对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)检测PCR法

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)检测PCR法

国家标准 GB/T25878一2010 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒 IHHNV)检测PCR法 reaetion(PCRmethodforinfeetiousypdlermal and Polymeraisechain haematopoietieneerosisvirus(IHNV 2011-01-10发布 2011-06-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T25878一2010 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录 本标准由农业部提出 本标准由全国水产标准化技术委员会归口 本标淮起草单位;水产科学研究院黄海水产研究所,农业部全国水产技术推广总站 本标准主要起草人黄健、杨冰,朱泽闻、宋晓玲、孙喜模、赵红萍,刘莉
GB/T25878一2010 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒 IHHNV)检测PCR法 警告;使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验,本标准并未指出所有可能的安全问题 使用者有责任采取适当的安全和健康措施,并保证符合国家有关法规规定的条件 范围 本标准规定了对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHINV)聚合酶链式反应(PCR)检测方法的 原理、所需试剂和材料、仪器和设备、操作步骤和结果判定 本标准适用于对虾、环境生物、饵料生物和其他各种非生物样品中传染性皮下及造血组织坏死病毒 IHHHNV)的定性检测 不适于对病毒量或感染活性的估测以及宿主感染程度的评估 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 sC/T7202.1一2007斑节对虾杆状病毒诊断规程第1部分;压片显微镜检查法 SC/T7202.2一2007斑节对虾杆状病毒诊断规程第2部分:PCR检测法 原理 3.1对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒及其流行特征 传染性皮下及造血组织坏死病毒infeetioushypodermalandhaematopoieticneerosisvirus， IHHNV)粒子大小为20nm一22nm,是无囊膜二十面体,在氯化绝中的浮力密度为1.40g/mL,含线 状单链DNA,长度为4.1kb,衣壳由4个分子质量分别为74kD、47kD,39kD,37.5kD的多肽组成 IHHNV可感染世界各地的养殖对虾,其感染细角滨对虾(L.itobemaeus stylirostris)会引起急性传 染病和高死亡率(90%),稚虾受到的危害最严重 IHHHNV感染凡纳滨对虾(Liloeaeusuaamei) 会引起慢性“矮小残缺综合症”(RDs),主要影响是患病对虾生长缓慢,畸形,受感染存活对虾终生带毒、 通过垂直和水平传播 3.2技术原理 chainreaction,PCR)是以IHHNV的一段389个碱基(b IHHNv的聚合附链式反应(ymctaeC 长度的特异性DNA序列作为模板,以与模板两端序列互补的一对特异性寡核背酸序列作为引物,在四 种脱氧核糖核苷三磷酸存在下,利用依赖DNA的DNA聚合酶的合成作用,经过数十次变性,退火和延 伸的反应循环,使模板上介于两个引物之间的DNA片段得到特异性地级数扩增,再通过电泳等手段检 测到被特异性扩增的片段,从而揭示微量IHHNVDNA的存在 试剂和材料 所需试剂除引物、阳性对照和阴性对照以外,按照sc/T7202.2一2007中第5章的规定 4.1 4.2100ng/l引物F:5'-CGGAAC-ACA-ACC-CGA-CTT-TA-3',-20C保存 L引物R,5'ccccAAGAccaAAATAcG-AA?',一20七保存 4.3100 ng/! 4 4， 阳性对照为已知IHHNV阳性的组织样品的DNA模板，一20C保存
GB/T25878一2010 4.5阴性对照为已知lHHNV阴性的组织样品的DNA模板，一20C保存 4.6空白对照以无菌双蒸水为模板 仪器和设备 所需仪器设备按照SC/T7202.2一2007中第6章的规定 操作步骤 反应体系的准备 PCR反应体系的准备应在沽净区完成 PCR反应可选择25AL、50L或100L反应体系进行 在CR前区按表1的要求,加人除Taq酶以外的各项试剂,配制成无酶反应预混物 保存于 20C 在临用前,根据所需的反应份数,取出无酶反应预混物,加人相应体积的Taq酶混匀,即成完 全的反应预混物 按1份/支分装到0.2mLPCR管中 如果PCR仪不具备热盖功能,再向各管内加 人50ML液体石蜡 暂存于4C 表1100份CR反应预混物所需试剂组成 试剂 25Al体系 50al体系 100l.体系 试剂终浓度 10×PCR缓冲液(无Mg+ 500Al 250L 1000AL X 氯化钱(25mmol/A1) 200Al 400Al 800L 2.0mmol/L dNTP(10mmol/L 100Al 200Al 400Al 400mol/L 100ng/L引物F 75l 150Al 300l 3ng/Al 300 150 ng/pl引物R 100 石 AL AL 3g/AL 灭菌双燕水 3450nl 1725L 6900aL TaqDNA聚合酶(5U/L 25l 50l 100l 0.05U/al 100份反应总体积 2450Al 4900Al 9800aL 注1，25L体系模板量0.5L/反应管 注2，50L体系模板量1AL/反应管 注3:100L体系模板量2L/反应管 6.2样品准备 样品的处理应在样品区完成 样品采集的要求按sc/T7202.1一2007中附录B的规定执行 6.2.3活体或冰冻幼体、仔虾及体长在3cm以下稚虾个体样品约5mg100mg(去掉稚虾眼) 活体 或冰冻的虾飓、胃、游泳足或步足样品约5nmg100mg 活体或冰冻饵料生物样品约5mg100mg 池底表土样品约500mg 将上述待检样品放人灭菌1.5mL微型离心管中,应避免各样品间的交叉污 染 所有非一次性使用的样品处理工具要经清洗,然后浸于新配制的有效氯含量为3.0×10-的含氧 消毒剂中5min,经无PCR产物污染的自来水充分清洗,再经蒸馏水淋洗后方可用于下一个样品 6.3DNA的提取 按照SC/T7202.2一2007中7.1.3的规定执行 6.4PCR扩增 6 .4.1在PCR前区,按照表1对各反应体系所需的模板体积要求,向各支含有1份反应预混物的PCR 管内加人相应体积的各样品DNA提取液,并设阳性对照、阴性对照和空白对照 6.4.2将上述加有样品模板的PCR管带人PCR后区,置于PCR仪中按以下程序进行扩增:95C
GB/T25878一2010 5 mn;95C30s.55C30s、721min.35个循环,72C延伸了min.最后4C保温 准备进行产物 的电泳 6.5CR产物电泳 按照sC/T7202.2一2007中7.1.5~7.1.8的规定执行 结果判定 阳性对照和阳性样品在389bp处应有一条特定条带出现;阴性对照和阴性样品在389bp处应无 条带出现,空白对照不出现任何条带 阳性对照在389bp处无特定条带出现或阴性对照在389bp处 有条带出现都表明PCR失败,应在排除故障和清除污染后,重新取样检测 对虾传染性皮下及造血组 织坏死病毒(IHHNV)PCR检测产物序列参见附录A 7.2条带的党暗表示扩增产物浓度的多少,但并不对应于模板的量的多少 阳性结果表明被检样晶中存在IHnNVDNA 对活虾和敏感宿主而言,提示已受IHHV感染; 对冰鲜或冰冻对虾而言,提示曾受到IHHNV感染 电泳结果的分析和问题排除方法参见附录B. 7.4
GB/T25878一2010 附 录A 资料性附录 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(INV)聚合酶链式反应(PCR)检测产物序列 GAGGAGAGAGCTGTAGTAGCGGAACACAACCCGACTATTGAAGGGACTCCCAACGGAC 61 CGGACGAAATGGACGGAAGGcGACrGGAAGAGAGIGAGATGATAAACAAGIGGAAAGT 121 CAACATGGTACACC'TTCGTCATCAGAGAAAAACCACAACCAAGAAGAC'TC TCCGGACGAA 181 CGCCAAACTTCACCAT"TACAGATCATGGTGACCACIGGCACATCACATAC TCCGGACACC 241 CAACCAATAAGACCAGACATAGAGCTACAATCCTCGCCTA "TGGGAGTTACCTGCTG 301 CCAGAGCCGAAGCTGAAGCGACTACGGTACTTGTTAGAAATATCAAGAGATGGATACICT ATCTATCAGATAcGGTATGAAcGGCTcGTAGGTCTGGcCACGCCAT 361 R 图A.1对虾IINVCR检测产物序列
GB/I25878一2010 附 录 B 资料性附录 对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IN)聚合酶链式 反应(CR)检测电泳结果分析和问题排除方法 表B.1对虾IHVCR检测电泳结果分析和问题排除方法 试验结果 结果判读及原因分析 问题排除 对虾样品 阳性对照和阳性样品 在389bp处有条带,阴性对1.PCR反应正常,结果有效 照和空白对照无389 bp 条带 阳性对照有条带,但分 分子质量标准失效或加样量 更换分子质量标准或增加其加样量 子质量标准没有影像 太少 检查并更换PCR反应所用试剂以及PCR程序 PCR反应失败 分子质量标准有影像 是否正确 但阳性对照无条带 阳性对照失效 更换阳性对照,重新实验 清洗微量移液器,只能用CR后区的微量移液 微量移液器污染 器取反应产物 2. 试剂污染 更换试剂 阴性对照或空白对照 清洁实验室及所用仪器设备,见sc/T7202.2 在389p处有条带出现 3. 环境污染 2007中的附录B 禁止从PCR后区到PCR前区的交流,加强操 操作污染 4. 作隔离 检查提取DNA所用试剂情况,重新试验,确认 DNA提取失败或降解 阳性对照和阴性对照 样品新鲜程度 组正常,但已知带毒样品无 2. 将样品稀释10倍以上 DNA浓度过高 条带 PCR抑制物介人 稀释样品10倍以上,或重新提取DNA 做好热启动操作 样品先要加到PCR管盖上 未注意热启动操作,使PCR 反应预混物预热后,短暂离心(I s)以混人样 s2 分子质量标准正常,但出现非特异性扩增 品,迅速放回预热PCR仪中 阳性对照、阴性对照和样品 出现较多杂带或明显的弥 2？. 酶活性、dNTP浓度或Mg 确认预混物制备的准确性、试剂质量,对不同 散区 浓度差异 批次的酶重新测定最佳Mg离子浓度 3. 温度控制异常 检查PCR仪是否复性温度过低 紫外观察仪故障 检查紫外观察仪 凝胶上无任何影像,包 减少澳化乙锭(EB'用量,将琼脂糖凝胶置于 括DNA分子质量标准 背景发红太亮 清水中30min后再观察结果
GB/T25878一2010 表B.1续 试验结果 结果判读及原因分析 问题排除 凝胶太厚 重新制作琼脂糖凝胶片 凝胶上无任何影像,包 电极颠倒或电泳时间过长 改正电极方向,重新加样电泳 括DNA分子质量标准 澳化乙锭(EB)分解失效 重新配制澳化乙锭(EB) 澳化乙绽(EB)有毒,试剂的操作和废弃物的处理按sc/T7202.2一2007中附录B的规定执行