结核病病原菌实时荧光PCR检测方法

结核病病原菌实时荧光PCR检测方法

国家标准 GB/T27639一2011 结核病病原菌实时荧光PCR检测方法 Real-timePCRmethodforthedetectionoftubereulosispathogenicorganisms 2011-12-30发布 2012-04-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27639一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口 本标准起草单位;广东出人境检验检疫局、华中农业大学、检验检疫科学研究 院、北京盈九思科技发展有限公司 本标准主要起草人:陈茹、刘中勇、杨国海、郭爱珍、曾碧健、韩雪清、高小博、林祥梅、吴晓薇
GB/T27639一2011 结核病病原菌实时荧光PCR检测方法 范围 本标准规定了结核分枝杆菌复合群,结核分枝杆菌、牛分枝杆菌实时荧光PCR检测方法的技术要 求和操作规范 本标淮适用于快速检测细菌培养物,血样,奶样,痰液,组织器官,粪便等临床样品中结核分枝杆菌 复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌 规范性引用文件 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682一2008分析实验室用水规格和试验方法 GB194892008实验室生物安全通用要求 缩略语 下列缩略语适用于本文件 c值;炎光信号量达到设定的网值时所经历的循环数. dNTP:deoxyribonucleosidetriphosphate,脱氧核苷三磷酸 DMSO;dimethylsulfoxide，二甲基亚碱 EDTA:ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸 PBS: buffersolution,磷酸盐缓冲液 5:phosphate RR;pol Iymerasechainreaction， ,聚合酶链式反应 Taq酶,TaqDNA聚合酶 UG;酶;uracilDNAglycosylase，尿喘DNA糖基化酶 原理 本标淮方法采用了TaqMan探针实时荧光PR技术原理 反应体系中包括一对用于扩增DNA 的引物,和一条能与PCR产物特异杂交的荧光标记探针 探针的5'端标记了被称为报告基团的荧光 素,3'端标记了淬灭基团 在进行PCR延伸反应时,Taq酶的5'外切酶活性将5'端荧光基团从探针上 切割下来,使其与悴灭基团分离,从而仪器能检测到5'端荧光基团所发出的荧光信号，一分子PCR扩 增产物的生成伴随一分子荧光信号的产生 随着扩增循环次数的增加,仪器检测到的荧光信号的累积 反应了扩增产物量的变化 本标准提供特异检测结核分枝杆菌复合群,结核分枝杆菌和牛分枝杆菌共四套实时荧光PCR检测 方法(见表1) 其中,结核分枝杆菌复合群特异的实时荧光PCR方法分别以IS6110,IS1081插人基因 序列为模板设计特异扩增引物与探针;结核分枝杆菌、牛分枝杆菌特异的实时荧光PCR方法分别以菌 种特异的基因组序列为模板设计特异扩增引物与探针
GB/T27639一2011 表1荧光CR引物与探针序列 类别 核酸序列 上游引物;5'GcAGGG;TTcGccTAcGTG3” 结核分枝杆菌复合 下游引物:5'cGGGTCCAGATGGCTTGC3” 群(IS6110 探针";5'-FAM-TGTCACcGACGCCTACGCTCGC3'-BHQ-1 上游引物:5'CCAGGAACGcCTCAACC3” 结核分枝杆菌复合 下游引物;5'CGACGAGGCGGATGATC3 群(IS1081 探针:5'-FAM-AGAGGTACGACGCCGAACCGAC-BHQ！ 上游引物;5'cGGTGTAATcAGTTTTGAAGc3” 结核分枝杆菌 下游引物;5'CGATTGGAAcGGCGAAGC3” 探针";5’-FAM-TAGGTAGTccAGTAGAGccccATAGccA3'-BHQ-1 上游引物:5'AcGcCTTcCTAAcCAGAATTG3’” 牛分枝杆菌 下游引物:5'GGCTATTGACCAGC'TAAGATATCC3” 探针":5'-FAM-AATTCATACAAGCCGTAGTCGTGCAGAA3’-BHHQ- 探针5'端标记的报告荧光基团及3'端标记的淖灭基团可根据荧光cR仪设备等具体情况另行选定 材料与试剂 5.1 仪器与耗材 5.1.1接种棒 1.2无菌注射器或真空采血管 5. 55 1.3灭菌容器 1.4橡胶管 5 5 .1.5刮匙 5.1.6I级生物安全柜 5.1.7荧光PCR仪 5. 1.8恒温水浴锅(室温至100). 5.1.9离心机(最高离心力达15000×以上》. 5. 1.10混匀器 冰箱(2C8C,一20C，-80C). 5.1.12天平(精密度达千分之一以上》. 5. .1.13微量可调移液器(10AL.100pL10o0AL. 55 .1.14微量带滤芯吸嘴(10AL,100L,1000AL) 1.15研钵 5 51.16离心管 5 .1.17PCR光学反应管 5.2试剂 5.2.1试剂级别除另有规定,本方法试验用水应符合GB/T6682一2008规定的二级水,所用化学试
GB/T27639一2011 剂均为分析纯 5.2.2引物与探针;采用无DNA酶,无RNA酶水将每条引物与探针(序列见表1)配制成100mol/L 储存液,置一20或更低温度冻存;使用时取适量配制成10mol/L工作液,避免多次冻融 5.2.30.01mol/儿LpH7.6PBS:配方见A.1 5.2.4柠檬酸钠缓冲液配方见A.2 5.2.50.5mol/LEDTA;配方见A.3. 5.2.6柠檬酸钠-磷酸缓冲液;配方见A.4 .2.7 4%氢氧化钠溶液;配方见A.5 5 5 .2.84%硫酸溶液;配方见A.6 .2.9TrionX-100. 5 5.2.10DNA提取液,含100mmol/几TrisHcCl(pH8.0),0.1%Tritonx-100,2004g/L蛋白酶K 也可采用等效商品化试剂 .2.11灭菌双蒸水 5 5.2.12三氯甲熔 13 5.2. 异丙醇 5.2. 14 无水乙醇 5.2.1570%乙醉用新开启的灭菌双蕉水配制，一20C预冷 5.2.16荧光PCR反应缓冲液;含50mmol/L Kcl,10mmol几 TriHcl(pH8.3),2.5mmol几 MgCl,5%二甲基亚碱(DMsO),5%甘油 可采用等效商品化试剂 5.2.17dNTP:dATP,dUTP,dCTP和dGTP 5.2.18Taq酶 5.2.19UG酶 生物安全要求 采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作,应遵守GB194892008的有关规定 采样 样品采集 7.1.1细菌培养物 直接取液体培养基培养的菌液;对于在固体培养基上生长的菌落,用接种棒挑取适量(取用量达到 肉眼可见,菌团大小不超过接种环)菌样,放到0.01mol/儿LpH7.6PBs中,振荡混匀形成悬浮菌液 7.1.2血样 用无菌注射器或真空采血管,无菌自动物静脉采血,无菌分离血清 用无菌注射器或真空采血管,无菌自动物静脉采血,将血液直接滴人抗凝剂中,并立即连续摇动,充 分混合 抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液,或0.5mol/儿EDTA 每6ml 血液加ml抗凝剂 条件允许时,建议优先采集全血,以更有利于富集菌体 7.1.3奶样 无菌采集奶液于灭菌的容器中 一般以后段奶液含菌量较多,早晨挤出的奶液含菌量最高
GB/27639一2011 7.1.4痰液 动物痰液采集:动物咯痰极少,宜在清晨采集,用橡胶管自口腔伸人至气管内,外接注射器吸取痰 液 亦可取咳出的痰块 人痰液采集;采集清晨从肺深处咳出的痰液 用灭菌容器密闭送检 7.1.5组织器官 采集动物下额、咽后、支气管、肺(特别是肺门及肺门淋巴结)、纵隔和肠系膜淋巴结,以及病变组织 器官如肝,脾、肺等 7.1.6粪便 采集混有粘液、血液、粘膜的粪便,或用刮匙从动物直肠深部(约30cm)取少量粘液粪便,盛于灭菌 容器中 样品的保存和运输 待检样品在2C8C保存不应超过24h;一20C保存不超过三个月;一80C以下长期保存 样 品应置于低温,密封的容器内运输 荧光CR操作方法 8 样品前处理 8.1.1血样、细菌培养物(菌液)前处理 取1ml.~2ml全血样品,15000Xg离心10min,弃上清;加等体积灭菌双蒸水充分振荡,15000× 离心10min;弃上清,若红血球裂解不完全,需采用灭菌双蒸水重复洗涤;收集沉淀物,继续进行核酸提 取,或置一20C贮存备用 取1ml一2mL血清、菌液样品,15000Xg离心10min,弃上清,加1mL0.01mol/儿pH7.6PBS. 充分振荡混匀,l5000×片离心10min;弃上清,收集沉淀物,继续进行核酸提取,或置一20C贮存备用 8.1.2奶样前处理 取10ml奶液,加100lTritonX-100，振荡混匀,2500Xg离心20min;弃上清,取沉淀,加1mL 0.01mol/儿pH7.6PEBS,充分振荡混匀;将沉淀悬浮液移人微量离心管,15000×g离心10min;弃上 清,收集沉淀物,继续进行核酸提取,或置一20C贮存备用 8.1.3痰液前处理 在痰液样品中加人2倍一4倍体积4%氢氧化钠溶液,振荡混匀,室温放置30min,间或振荡混匀 使其充分液化(无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全;若液化不完全,可适当再加人少量 4%氢氧化钠溶液直至液化完全);15000×g离心10min;弃上清,加1mlL.0.01mol/LpH7.6PBS,充 分振荡混匀,l5000×g离心10min,弃上清,重复本步骤1次;收集沉淀物,继续进行核酸提取,或置 -20C贮存备用 8.1.4组织器官前处理 取适量组织样品(剔除脂肪、被膜),剪碎,按1;5的比例加人柠檬酸钠-磷酸缓冲液(例如,l只组织 min10min, 样品,加人5mL缓冲液),充分研磨;加等量4%氢氧化钠溶液,继续研磨5 ,使组织液化
GB/T27639一2011 移人离心管,充分振荡,75C温浴0.5h1h;取上清避免吸取粗渣),15000×g离心10min;弃上清， 加等量0.0mol/LpH7.6PBs,振荡混匀,使沉淀充分悬浮,15000×从离心l0min,弃上清,重复本步 骤1次;收集沉淀物,继续进行核酸提取,或置一20C贮存备用 8.1.5粪样前处理 取粪样1g一2g,按15的比例加人1%碗酸游液(例如l民类样,加5mL液体)充分振荡混匀,室 温静置0.5h1h;取上层约3ml液体(避免吸取粗渣).5000Xg离心1min.取上清，150o0X区离心 10min;弃上清,加等量0.01mol/LpH7.6PBS,振荡混匀,使沉淀充分悬浮,15000×发离心10min,弃 上清,重复本步骤1次;收集沉淀物,继续进行核酸提取,或置一20C贮存备用 8.2核酸提取 在上述已完成前处理的样品(沉淀物)中加人50L100ADNA提取液,充分振荡混匀,56C温 浴301 min,98C100C加热10min,瞬时离心使液滴聚集管底,加等体积三氯甲烧,振荡混匀 12000X 离心5min,取上清,直接用于PCR或贮存于一80笔备用(适用于除粪样外的其他样品) 其 中粪样样品还需进行以下步骤;加人等体积异丙醇(一20C预冷),颠倒混匀,放置5min~10min; 4C，150o0X区离心10min,弃上清,加3倍体积70%乙醉(4C预冷),振荡洗涤;4C,1500Xg离心 10min,弃上清,室温干燥5min;加人50aL无DNA酶,无RNA酶水,混匀,溶解核酸,直接用于CR 或贮存于一80C备用 可采用经验证的商品化核酸提取试剂盒 8. 3 荧光CR扩增反应 8.3.1对照设立 从样品处理开始,应设置阳性对照、阴性对照 阳性对照取已知阳性的同类样品作为阳性对照,也可将适量灭活病原菌添加到已知阴性样品中作 为阳性对照样品 阴性对照;取已知阴性的同类样品作为阴性对照 空白对照;在扩增反应阶段设置 以灭菌双蒸水作为模板设置空白对照 8.3.2扩增试剂准备 采用25nlL反应体系,含以下成分:1ommol/儿Tris-Hcl(pH8.3),50mmol/LKCl,2.5mmol/儿 MgCl,0.2mmol/LdNTP,上、下游引物各0.2Amol/儿L,探针0.lmol/L,5%DMsO,5%甘油,0.4U 尿密唁DNA糖基化酶(UDG酶),lUTaqDNA聚合酶(Taq酶),5A模板 取出荧光PCR反应缓冲液等试剂,室温融化(Taq酶、UG;酶除外),瞬时离心后置冰上,根据上述 体系、按每个反应20AL的用量配制荧光PCR预混反应液,不足部分加灭菌双蒸水补足,需配制的荧光 PCR预混反应液数量等于样品个数加上对照个数再加一 将各试剂按使用量吸取到微量离心管中,充 分混匀,然后在每个PCR光学管中分装20L 8.3.3加模板 在已分装有荧光CR预混反应液的PCR光学管中每管分别加人5AL样品或对照的核酸模板,混 匀,盖上管盖,放人荧光PCR检测仪内,记录样品放置顺序 8.3.4荧光CR扩增反应 min,95C 反应条件设定:第一阶段;50C2 4min,1个循环;第二阶段95C10s,60C45s
GB/T27639一2011 40个循环,荧光收集设置在60C退火延伸时进行 荧光素设定:报告荧光reportdye)设定为FAM(或按探针实际标记的荧光基团设定),淬灭荧光 quenchdye)设定为None,校准荧光(reference eedye)设定为None 可根据不同品牌仪器说明等效设置 参数 分析条件设定和结果判定 阔值设定 综合分析仪器给出的各项结果,基线(baseline)以仪器给出的默认值作为参考,闵值(threshold)设 定原则以阔值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准,具体还需根据仪器噪声情况进行 调整,选择反应所设定的荧光基团对应的通道进行分析 质控 阴性对照和空白对照应无C值,阳性对照的C值应<30,且呈现s型典型扩增曲线 否则,此次 实验视为无效 9.3荧光PCR结果分析及判定 阴性反应结果判定检测结果呈现无Ct值、无扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期,判为荧光 PCR阴性反应 阳性反应结果判定;检测结果呈现C值35、且扩增曲线有明显的对数增长期,判为荧光PCR阳 性反应 对于35GB/T27639?2011 ?A 淶?? ? A.10.01mol/1Lp7.6PBs A?,B? A?(0.2mol/LNaH,PO?);???(NaH,POH,O)27.6g? (NaH,PO2H,O)31.2g,??,1I B?(o.2mol/NaHPO?)???(Na.HPO12H,O)71.6g,? (Na,HPO2H.O)35.6g,??,1L ?17g?,??,?13mLA?87mLB?,,? 2L A.2?? (C;H,O;H.O) 5.3g (Na,CH.O;H,O) 15g (C,HOH.,O) 16.2g ??,??,1L,?(121?2)C/0.1MPa,15min? 4C A.30.5mol/LEDTAp8.0) ?186.1gEDTA,800mL?,??,(Na(OH)pH 8.0,1L,?,(121?2)C/0.1MPa,15min? A.4-?? pH6.8?? A?(0.2mol/L?):?(NaHPO2Hl.O)15.6lg,??? 500mL B?(0.2mol/L?);?(Na,HPO12H.O)35.82g,???? 500ml ??51mLA?49mLB?,?100mlpH6.8?? ?2.84g(Na,C,H,o2H.(o),100mLpH6.8??,?? 121?2)C/0.1MPa,15min?4C
GB/27639?2011 A.54%? ?8?,200ml??,?? A.64%? ?20ml?,500mL??,?档
GB/T27639一2011 附 录 B 规范性附录 检测过程防止交叉污染的措施 B.1采样及样品处理过程,应防止不同样品之间通过器具、手套等的交叉污染 采样及样品处理工具 应经过高压灭菌或高温烘烤处理,一套工具仅限一个样品使用 存放样品的容器应清洗、高压灭菌或高 温烘烤处理,或使用一次性灭菌容器 B.2实验过程,应穿工作服和戴一次性手套,勤换手套,工作服应经常清洗 B.3使用带滤芯吸嘴 吸嘴,离心管,PCR管等应经过高压灭菌处理，一次性使用,不得回收清洗后重 复使用 B.4样品处理与PCR加样应在不同的区域进行,不同区域配备独立的加样工具和用具 该区域可以 是独立的空间间隔、有紫外消毒设施的独立的设备如核酸提取工作站、PCR加样工作站、可密闭进行紫 外消毒的超净工作台,生物安全柜等 若在敞开的空间进行核酸提取或PCR加样,该空间应安装紫外 灯或配备具有等同降解核酸功能的设备如移动紫外灯、带紫外消毒功能的空气消毒净化器等 上述区 域在每次使用后应及时清洁处理,并在使用前后照射紫外30min以上 每个区域应有专门的废弃物容 器,该容器应能耐受煮沸,10%次氯酸钠溶液消毒处理 每次实验结束,应在紫外消毒前,及时清理废弃 物及消毒容器,并将该废弃物容器放回工作区进行紫外消毒 B.5R反应液等试剂应按检测需求分装贮存,避免同一管试剂多次开启使用 B.6装有核酸模板、样品或试剂的离心管在打开之前,应短暂离心,避免离心管崩开,所有操作尽量避 免产生气溶胶 B.7上机运行前,应检查盖紧各PCR管,以防荧光物质或模板泄漏而污染机器 B.8应遵循基因检测实验室其他技术要求

结核病病原菌实时荧光PCR检测方法GB/T27639-2011

结核病是一种严重的传染病，由结核分枝杆菌引起。为了及早发现和诊断结核病，需要对病原菌进行检测。PCR技术是目前常用的病原菌检测技术之一。

GB/T27639-2011是中国国家标准中规定的结核病病原菌实时荧光PCR检测方法。该标准要求采用荧光探针技术，选择IS6110或IS1081基因作为检测靶标，通过实时荧光定量PCR技术，对结核病病原菌进行检测。

该方法具有以下优点：

• 高灵敏度：能够检测到非常低浓度的病原菌DNA。
• 高特异性：主要靶标基因IS6110或IS1081只存在于结核分枝杆菌中。
• 快速和可靠：在2-4小时内就能获得检测结果，并且结果准确可靠。

GB/T27639-2011标准下的结核病病原菌实时荧光PCR检测方法已经在中国被广泛应用。这种方法可以提高结核病的诊断准确率和治疗效果，是一种非常有效的病原菌检测技术。

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