柑桔黄龙病菌的检疫检测与鉴定

柑桔黄龙病菌的检疫检测与鉴定

国家标准 GB/T29393一2012 柑桔黄龙病菌的检疫检测与鉴定 DeteetionandidentificationofCandidatusliberobacterasiatieumn 2012-12-31发布 2013-03-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T29393一2012 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位;全国农业技术推广服务中心,浙江省植物保护检疫局 本标准主要起草人:吴立峰、严铁、林云彪、项宇,朱景全,朱莉
GB/T29393一2012 柑桔黄龙病菌的检疫检测与鉴定 范围 本标准规定了柑桔黄龙病菌亚洲种Candidausliberobacerasiaticum oueixetal.的检测与鉴 jagO 定方法 本标准适用于植物检疫过程中对柑桔黄龙病菌亚洲种的检测与鉴定 病菌基本信息 中文名;柑桔黄龙病菌 学名:Candidatusliberobacterasiaticum etal jagoueIx 病害英文名;CitrusHuanglongbingHIB 属薄壁菌门Graciliceutes、,韧皮部杆菌属Liberohace 方法原理 根据柑枯黄龙糊菌侵染柑枯植林发稍典狠症状进行田间整定;经嫁接或经柑枯木跟(DapMwrina eir)传稍后,可根据木本指示植物发梢症状鉴定;聚合酶链反应(Poyme eraseChainReaction,PCR)检 测技术对柑枯黄龙病菌DNA进行体外扩增,可得到快迷、有效的鉴定结果 仪器及用具 紫外线透射仪或凝胶成像系统,离心机,核酸电泳仪,pH计,移液器，10L、20L、100L L,PCR仪,水浴器,超纯水系统,电子天平 1000 试剂与材料 TAE缓冲液,三(羚甲基)氨基甲烧-盐酸(TrisHCl).乙二胶四乙酸(EDTA),十二烧基硫酸纳 SDS),乙酸钠纳(NaAe),Taq酶,10×PCR缓冲液,25mmolL镁离子(Mg*),20mmol/I脱氧核苷三 磷酸(dNTP),5ALDNA荧光染料(GV),琼脂糖,澳酚蓝,高缸酸钾,三氯甲烧氯仿),异戊醇,异丙醇 乙醉 症状识别法 柑桔黄龙病主要鉴定依据是田间出现的“叶片斑驳型黄化”和“黄梢” 叶片斑驳型黄化即叶片转绿 后从主、侧脉附近和叶片基部开始黄化,黄化部分扩展形成黄绿相间分布不均的斑驳,后来可以全叶黄 化 黄梢即在发病初期,绿色树冠上少部分新梢枝叶片黄化 有些柑桔结果树果实呈“红鼻子果” 在 柑桔黄龙病区符合上述典型症状的病苗、病树可直接鉴定为柑桔黄龙病 对难以下结论的疑似病苗、病树,可根据具体情况选用以下一种或几种检测方法进行鉴定
GB/T29393一2012 指示植物鉴定法 指示植物鉴定柑桔接穗带菌 以碰柑作指示植物 鉴定时用带有23个病芽的接穗,在健康碰柑实生苗上进行嫁接 重复3次 嫁接工具每次使用前用高缸酸钾溶液消毒) 待嫁接愈合后,在其上方约1cm处剪除指示植物的主 干 每株疑似病株至少嫁接30株以上健康桃柑,以健康桠柑实生苗作对照,定期观察、记载指示植物新 抽枝叶的症状 一般柑精黄龙病在指示植物上的潜育期为4一12个月 符合第6章所描述的发病症状 可鉴定为柑桔黄龙病 7.2指示植物鉴定柑桔木虱带菌 从田间疑似病株上,采集柑桔木虱成虫50~100头,接到指示植物桠柑上饲养,定期观察,记载指示 符合第6章描述的发病症状可鉴定接种柑枯木虱带有柑枯黄龙病菌 植物症状 PCR检测法 8.1取样 取样包括疑似柑桔黄龙病叶片和柑桔木虱成虫二类 采集疑似柑桔黄龙病叶每样品20张叶片,直 接放于信封内(切忌塑料袋包装) 采集无病树和病树枝梢上柑桔木虱成虫每样品50一100头,置于 70%乙醇内浸泡2h一3h,然后取出放于塑料管内,供检测 样品可放人4C冰箱保存 将取样情况填人《植物有害生物调查抽样记录表见附录A 8.2方法 按附录B的规定进行 8.3结果及判定 每次扩增反应均设空白对照,来源可靠的阳性对照和不含病原DNA的阴性对照各1个,每个样品 均进行3次重复 如果阳性对照电泳后出现一条563bp特异性条带,阴性对照和空白对照电泳后没有 条带,试验结果成立,否则,结果不成立 在试验结果成立的前提下,供试样品出现与阳性对照一样的条带,样品判定为阳性,即检出柑桔黄 龙病菌;供试样品未出现与阳性对照一样的条带,样品判定为阴性,即不带柑桔黄龙病菌 记录与档案 将检测结果填人表格《植物有害生物样本鉴定报告见附录C),将检测的有关数据、图片等资料整 理保存 标本保存 1 柑桔叶片放人4C冰箱保存和柑桔木虱浸70%乙醇保存
GB/T29393一2012 附 录A 规范性附录 植物有害生物调查抽样记录表 表A.1植物有害生物调查抽样记录表 编号 生产:/经营者 地址及邮编 联系/负责人 联系电话 抽样地点 调查日期 样品 品种 调查代表 植物名称(中文名和学名 植物生育期 植物来源 编号 名称 株数或面积 症状描述 发生与防控情况及原因 抽样方法,部位和抽样比例: 备注: 抽样单位(盖章). 生产/经营者 填表人(签名). 现场负责人 年 年月 日 月 S 注:本单一式两联,第一联抽样单位存档,第二联交受检单位
GB/T29393一2012 附 录 B 规范性附录 柑桔黄龙病菌CR检测程序 B.1病原物的提纯 B.1.1碱裂解法 将待检柑枯木虱成虫5一10头放人200L管中或待检叶片取叶脉0.5其勇碎后放人研钵,加人 nmol/LEDTA(pH&.0),浸设即可,磨醉;600r/min离心3min,取上请液 50mmol/LTris-HCl,10mm 加人等体积0.2molLNoH十1%s1S.摇匀,冰浴放置10mi;加人等上请液体积NaAc(oHA.8一 5.2),摇匀,冰浴10nin;14000r/min离心5min,取上清液加人2~2.5倍无水乙醇,一2030min, 4000r/min离心15min,沉淀用75%、95%乙醉各洗一次,吹干,磷酸缓冲液(PE)溶解 B.1.2CTAB法 将待检柑枯木虱成虫或柑桔叶片取叶脉研磨成粉末状的干物质加人400预冷的cTABI提取 缓冲液(100mmol/儿Tris-HCl，10mmol/1 EDTA，700mmol/儿LNaCl，pH8.0)中 加人500 4心 65C预热的CTAB提取缓冲液(2%CTAB，50mmol/LTis-HCI,10mmol/儿EDTA，800mmol/儿L 其间不时轻缓颠倒混匀 待冷至室温后加人450L氯仿/异 NaCl，pH8.0)混匀,65C保温120min. 戊醉,轻缓颠倒混匀至溶液呈乳浊状 12000r/min离心2min至分相 将上清液转移至干净的离心 管中,加人5ALRNaseA储液,37C下保温30min 依次加人600L异丙醇及60AlL乙酸钠溶液,轻 缓颠倒混匀 12000 r/min离心1o 沉淀DNA 弃上清液后，加人800n L 70%乙醇 mln， min,沉 12000r/min离心10min 1,弃上清液后,再加人100L70%乙醇洗涤沉淀,12000r/min离心5 淀DNA,除去残留的乙醉 DNA沉淀溶解于100MLTE缓冲液中,4C保存备用 B.2检测体系 柑桔黄龙病菌PCR检测体系见表B.1,体系总体积25ML/管 表B.1柑桔黄龙病菌PCR检测体系 每管加人量 检测试剂 浓 度 拉l 10×PCR缓冲液 2.5 25mmolMg(Cl 2.5mmol 1.75 10mmoldNTP 0.2mmol 2.5 0mol引物HLBP 0.2 0,5mol 0.2 0pmol引物HL.BP2 0. )5口pmal 1U/25Al 0.2 5U/4l TDNA果合 模板DNA 0.4一1.04g ddH.O 2.65 总体积 25
GB/T29393一2012 B.3PCR扩增 PCR引物和反应条件见表B.2,用引物P1,P2进行扩增 表B.2CR引物和反应条件 柑桔黄龙病菌 原 病 P TcTGTTTTcTTcGAG(G;TTG;GTGA 引物 P2 AcCcGCAAGACTccTTAcCAGGAAG 预变性 94C预变性2min 扩增 94变性30s,60退火1min,72延伸1minm PCR反应条件 循环数 35 72C延伸10min 后延伸 B.4琼脂糖凝胶电泳 在100mTAE电泳缓冲液中加人1g琼脂糖,加热融化后加人5ALDNA荧光染料(GV)制备凝 胶,凝固后进行电泳 8AL扩增产物加人2l上样缓冲液,混匀后加人上样孔,80V恒压电泳，当澳 盼蓝条带移动到距凝胶前沿约2cnm时,停止电泳,紫外线透射检测 B.5凝胶成像观察与记录 取出琼脂糖凝胶放人凝胶成像系统观察,拍摄样品DNA扩增条带,记录观察结果,电子文档存档 备查
GB/T29393一2012 附 录 c 规范性附录 植物有害生物样本鉴定报告 表c.1植物有害生物样本鉴定报告 编号 植物名称 品种名称 样品数量 取样部位 植物生育期 样品来源 送检日期 送检人 送检单位 联系电话 检测鉴定方法 检测鉴定结果 备注 鉴定人(签名). 审核人(签名) 鉴定单位盖章: 年 注:本单一式三份,检测单位、受检单位和检疫机构各一份

柑桔黄龙病菌的检疫检测与鉴定GB/T29393-2012

柑桔黄龙病是一种由柑桔黄龙病菌引起的严重病害，主要危害柑桔类植物，如柑橘、柚子、枸杞等。该病菌能够通过风、水、昆虫等途径传播，对于柑桔产业造成了巨大的经济损失。

为了防止柑桔黄龙病的扩散，国家制定了严格的检疫检测标准GB/T29393-2012。该标准规定了柑桔黄龙病菌的检测方法和鉴定标准，包括样品采集、处理、PCR扩增、电泳分析等环节。

具体来说，柑桔黄龙病的检测需要采集植物样品，包括叶片、茎、根等部位。采样时要选择有病征的部位，并注意避免受到污染。采集的样品要立即送到专业实验室进行分析处理。

在实验室中，需要对样品进行提取、PCR扩增、电泳分析等步骤。其中PCR扩增是最关键的环节之一，该步骤能够快速、高效地检测出样品中是否含有柑桔黄龙病菌的DNA序列。

针对PCR扩增结果，需要进行电泳分析，以确定扩增产物的大小和数量。通过对扩增产物的分析，可以判断样品中是否存在柑桔黄龙病菌。

总之，柑桔黄龙病的检测与鉴定是一个非常严谨的过程，需要专业实验室和专业人员进行操作。只有遵循标准GB/T29393-2012的规定，才能保证检测结果的准确性和可靠性。

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