.1制备凝胶 用1×TAE配制l.5%琼脂糖凝胶,加热融化后冷却至55C左右 C.5.2加溴化乙锭 将澳化乙能(EB)加人到配制好的凝胶中,EB终浓度为0.5g/ml 将凝胶倒人凝胶槽中,插上样 品梳子 冷却凝固后拔掉梳子,在电泳槽内加人1×TAE,缓冲液要没过凝胶表面约1 mm C.5.3加样 将加样缓冲液与扩增产物按比例混合后加人样品孔,并设置相对分子质量标准(Marker) c.5.4电泳 接通电源,以3V/em一5V/em电场强度进行电泳,0.5h后观察结果 c.5.5结果观察 电泳结束后,将整个凝胶置于凝胶成像系统上观察,记录结果 C.6结果判定 阳性对照,阴性对照与空白对照正确,待测样品出现287bp的扩增条带,经测序和同源性比较,结 果为BBrMV序列时,判定为阳性 阳性对照、阴性对照与空白对照正确,待测样品未出现287bp的扩增条带,判定为阴性
GB/T28984一2012 附录D 规范性附录 实时荧光RT-PCR方法 D.1实验步骤 D.1.1引物和探针序列 引物序列;BBrMV-TF;5 -caaaaactaegaacagggctagaga-3 BBrMV-TR:5'-ccgagtgttgatccacgaa-3 探针序列;EBBrMV-probe:5'-FAMcacacacgcagatgaaagctgcagc-Eclipse-3” D.1.2RNA提取 操作方法见附录c.2 D.1.3实时荧光rCR反应体系 反应体系如下:2×OneStepRT-PCRBufferW10aL、20Amol/L上下游引物各0.6l 20amol/L荧光探针0.6L、50×ROxreferencedye0.4L、5U/LEXTaqTHHs0.4L PrimeSeriptITMRTEn neMixI0.4AlL总RNA1MlLRRNasefreedH.O6AL,总体积20AL 采用 nzyme OneStepPrimeSeriptTRT-PCRKitPerfeetRealTime)或其他等效产品,也可采用两步法实时荧光 RT-PCR反应试剂,操作步骤按使用说明进行 每个样品设2个重复,同时设置阴性对照、阳性对照和 空白对照 D.1.4实时荧光PCR反应参数 反应条件;42C5min,95C10s;然后95C5s,60C31s,共40个循环 本反应条件适用于 AB17000型荧光PCR仪,如使用其他荧光PCR仪,可以根据仪器性能进行适当调整 仪器操作方法 按照设备使用说明进行,反应结束后保存各项数据和图像 D.2结果判定 D.2.1阔值设定 阔值设定根据仪器雕音情况进行调整,或以阀值线刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点 D.2.2质控标准 阳性对照的Ct值应<30.0,并出现典型的扩增曲线 否则,此次实验结果无效 阴性对照和空白 对照无Ct值
GB/T28984一2012 D.2.3结果判定 样品无Ct值并且无扩增曲线,判定为阴性 样品Ct值<35.0,且出现典型的扩增曲线,判定为阳性 样品C值在35.040.0之间时,应重新提取样品总RNA进行扩增检测 重做结果无C值,判 为阴性;否则判为阳性

香蕉苞片花叶病毒检疫鉴定方法GB/T28984-2012

香蕉是我国一种重要的经济作物,但是由于化肥、农药或其他原因导致香蕉出现病害的情况时有发生。其中,苞片花叶病毒是香蕉病毒中的一种,其对香蕉的危害十分严重。

为了保障香蕉的生产和贸易安全,中国制定并实施了一系列的检疫措施。而针对苞片花叶病毒的检疫鉴定方法也得到了相应的完善。GB/T28984-2012标准规定了苞片花叶病毒检疫鉴定方法,包括以下几个方面:

一、样品采集与处理

首先,需要选择健康的香蕉植株作为对照组,并在生产现场或货物入境前采集被检物。若为植株,则需取叶片、茎、根等部位,保证样品的代表性;若为果实,则需取部分肉质组织。采集后将样品放置于密封的容器中,避免污染。

二、核酸提取

将采集到的样品进行加工处理,并提取其中的核酸。目前比较常用的方法是通过PCR扩增技术来检测苞片花叶病毒的存在情况。这种方法基于RNA病毒在细胞内的复制和转录机制,通过扩增病毒基因序列来确定其是否存在。

三、PCR扩增反应

PCR扩增反应是针对苞片花叶病毒检测的关键步骤,也是GB/T28984-2012标准中规定的必要操作。具体过程如下:

  • 1. 取少量提取出的核酸作为模板,加入引物和其他反应物,形成PCR反应体系。
  • 2. 在恰当的温度下进行PCR反应,使引物与模板匹配,逐步扩增目标序列。
  • 3. 将PCR反应产物进行检测,通过分析其大小、数量和比例等参数来确定苞片花叶病毒的存在情况。

四、结论判定

根据GB/T28984-2012标准的规定,若样品在PCR反应中出现了预期大小的特异性条带,则可以判定其为苞片花叶病毒阳性;反之,则为阴性。需要注意的是,阳性结果并不代表整个香蕉批次都有感染,而仅能证明该样品存在苞片花叶病毒。因此,在实际生产和贸易过程中,需要对香蕉批次进行全面检测和监测,以确保其安全性。

总之,针对苞片花叶病毒的检疫鉴定方法是保障香蕉生产和贸易安全的重要手段。GB/T28984-2012标准规定了完善的操作流程,可以在一定程度上提高检测的准确性和可靠性。但需要注意的是,该标准仅限于苞片花叶病毒的检测,对于其他病毒或病原体的检测仍需要依据相关标准进行。

和香蕉苞片花叶病毒检疫鉴定方法类似的标准

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