蜂蜜中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮代谢物残留量的测定方法液湘色谱--串联质谱法

蜂蜜中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮代谢物残留量的测定方法液湘色谱--串联质谱法

国家标准 GB/T18932.24一2005 蜂蜜中肤喃它酮、喃西林、味喃妥因和 味喃陛酮代谢物残留量的测定方法 液相色谱-串联质谱法 Methodforthedeterminationofthemetaboliteresiduesoffuraltadon nitrofurazone，nitrofurantoinandfurazolidoneinhoney- Liquidchromatography- -tandemmassspeectrometrymethod 2005-02-04发布 2005-08-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T18932.24一2005 蜂蜜中吠喃它酮、咔喃西林、喃妥因和 砝喃酮代谢物残留量的测定方法 液相色谱-串联质谱法 范围 GB/T18932的本部分规定了蜂蜜中吠喃它酮的代谢物5-甲基吗琳-3-氨基-2-陛婉基酮、吠喃西林 的代谢物氨基躲、吠喃妥因的代谢物1-氨基-2-内酰躲和吠喃陛酮的代谢物3-氨基-2-陛烧基酮残留量液 相色谱-串联质谱的测定方法 本部分适用于蜂蜜中5-甲基吗啾-3-氨基-2-幽烧基酮、氨基躲、1-氨基-2-内酰脉,3-氨基-2-幽婉基雨 残留量的测定 本部分的方法检出限;5-甲基吗咻-3-氨基-2-幽婉基酮和3-氨基-2-瞠婉基酮为0.2ug/kg;氨基腺和 1-氨基-2-内酷脉为0.54g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过GB/T18932的本部分的引用而成为本部分的条款 凡是注日期的引用文 件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本 部分 GB/T6379测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准测试方法的重复性和再现性(GB/T 63791986,neqISO5725:1981 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一1992,neqIsO3696:1987) 原理 试样中残留的硝基吠喃类抗生素代谢物在酸性条件下用2-硝基苯甲醛衍生化,用OasisHLB或相 当的固相萃取柱净化 电喷雾离子化液相色谱-串联质谱检测,外标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 甲醇色谱纯 4.2乙睛;色谱纯 4.3乙酸乙酯;色谱纯 磷酸氢二钾;优级纯 4.5乙酸;优级纯 二甲亚讽;优级纯 盐酸优级纯 4.8氢氧化钠:优级纯 4.92-硝基苯甲醛(2-NP);含量>99% 4.10磷酸氢二钾溶液;0.1nmol/L 称取I7 4g磷酸氢二伴(4.4),用水溶解,定容至1000nl 4.11盐酸:0.2mol/L 量取17mL浓盐酸(4.7)用水定容至1000 ml
GB/T18932.24一2005 4.12氢氧化钠溶液lmol/L 称取40g氢氧化钠(4.8),用水溶解,定容至1000ml 4 13衍生剂;含2-硝基苯甲醛0.05mol/L 称取0.075g2-硝基苯甲醛(4.9)溶于10mL二甲亚碱 (4.6),现用现配 4.14样品定容溶液:乙睛(4.2)+0.4%乙酸(4.5)水溶液(19) 4.15OasisHLB固相萃取柱或相当者:60mg,3ml 使用前分别用5ml甲醇(4.1)和10ml水预 处理,保持柱体湿润 4.160.45pm滤膜 4.175-甲基吗啾-3-氨基-2-陛炕基酮、氨基脉、1-氨基-2-内酰脉和3-氨基-2-陛炕基酮标准物质:纯度 >99% 4.185-甲基吗琳-3-氨基-2-陛炕基酮、氨基脉、1-氨基-2-内酰脉和3-氨基-2-幽炕基酮标准储备溶液 1.0 nmg/mL.称取适量的四种硝基吠喃代谢物标准物质(4.17),分别用甲醉配成1.0mg/mL的标准储 备液 储备液避光贮存在一18C冰柜中,保存期为三个月 4.195-甲基吗啾-3-氨基-2-陛烧基酮、氨基脉、1-氨基-2-内酰脉和3-氨基-2-陛烧基酮混合标准工作溶 液;l.0g/ml 吸取适量四种硝基吠喃代谢物的标准储备溶液(4.18),用甲醇配成1.04g/ml的混 合标准工作溶液,标准工作溶液避光贮存在一18C冰柜中,保存期为三个月,使用前回温到室温 4.205-甲基吗啾-3-氨基-2-陛婉基酮、氨基脉、1-氨基-2-内酰脉和3-氨基-2-陛婉基酮混合基质标准校 准溶液;称取七个蜂蜜空白样品(称样量为4g)于50ml棕色离心管中,其中六个空白样品中分别加人 适量四种硝基吠喃代谢物的混合标准工作溶液(4.19),按照样品操作步骤同步操作 使最终样液中 5-甲基吗琳-3-氨基-2-陛烧基酮和3-氨基-2-陛婉烧基酮的浓度均分别为0ng/ml.0.5ng/mL 1.0ng/mL,2.0ng/mL,5.0ng/mL,10.0ng/mL.,20.0ng/mL;氨基脉、1-氨基-2-内酰脉的浓度均分别 为0ng/ml,1.0ng/ml,2.0ng/ml,5.0ng/ml,l0.0ng/ml,20.0ng/ml,50.0ng/ml作为基质标 准校准溶液,该基质标准校准溶液即配即用 仪器 5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪,配有电喷雾离子源 5. 2 分析天平;感量0.1mg和0.01g各一台 5.3液体混匀器 5.4固相萃取装置 5.5氮气吹干仪 5 恒温箱 5.7真空暴真空度应述到kPN 5.8微量注射器,25L.100L 5.9棕色具塞离心管;25ml,50mL 5. .10pH计;测量精度士0.02 5.11贮液器;50mL 试样的制备与保存 6.1试样的制备 对无结品的实验室样品,将其搅拌均匀 对有结品的样品,在密闭情况下,置于不超过60C的水浴 中温热,振荡,待样品全部融化后搅匀,迅速冷却至室温 分出0.5kg作为试样 制备好的试样置于样 品瓶中,密封,并做上标记. 2 试样保存 6. 将试样于常温下保存
GB/T18932.24一2005 测定步骤 7.1水解和衍生化 称取4段试样(精确到0.01g)于50nml棕色离心管中(5.9),加人5nmL.0.2nmol/L盐酸溶液 4.11)和0.15mL衍生剂(4.13),涡旋混合1min,置于37C恒温箱(G.6)中保持16h. 7.2净化 将上述衍生溶液(7.1)取出放置至室温,加人3ml0.1mol/L磷酸氢二钾溶液(4.10),用1mol/L 氢氧化钠溶液(4.12)调节溶液pH约7.4,倒人下接OasisHLB固相萃取柱(4.15)的贮液器(5.ll)中 在固相萃取装置(5.4)上使样液以小于2mL/min的流速通过OasisHLB柱,待样液全部通过固相萃取 柱后用6mL.水洗固相萃取柱,弃去全部流出液 用真空泵(5.7)在65kPa负压下抽干OasisHLB固 相萃取柱10min 再用4mL乙酸乙酯(4.3)洗脱被测物,洗脱液全部收集于25mL棕色离心管中,并 在氮气吹干仪(5.5)上40C水浴吹干,1ml样品定容液( 4 1 定容 定容液混匀后过0.45m滤膜 4.16),滤液供液相色谱-串联质谱测定 7.3测定 7.3.1液相色谱条件 色谱柱;ZORBAXSBC183.5um,150mm×2.1nmm(内径)或相当者; a b)柱温:30C c 进样量:40L; d 流动相及流速见表1 表1液相色谱梯度洗脱条件 w.扬乙股求济液% 乙睛(% 时间/min 流速/Al/min) 0.00 200 70 30 70 3,00 200 30 3,01 20 8o 200 20 8,00 200 8o 8.01 200 70 30 15.00 200 70 30 7.3.2质谱条件 离子源;电喷雾离子源(ESI); aa b)扫描方式;正离子扫描 检测方式:多反应监测(MRM); c 电喷雾电压(IS):5500V; d 雾化气(NEB)压力;0.076MPa; e 气帘气(cUR)压力:0.069MPa; 碰撞气(CAD压力:0.030MPa; g 辅助气(AUX)流速:7L/min; 辅助气温度(TEM):500C; 聚焦电压(FP);200V; kk 碰撞室出口电压(CXP);l1V; Ql,Q3均为单位分辨率(UNIT); 定性离子对、定量离子对、采集时间(Dwell),去簇电压(DP)及碰撞能量(CE)见表2. m
GB/T18932.24一2005 表2四种硝基肤喃代谢物的质谱参数 定性离子对 定量离子对 采集时间 去簇电压 碰撞能量 硝基肤喃代谢物名称 m/2) m/2) mms 5-甲基吗啾3-氨基-2-幽烧基 335/291;335/128 335/291 100 60 32;18 酮衍生物 氨基脉衔生物 209/192;209/166 209/166 200 55 1715 249/134;249/178 249/134 22;19 -氨基-2-内酰腺行生物 200 70 236/134;236/192 236/134 100 65 19;20 3-氨基-2-陛烧基阴衍生物 7.3.3液相色谱-串联质谱测定 7.3.3.1定性测定 在相同试验条件下,样品中待测物质与同时检测的基质标准具有相同的保留时间,并且所选择的离 子相对丰度比相一致.则可判定为样品中存在该残留 四种硝基味喃代谢物的参考保留时间和离子相 对丰度比见表3 表3四种硝基味喃代谢物参考保留时间和离子相对丰度比 定性离子对7 离子相对丰度比 保留时间 硝基吠喃代谢物名称 % m/z min 5-甲基吗啾-3-氨基-2-陛炕基酮行生物 335/291;335/128 l00;53 2.84 氨基脉行生物 209/192;209/166 93;l00 4.40 1-氨基-2-内酰脉衍生物 249/134;249/178 l00;40 4.92 236/134;236/192 3-氨基-2-陛熔基酮衍生物 l00;12 6.82 7.3.3.2定量测定 在仪器最佳工作条件下,对四种硝基吠喃代谢物的混合基质标准校准溶液(4.20)分别进样以峰面 积为纵坐标,混合基质校准溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线,用标准工作曲线对样品进行定量样 品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内 四种硝基吠喃代谢物的标准物质总离子流图 参见图A.1 四种硝基峡喃代谢物的添加浓度及其平均回收率的试验数据参见表B.1 平行试验 按以上步骤,对同一试样进行平行试验测定 7.5空白试验 除不称取试样外,均按上述步骤同时完成空白试验 结果计算 结果按(1)式计算 1000 Y X= C 1000 77 式中 X 试样中被测组分残留量,单位为微克每千克(4g/kg); 从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度,单位为纳克每毫升(ng/ml), 样品溶液最终定容体积,单位为毫升(mL). 样品溶液所代表最终试样的质量,单位为克(g). 注;计算结果应扣除空白值
GB/T18932.24一2005 精密度 本部分的精密度数据是按照GB/T6379的规定确定的,重复性和再现性的值以95%的可信度来 计算 9.1重复性 在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r),蜂蜜中四种硝基峡喃 代谢物的含量范围及重复性方程见表4 如果差值超过重复性限,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 9.2再现性 在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R),蜂蜜中四种硝基吠喃 代谢物的含量范围及再现性方程见表4 表4含量范围及重复性和再现性方程 含量范围 硝基吠喃代谢物名称 重复性限r" 再现性R 4g/kg 5-甲基吗啾-3-氨基 0.24 lgr=0.9656lgm-1.0897 lgR=0.9625lgm-0.7128 -2-哗熔基酮 氨基脉 gR=0.9152lg朋一0.6513 0.510 lgr=0.9660lgm一1.1445 -1.0935 R=0.2058朋十0.0119 1氨基-2-内酰脉 0.510 0.9844lg从一 gr r=0.0735m十0.0016 -0.7982 8-氨基-2-陛炕基阴 0.2 gR=1.0813" lgm 注:m为两次测定结果的算术平均值
GB/T18932.24一2005 附 录A 资料性附录 四种硝基吠喃代谢物标准物质总离子流图 四种硝基砝喃代谢物标准物质总离子流图见图A.1 2.84 1.5e5 1.4e5 1.2e5 !.0e5 6.82 8.0e4 4.40 6.0e4 4.92 4.0e4 2.Oe4 1.98 0.0 101/min 2.84min为5-甲基吗啾-3-氨基-2-陛婉基削; ..40min为氨基孵; 4 4.92min为1-氨基-2-内酰脉 .82min为3-氨基-2-睡烧基削 图A.1四种硝基味喃代谢物标准物质总离子流图
GB/T18932.24一2005 附录B 资料性附录 回 收率 本方法中四种硝基吠喃代谢物的添加浓度及其平均回收率的试验数据见表B.1 表B.1四种硝基味喃代谢物的添加浓度及其平均回收率的试验数据 硝基映喃代谢物名称 添加浓度/g/kg) 回收率/(% 0.2 96.7 93.0 0.4 5-甲基吗啾-3-氨基-2-陛婉基酮 90.9 89.5 0.5 96.4 93.3 1.0 氨基脉 5.0 88.7 10 88.9 97.5 0,5 1.0 93.8 1-氨基-2-内酰脉 91.9 5.0 10 87.3 0.2 92.9 0.4 92.6 3-氮基-2-陛炕基削 89,6 88.