国家标准 GB/T27530一2011 牛出血性败血病诊断技术 Diagnostictechniquesforbovinehaemorrhagicseptieaemia 2011-11-21发布 2012-03-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27530一2011 前言本标准的附录A,附录B和附录C为规范性附录本标准由农业部提出本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口本标准起草单位,甘肃农业大学本标准主要起草人;胡永浩、包世俊、伏小平、曾巧英、温峰琴、杨学山、邢小勇、郝宝成、项海涛
GB/T27530一2011 牛出血性败血病诊断技术范围本标准规定了牛出血性败血病(bovinehaemorrhagicseptieaemia,HS)的临床与病理学诊断及病原学诊断的方法和技术要求本标准适用于口岸、产地及集散地牛出血性败血病的诊断、检疫规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本凡是不注日期的引用文件其最新版本适用于本标准 GB/T4789.28一2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂缩略语下列缩略语适用于本标准 agargelimmunodiffusiontest) AGID;琼脂凝胶扩散试验(a CIEP:对流免疫电泳试验(counter immunoelectrophoreSistest CSY;酪蛋白-蔗糖-酵母琼脂(e casein/sucrose/yeastagar) HS:出血性败血病(haemorrhagicsepticaemia ontest IHA:间接血凝试验(indirect hamagtutinatio PB:磷酸盐缓冲液(phosphatebuffer) RBCs:红细胞redbloodcells 临床与病理学诊断流行特征黄牛,水牛,耗牛和奶牛均可感染发病患病动物,带菌动物为传染来源有时健康畜禽的口腔、扁桃体和上呼吸道带菌畜群中发生巴氏杆菌病而查不出传染源时，一般认为家畜在发病前已经带菌病畜由其排泄物,分泌物排出有毒力的病菌,污染饲料、饮水、用具和外界环境,经消化道而传染给健康家畜或由咳嗽,喷嚏排出病菌,通过飞沫经呼吸道发生传染也可通过有伤口的皮肤、黏膜发生传染吸血昆虫叮咬也可传播病菌本病的发生一般无明显的季节性通常呈散发性流行,在畜群中少数几头动物先后发病水牛、彤牛有时可呈地方性流行发病率、病死率均高寒冷、闷热,潮湿、拥挤、气候剧变,阴雨连绵、圈舍通风不良、营养缺乏、饲料突变、过度疲劳、长途运输以及其他疾病、感染等是诱发因素 4.2临床症状 4.2.1败血型;病牛病初体温高达41C一42C,呼吸及心跳加快,鼻镜干裂,皮温不整,食欲减退甚至废绝病初便秘,后腹泻,粪便始呈粥样,后为液状并混有黏液、黏膜片及血液,恶臭有时出现鼻漏和血尿腹泻开始后体温下降,不久即死亡病程多为12h一24h 4.2.2浮肿型;除呈现体温升高等一般性全身症状外,病牛颈部、咽喉部及胸前部皮下出现迅速扩展的炎性水肿,同时伴有舌及周围组织的高度肿胀,舌多伸出齿外,呈暗红色呼吸高度困难,皮肤和黏膜发绀,常因窒息或下痢而死病程多为12h36h.
GB/T27530一2011 4.2.3肺炎型;除呈现体温升高等一般性全身症状外,病牛主要表现为急性纤维素性胸膜肺炎的症状体温升高,呼吸困难,干咳,流泡沫样鼻液,后鼻液呈脓性胸部叩诊有痛感病初便秘,后腹泻,粪便恶臭并混有血液病程一般3d7d左右 4.3病理剖检 4.3.1败血型;皮下将各部位黏膜,浆膜、肌肉等均有出血点胸腹腔有大量渗出液真胃,小肠及大肠常见出血性炎症,肠内容物稀薄且多混有血液淋巴结显著水肿脾点状出血但不肿大肺淤血、水肿 4.3.2浮肿型:咽喉部、颈部及肢体部皮下水肿,切开水肿部位流出深黄色透明液体,间或杂有出血咽周围组织及会厌软骨韧带呈黄色胶样浸润,咽淋巴结和前颈淋巴结肿胀上呼吸道黏膜卡他性炎症肺炎型.胸腔中有大量浆液性纤维素性渗出液,肺脏和胸膜表面有小出血点并覆有纤维素膜,肺 4.3.3 脏切面呈大理石状心包与胸膜粘连,内有干酪样坏死物胃肠道急性卡他性炎症和出血性炎症淋巴结肿大,呈紫色,布满出血点,尤以支气管淋巴结与纵脯淋巴结最为明显. 4.3.4依据流行特征、临床症状以及病理变化可作出初步诊断,确诊要进行病原学诊断病原学诊断病料采集及处理无菌采集病死动物的体腔渗出液、血液、肝脏、脾脏、淋巴结等新鲜病料,及时送检或置冷暗处保存备用死亡时间较长的病例可采集长骨骨髓作为病料可现场制作病料涂片或触片,供染色镜检 5.2染色镜检采集病料涂片或触片,染色后置显微镜下观察革兰氏染色(按GB/T4789,28一2003中2.2规定操作)可见革兰氏阴性的短杆菌或球杆菌菌体大小为(0.2Am一0.4am)x(0.6pm一2.5pm) 瑞氏染色(按GB/T4789.28一2003中2.6规定操作)和美蓝染色(按GB/T4789.28一2003中2.1规定操作)时菌体两极浓染,印度墨汁染色(见附录A)可见明显的荚膜慢性病例或腐败材料常不易发现典型细菌,应该经分离培养后再行染色镜检镜检观察到典型菌体,结合流行特点,症状和病变,可初步诊断为本病进一步进行病原分离鉴定以作出确切诊断 5.3病原分离鉴定 5.3.1病原分离病料分别接种麦康凯琼脂培养基(见附录B)、酪蛋白-蔗糖-酵母(csY)琼脂培养基(见附录B)和鲜血琼脂培养基(见附录B),置37C条件下培养18h24h后,挑选可疑菌落进行鉴定当病料中细菌含量小时,可用5%血清肉汤(按照GB/T4789.28一2003)于37C进行增菌培养 5.3.2病原鉴定 5.3.2.1培养特性多杀性巴氏杆菌在麦康凯琼脂培养基上不生长在血液琼脂培养基上经18h~24h后可长成圆形,光滑,湿润,有灰白色光泽的半透明菌落,直径约1mm,菌落周围无溶血现象在CsY琼脂培养基上菌落通常大于血液琼脂培养基上的菌落老龄培养物,特别是在无血培养基上的老龄培养物,形成的菌落小于血液琼脂培养基上的菌落 5.3.2.2菌体形态取血液琼脂培养基上生长18h24h的典型菌落涂片,革兰氏染色镜检可见革兰氏阴性的球杆菌，菌体大小为(0.2m~0.44m n)×(0.6Mm~2.5m). 55 .3.2.3生化试验 5.3.2.3.1取纯培养的待检菌少许接种发酵管(见附录B),置37C培养,每天观察并记录结果多杀性巴氏杆菌可分解葡萄糖、果糖、半乳糖、单奶糖、蔗糖和甘露糖,产酸不产气;不发酵棉子糖、乳糖、鼠李
GB/T27530一2011 糖、菊糖,水杨苷、肌醇 5.3.2.3.2MR,VP试验(按GB/T4789.28一2003中3.4规定操作)阴性 5.3.2.3.3嗓试验(按GB/T4789.28一2003中3.13规定操作)阳性 5.3.2.3.4氧化酶试验(按GBT4789.28一2003中3.18规定操作),过氧化氢酶试验(按GB/T4789.28 2003中3.20规定操作)阳性3-半乳糖苷酶试验(按GB/T4789.28一2003中3.3规定操作、脉酶试验按GB/T4789.28一2003中3.15规定操作)阴性 5.3.2.3.5硝酸盐还原试验(按GB/T4789.28一2003中3.17规定操作)阳性,柠檬酸盐利用试验(按 GB/T4789.282003中3.5规定操作)阴性 5.3.2.3.6硫化氢试验按GB/T4789.28一2003中3.14规定操作阴性，明胶液化试验按 GB/T4789.28一2003中3.10规定操作)阴性依据病原培养特性,菌体形态,生化试验,符合多杀性巴民杆菌特征者可作出确定诊断必要时进行血清分型试验和动物接种试验血清分型试验间接血凝试验 5.3.2.4.1 材料所用材料如下所示标准菌及待检菌荚膜抗原(见附录C) a 特异性抗血清(见附录c) b 1%新鲜绵羊红细胞(见附录C) c) d)致敏绵羊红细胞(见附录C) 阿氏液(Alsever's液)(见附录A) 80孔血凝反应板(大孔板). fD 5.3.2.4.1.2方法间接血凝试验方法步骤如下所示反应板每排第1孔加人0.85%NaC溶液0.72ml,自第2孔起各孔分别加人0.85%NaC 溶液0.4mL b各型特异性抗血清各自单独一排稀释,第1孔加人血清0.08ml,混匀,移取0.4ml到下一孔同样方法稀释至第7孔每孔加人0.4nm致敏绵羊红细胞 c) d)同时设如下对照血清对照;血清(10倍稀释)0.4m十加1%新鲜绵羊红细胞0.4mL 绵羊红细胞对照:1%新鲜绵羊红细胞0.4ml十0.85%NaCl溶液0.4mL -抗原对照1%致敏绵羊红细胞0.4m十0.85%NaCI溶液0.4mL 反应程序见表1 表1间接血凝试验(荚膜分型)反应程序 8(抗体 9(抗原 10绵羊红号孔对照对照) 细胞对照血清稀释倍数 20 4o 8o 160 320 640128o 4 含0.3%甲醛的0.85%NaCl/ml0.720.4 0.4 0. 0, 0.4 0.36 0.4 型特异性抗血清加量/nl 0.4 0.080.4 0.4 0.40.4 0.4 0.04 弃去 1%致敏红细胞/ml 0.4 0.4 0，4 0.4 0，4 0.4 1%新鲜红细胞/ml
GB/T27530一2011 加样后,轻微震荡,置室温,分别于2h18h判读并记录结果结果判定:绵羊红细胞沿着凹孔坡面呈絮块状凝集为阳性,在孔中央形成钮扣状为阴性依据凝集范围的大小判定凝集程度为以下几级 “++++”;凝集颗粒细密并均匀地分布在整个孔底,边缘不整齐,示100%凝集十十十”:凝集的绵羊红细胞平铺孔底,但有卷边或缺口,示75%凝集凝集的红细胞平铺孔底,呈片层或沙撒布样,分布不均匀,边缘不整齐,示50% 凝集 ”:绵羊红细胞凝集面积较小,凝集程度轻微,边缘稍增厚,示25%凝集 -”:绵羊红细胞沉积在孔中央,如小圆盘或钮扣状,示无凝集以“十十”为样品的滴度终点当抗原与抗血清之间出现明显50%或50%以上凝集者,判读为阳性,抗原与抗血清之间出现25%或无凝集者,判读为阴性未知菌株用具有凝集性的抗血清进行鉴定若与所有血清都没有发生凝集反应,则用该方法对菌株无法分型 5.3.2.4.2琼脂凝胶免疫扩散试验材料 5.3.2.4.2.1 所用材料如下所示 a琼脂 b0.85%NaCl溶液 1%硫柳汞溶液菌体抗原(见附录C) d 多杀性巴氏杆菌菌体分型血清,1~l6个血清型(见附录C). 5.3.2.4.2.2方法琼脂凝胶免疫扩散试验方法步骤如下所示琼脂凝胶平板的制备;取0.9优质琼脂加人90mL0.85%NaCl溶液中,加热溶化后再加人 1%硫柳汞溶液1mL,最后加人适量0.85%NaCl溶液定容至100mL 冷却至45C一50C 倾注水平放置的洁净载玻片,玻璃片或平m(凝胶厚度为2.5mm3mm). 打孔:琼脂冷凝后打孔,孔径4mm,孔距6mm,每组7孔,如图1所示孔内琼脂小心用针头挑出.以防破坏周围琼脂,随后用酒精灯加热封底图1免疫琼脂双向扩散打孔示意图加样:中央孔加待检抗原(见附录C中C.5),不同菌体型特异的抗血清加人周边孔内(以加满不溢出为度感作;加样完毕后.静置10min.然后置带盖湿盒中,在37C恒温培养箱中反应 24h一48h 后观察并判定结果,72h为最终判定时间结果判定;将琼脂板置于暗背景的自然光下或强光照射下观察抗原孔与抗血清孔之间出现清晰沉淀线者为阳性,未出现沉淀线者为阴性所有能引起出血性败血病的血清型菌株均能与2型抗血清反应,与5型抗血清也可能发生交叉反应琼脂凝胶免疫扩散试验也可用于荚膜分型荚膜分型所用的抗原及抗血清与间接血凝法相同(见附录c) 所用琼脂凝胶配成 1%浓度(见附录A中A.5)
GB/T27530一2011 5.3.2.4.3对流免疫电泳试验 5.3.2.4.3.1材料所用材料如下所示 a)荚膜抗原(见附录C) b荚膜型性特异性抗血清(见附录C). 巴比妥缓冲液(见附录A). D 对流免疫电泳介质(见附录A) 0.85%NaCl溶液电泳仪、打孔器微量加样器 5.3.2.4.3.2方法对流免疫电泳试验方法步骤如下所示琼脂玻片的制备:将12mL电泳介质倾注玻板(57mm×70mm),制成厚度为2mm3mm 电泳板打孔琼脂冷却后打孔，一排7孔.孔径4mm,孔间距7mm,按图2所示另外设一排对照 b 组,其组内各孔中心之间的距离为6 挑去孔内琼脂,封底 mm 图2对流免疫电泳试验抗原、抗体加样孔位置图加样;同一组加样孔中,阴极端的孔中加人20l荚膜抗原,同时在阳极端的孔中加等量的抗血清对照组分别用0.85%NaCl溶液与阳性抗血清配对和荚膜抗原与阴性兔血清配对 d)电泳电泳槽加人适量pH8.8巴比妥缓冲液,150V(25V/cm)电泳30min,观察电泳出现的沉淀线结果判定:抗原和抗血清孔之间出现明显的沉淀线者判为阳性,不出现沉淀线者判为阴性 e 5.3.2.5动物接种试验将5.1采集的病料用灭菌0.85%NaC溶液制成110悬液(体腔渗出液可直接用于接种),或用 5%血清肉汤(按照GB/T4789.28一2003中4.74)24h的培养液,皮下或腹腔接种18g一22g健康小鼠 4只8只,每只0.2mL 同时取4只8只清洁级小鼠注射等量无菌0.85%NaCl溶液作为对照隔离饲养观察多杀性巴氏杆菌强毒株多于12h一72h内致死小鼠采集死亡小鼠心血和实质脏器,按 5.2染色镜检,按5.3进行病原分离鉴定确诊当病原学诊断检出多杀性巴氏杆菌时,依据致病特性,结合临床症状和病理变化,即可作出确定诊断
GB/27530?2011 ?A 淶?? ??? A.1?ī??? A.1.1?;?ī? A.1.2;???ī???????,???,??,??? ,???? A.2?(AIsever's? A.2.1? 2. 05g (C,HNa.O5H.O) 80g 0 0.05g (CH,O,H,O) NaCI 0 42g" A.2.2? ????100ml,?,l16C15min A.30.2mol/Lλ?(PB A.3.1? NaH,PO2H,O Nae,HPO12H.O .3.2? A 0.2mol/LNaH,PO,A?)0.2mol/LNa,HPO(B?),??? 0.2mol/Lλ? A?;?NaH,PO2H,O31.2g,????1000mL B?;?NaHPO12H.O71.632g,????1000mL ?A?19.0ml,B?81.0ml???0.2mol/LpH7.4PB ??λ?(??? ?29.24g,?11.70g,0.lmol/180ml,??3L,pH?8. 8. A.5?? ????;?2.0g,?2.06g,??0.37g,??180ml 0.01%20ml
GB/T27530一2011 附录 B 规范性附录培养基的配制 B.1麦康凯琼脂培养基称取适量干粉麦康凯琼脂培养基,按使用说明制作培养平板 B.2酪蛋白-蔗糖-酵母(CSY)琼脂培养基 B.2.1成分水解酪蛋白 3g 蔗糖 3g 酵母浸膏 5g 氯化钠 5g 无水磷酸氢二钾 3g B.2.2制法冷加蒸水至1L,完全溶解后调pH值至7.37.4后加人1.5%琼脂,116C高压灭菌15min 却至45C50时加人5%的犊牛血清并倾注平皿制成平板培养基 B.3鲜血琼脂培养基 B.3.1成分牛肉膏 5g 10g 蛋白腺叙化的 5g 磷酸氢二娜 1.0g 25s 琼脂粉 g 燕僧水 1000ml B.3.2制法先将牛肉膏、蛋白陈、叙化钠和磷酸复二钾溶于蒸僧水,调pH至7.4一7.6,再加人琼脂粉,混匀并高压灭菌后,冷却至50C时加人无菌脱纤家兔鲜血5%,充分混合后倾注平皿制成平板培养基 B.4糖发酵管 B.4.1成分蛋白陈 10g 氯化钠 5g 糖(醇、昔 10g 0.2%的溴香草酚蓝溶液 12ml 蒸僧水 1000ml B.4.2制法各成分加热溶于水中并调pH至7.4,分装试管,116C高压灭菌15min
GB/27530一2011 c 附录规范性附录多杀性巴氏杆菌分型抗原及致敏绵羊红细胞的制备方法 C.1荚膜抗原制备将参考菌株(待检菌株)6h一8h肉汤培养物1ml均匀涂布到csY血液琼脂平皿上(直径 90mm),37C培养过夜用3mL含0.3%甲醛的0.85%NNaCl溶液将生长物洗下,56C加热30minm 后,4C3000g离心15nmin,收集上清液保存在一20备用若没有冷冻离心机,则1500g离心 30min,上清液作为抗原提取物 C.2不同荚膜型特异性抗血清的制备和处理 C.2.1制备将CartorA.B.D.E标准菌株分别接种于csY血液琼脂培养基上.,37C培养18h一20h,用含 0.3%甲醛NaC溶液将生长物洗下,将菌体悬液的浊度调到与布朗氏比浊管的第4管相同每间隔 3d一4d给兔静脉内注射菌液一次,注射量分别为0.2mL,0.5mL、1.0mL、1.5mL及2.0mL 最后 -次注射后1周,取0.5mL相同的活菌悬液，给兔皮下或肌肉接种 10d后采血收集血清,血清保存于一20C,而常用的少量血清可加人硫柳汞至0.01%,4C保存 C.2.2处理用前将1份压积绵羊红细胞加人3份血清中,室温作用30min,离心除去绵羊红细胞,经56C灭活 30min即可 c.3新鲜绵羊红细胞的制备无菌采取绵羊血液,脱纤后,用6倍8倍的0.85%NaCl溶液洗涤3次,每次皆用离心法收集绵羊红细胞(500g),最后一次收集的绵羊红细胞,应恢复到原血量的一半置2C一8C保存,2d内使用致敏绵羊红细胞的制备取3mL荚膜抗原(见附录C中C.1),加人0.2mL洗净的绵羊红细胞(见附录C中C.3),充分混匀,37笔振荡作用2h,离心去上清,再用10ml.0.85%NaCl溶液洗涤一次,离心悬浮于20ml0.85% NaCl溶液,即为1%的致敏绵羊红细胞悬液 C.5菌体抗原制备将细菌接种血液琼脂平板培养24h后,用1mL含0.3%甲醛的8.5%NaCl溶液冲洗并收获生长物悬浮液100C水浴中加热1h,离心弃沉淀,取上清液即为琼脂凝胶免疫扩散试验抗原 C.6菌体分型抗血清的制备 12周龄16周龄公鸡颈中部皮下接种1mL油乳菌苗油乳菌苗制苗菌株选用分离自牛的6;B
GB/T27530一2011 型多杀性巴氏杆菌,制备方法参见《兽药典(2005年版三部)“禽多杀性巴氏杆菌病油乳剂灭活疫苗”),3周后胸部肌肉内再接种1mL(在胸骨的两侧各接种0.5mL) 1周后采血,分离血清,并加0.01%硫柳永或0.06%石炭酸防腐保存出现交叉反应的血清应弃去

牛出血性败血病诊断技术GB/T27530-2011

牛出血性败血病是一种由牛出血性败血病病毒引起的急性、高度传染性、致死率极高的疾病。该病毒分为两型：欧洲型和日本型。目前，我国仍主要流行着欧洲型。

病因

牛出血性败血病病毒属于黄病毒科，病毒颗粒呈球形或椭圆形，直径约40-50nm。感染后，病毒可在体内多种组织和器官中复制繁殖，并破坏宿主免疫系统，导致机体免疫力下降，最终发展成败血症。

临床表现

牛出血性败血病的潜伏期一般为2-10天，病程通常在1-3天内发展至死亡。临床表现主要包括：

体温急剧升高，可达41℃以上；
食欲减退，甚至厌食；
乳汁减少或停产，牛群中多数乳牛同时发病；
呼吸急促，咳嗽，流涕；
眼结膜充血，角膜浑浊；
四肢关节肿胀，行动不便。

诊断技术

针对牛出血性败血病的临床表现，GB/T27530-2011制定了一套诊断标准和方法。该标准包括：病例调查、病原学检查、免疫学检查、临床症状和病理变化等方面。

具体方法如下：

病例调查

对疑似牛出血性败血病的牛进行调查，包括病史、临床表现和死亡情况等。

病原学检查

利用PCR技术或ELISA技术检测牛出血性败血病病毒的基因或抗原。

免疫学检查

采用酶联免疫吸附试验（ELISA）或补体结合试验（CFT）检测血清中的特异性抗体。

临床症状和病理变化

根据牛出血性败血病的临床表现和病理变化进行综合分析，如发现牛出现高热、眼结膜充血、角膜浑浊、四肢关节肿胀等症状，结合病理检查可发现全身多处器官组织有不同程度的出血点、淋巴组织萎缩等特征，则可以初步诊断为牛出血性败血病。

治疗

目前尚无特效药物能够治愈牛出血性败血病。常规治疗措施包括给予抗生素、消炎药和维生素等治疗，并加强对发病牛群的隔离和消毒管理。

预防控制

预防牛出血性败血病的最有效途径是接种疫苗。目前市场上有欧洲型和日本型牛出血性败血病疫苗可供选择。此外，加强养殖环境卫生管理、避免传染源的扩散、定期检查牛只健康情况等也是预防牛出血性败血病的重要措施。

结语

GB/T27530-2011制定的诊断技术为牛出血性败血病的诊断和治疗提供了重要的指导。但在实际操作中，还需结合临床表现、病理检查等多方面因素来进行诊断和治疗。同时，加强预防控制措施，有效防范牛出血性败血病的发生，对于维护养殖业健康发展和保障人民群众食品安全具有重要意义。