GB/T38502-2020
消毒剂实验室杀菌效果检验方法
Testmethodforbactericidaleffectofdisinfectantinlaboratory
- 中国标准分类号（CCS）C50
- 国际标准分类号（ICS）11.080
- 实施日期2020-10-01
- 文件格式PDF
- 文本页数23页
- 文件大小1.93M
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消毒剂实验室杀菌效果检验方法
国家标准 GB/T38502一2020 消毒剂实验室杀菌效果检验方法 Iestmethodftorbaeterieidaleffeetofdisinfectantinlaboratory 2020-03-06发布 2020-10-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/38502一2020 目 次 前言 范围 2 规范性引用文件 术语和定义 基本要求 4.1实验室及人员要求 4.2消毒试验要求 消毒与灭菌效果试验方法 5.1细菌悬液与菌片的制备 5.2活菌培养计数技术 5.3 残留消毒剂《化学因子)的去除方法 5.4中和剂鉴定试验 5.5过滤冲洗法去除残留消毒剂试验 5.6细菌杀灭试验 l0 12 5.7分枝杆菌杀灭试验 5.8真菌杀灭试验 14 5.9消毒剂杀菌作用影响因素试验 15 附录A规范性附录)实验室及人员要求 17 附录B(规范性附录)试剂 -------- 18
GB/38502一2020 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由国家卫生健康委员会提出并归口 本标准起草单位:疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、解放军疾病预防控制所、江 苏省疾病预防控制中心,湖南省疾病预防控制中心,山东省疾病预防控制中心、黑龙江省疾病预防控制 中心、福建省疾病预防控制中心 本标准主要起草人:张流波、李新武、姚楚水、张文福、吴晓松、陈贵秋、杨彬、林玲、林立旺、李涛、 赵斌秀、沈瑾、段弘扬
GB/T38502一2020 消毒剂实验室杀菌效果检验方法 范围 本标准规定了消毒剂实验室杀菌效果检验的术语和定义,基本要求以及消毒与灭菌效果试验方法 本标准适用于各种消毒剂实验室杀菌效果的检验和评价
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件
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GB19489实验室生物安全通用要求 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件
3.1 消毒剂disinfeectant 用于杀灭传播媒介上的微生物使其达到消毒或灭菌要求的制剂
3.2 中和剂neutralizer 在微生物杀灭试验中,用以消除试验微生物与消毒剂的混悬液中和微生物表面上残留的消毒剂,使 其失去对微生物抑制和杀灭作用的试剂
3.3 中和产物produetofneutraizatonm 中和剂与消毒剂作用后的产物
3.4 菌落形成单位coonyformingunit;CFU 在活菌培养计数时由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落,以 其表达活菌的数量
3.5 杀灭对数值kilinglogvalue 消毒前后微生物减少的对数值
3.6 载体carrier 试验微生物的支持物 基本要求 4.1实验室及人员要求 实验室及人员要求见附录A
GB/T38502一2020 4.2消毒试验要求 4.2.1检测要求 检测要求包括以下几点: a 实验室试验以悬液定量试验为主,试验应重复3次
对不适宜用悬液定量试验评价的消毒剂 如黏稠的消毒剂、冲洗用消毒剂和原液使用的消毒剂等的实验室试验可用载体定量试验,试验 应重复3次
无特殊要求的情况下,载体定量试验以布片为载体,用途单一、明确的可以选用 对应的玻璃片、,不锈钢片、滤纸片等
评价消毒剂的实验室试验,消毒剂试验浓度应用产品说明书规定的该消毒剂对某一有代表性 b 消毒对象的最低使用浓度
试验设3个不同作用时间,原则上第一时间为说明书规定的最短 作用时间的0.5倍,第二时间为最短作用时间,第三时间为最短作用时间的1.5倍
对多用途的消毒剂,消毒对象所涉及的微生物相同时,若使用浓度相同,选择各种用途中最短 的作用时间
若作用时间相同,选择各种用途中最低的使用浓度
使用浓度低、作用时间短者 与使用浓度高、作用时间长者同时存在时,以前者为准
使用浓度高、作用时间短者与使用浓 度低,作用时间长者同时存在时,每个剂量均应进行试验
灭菌试验应用载体定性试验,普通医疗器械的灭菌以不锈钢片为载体,特殊用途的可以选用玻 d 璃片,聚四氟乙烯片等
灭菌试验按产品说明书规定的最低使用浓度(强度)和0.5倍的最短 作用时间进行试验
载体定性试验应重复5次,样本总量应不少于30个,每次试验均应设立 规定数量的阴性对照和阳性对照
进行实验室试验时,对用于不经过清洗或较脏的消毒对象的消毒剂,有机干扰物牛血清白蛋白 的浓度为3.0%;对用于经过清洗或较清洁的消毒对象的消毒剂,有机干扰物牛血清白蛋白的 浓度为0.3%;对用于经过严格清洗或极清洁的消毒对象的消毒剂,可不使用有机干扰物
4.2.2重复试验的要求 重复性试验不是只在同次试验中增加菌片数,或多作几份样本,而是应分期分批进行
必要的器材 和试剂应重新制备或灭菌,以防产生系统性误差 4.2.3结果评价 符合下列所有相应条件的消毒产品判为消毒效果试验结果合格 去除残留消毒剂效果的鉴定试验合格
a b)消毒产品的实验室试验结果符合下列指标要求 悬液定量杀菌试验时,每次试验对细菌繁殖体和细菌芽胞如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、 铜绿假单胞菌和枯草杆菌黑色变种芽胞的杀灭对数值大于或等于5.00,对龟分枝杆菌脓 肿亚种、白色念珠菌和黑曲霉菌的杀灭对数值大于或等于4.00
对照组微生物数在规定 的范围内
载体浸泡定量杀菌试验时,每次试验对各类微生物的杀灭对数值或灭活对数值大于或等 于3.00,对照组微生物数在规定的范围内
载体浸泡定性灭菌试验时,各次试验所有载体 均无试验菌生长,对照组微生物数在规定的范围内
GB/38502一2020 消毒与灭菌效果试验方法 5.1细菌悬液与菌片的制备 5.1.1实验器材 5.1.1.1 实验菌种 金黄色葡萄球菌ATcC6538、铜绿假单胞菌ATcC15442,大肠杆菌8099,枯草杆菌黑色变种芽胞 ATCC9372、白色葡萄球菌8032
在上述规定的菌株基础上,根据消毒剂特定用途或试验特殊需要,还 可增选其他菌株
5.1.1.2实验试剂 有机干扰物、磷酸盐缓冲液、无菌蒸僧水或其他纯化水、稀释液、细菌培养基,营养琼脂培养基、营养 肉汤培养基,革兰染色液,芽胞染色液(见附录B)
5.1.1.3实验设备与耗材 恒温水浴箱、离心机、电动混匀器、浊度计、恒温培养箱、玻璃漏斗、刻度吸管(1.0ml、5.0ml 0.0ml)、毛细吸管、移液器(10L20AL、100AL.200AL、l000AL)及配套的塑料吸头
5.1.2细菌悬液制备程序 5.1.2.1 细菌繁殖体悬液的制备 5.1.2.1.1以无菌操作方式开启菌种管,用毛细吸管加人适量营养肉汤培养基,吹吸数次,使菌种融化 分散
取含5.0ml~100ml营养肉汤培养基试管,滴人少许菌种悬液,置306C士1C培养18h一24h 用接种环取第1代培养的菌悬液,划线接种于营养琼脂培养基平板上,置36C士1C培养18h~24h. 或从菌种保存管中取出一粒菌珠接种于平皿上,置36C士1笔培养18h24h,挑取上述第2代培养 物中典型菌落,接种于营养琼脂斜面,置36C士1C培养18h~24h,即为第3代培养物
5.1.2.1.2取第3代第8代的营养琼脂培养基培养18h一24h的新鲜斜面培养物,用5.0mL吸管吸 取3.0ml5.0ml稀释液(一般用TPs,酸化水用生理盐水)加人试管内,反复吹吸,洗下菌苔
随后 用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中,用电动混匀器混合20s,或在手掌上振打80次,以使细菌 悬浮均匀
5.1.2.1.3初步制成的菌悬液,先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度,然后以稀释液稀释至所需 浓度
5.1.2.1.4细菌繁殖体悬液应保存在4C冰箱内备用
应当天使用,不得过夜
5.1.2.1.5怀疑有污染时,应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定
5.1.2.2细菌芽胞悬液的制备 5.1.2.2.1以无菌操作方式开启菌种管,用毛细吸管加人适量营养肉汤培养基,吹吸数次,使菌种融化 分散
取含5.0ml10.0ml营养肉汤培养基试管,滴人少许菌种悬液,置36C士1C培养18h24h 用接种环取第1代培养的菌悬液,划线接种于营养琼脂培养基平板上,置36C士1C培养18h24h
挑取上述第2代培养物中典型菌落,接种于营养肉汤培养基,置36C士1培养18h一24h,即为第3 代培养物
5.1.2.2.2用10.0mlL吸管吸取5.0ml~10.0mL第3代第5代的18h~24h营养肉汤培养物,接
GB/T38502一2020 种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面,将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基的表面,再将多余肉汤培养物 吸出,将罗氏瓶置36C士1笔恒温培养箱内培养5d7d. 5.1.2.2.3用接种环取菌苔少许涂于玻片上,以改良芽胞染色法染色
改良芽胞染色法步骤如下 用接种环取菌苔涂布于玻片上,待自然干燥,而后通过火焰加热将菌固定于玻片上
a b) 将涂片放人平m内,片上放两层滤纸,滴加足量的5.00%孔雀绿水溶液
将平皿盖好,放54C 56C条件下,加热30nmin
取出,去滤纸,用自来水冲去残留液
加0.5%沙黄水溶液,染1 水洗,待干后镜检
芽胞呈绿色,菌体呈红色
并在显微镜 min
油镜下进行镜检
当芽胞形成率达90%以上时,即可进行后续处理
否则,应继续在室温 下放置一定时间,直至达到上述芽胞形成率后再进行以下处理
L棒轻轻推刮下菌苔,吸出,再加人5.0mL无菌蒸偷 5.1.2.2.4加10.0ml无菌蒸水于罗氏瓶中,以L 水冲洗培养基表面,吸出
将两次吸出的菌悬液集中于含玻璃珠的无菌锥形烧瓶中,振摇5min 5.1.2.2.5将烧瓶置45C水浴中24h,使菌自溶断链,分散成单个芽胞
5.1.2.2.6用无菌棉花或纱布过滤芽胞悬液,清除琼脂凝块
5.1.2.2.7将芽胞悬液置无菌离心管内,以3000r/min速度离心30min
弃上清液,加蒸儡水吹吸使 芽胞重新悬浮,本步骤重复3遍
5.1.2.2.8将洗净的芽胞悬液放人含适量小玻璃珠的烧瓶内80笔水浴10min(或60C水浴30min) 以杀灭残余的细前紫殖体
待冷至室温后,摇匀分装保存于4C冰箱中备用
有效使用朗半年
5.1.2.2.9芽胞悬液在使用时,应先进行活菌培养计数
5.1.2.2.10怀疑有杂菌污染时,应以菌落形态、革兰染色与生化试验等方法进行鉴定
5.1.3菌片(染菌载体)的制备程序 5.1.3.1菌片用载体应根据消毒对象选择相应的材料,如手术器械选择不锈钢片,物体表面选择棉布 片,非金属管腔选择聚四氟乙烯片管),光滑表面可选择玻璃片等
常用的材料有金属,玻璃、滤纸、棉 布、聚四氟乙烯等,金属载体一般用12mm直径圆形金属片(厚0.5mm),其他材质载体一般为方形,大 小10nmm×10mm,特定用途的消毒产品可使用其他材质、形状的载体
5.1.3.2所用载体(除滤纸片外)于染菌前,应进行脱脂处理
脱脂过程应严格按照如下步骤进行 将载体放在含洗涤剂的水中煮沸30min a 以自来水洗净 b
用蒸僧水煮沸10min; d)用蒸僧水漂洗至pH呈中性; 晾干、,熨平备用
e 5.1.3.3布片用40织纱的白平纹棉布制作
将脱脂后的布块按载体规定的大小抽去边缘一周的经结 纱各一根,按抽纱痕剪开
金属片以不锈钢制作,纸片以滤纸制作
5.1.3.4载体经压力蒸汽灭菌后,使用滴染法染菌
染菌用菌悬液;菌悬液和芽胞悬液的制备按5.1.2进行,试验用菌悬液的含菌量约为10'CFU/ml 可使用浊度计调整菌液浓度
然后加人等量3.0%或0.3%的牛血清白蛋白,使菌液的浓度约为5×10 CFU/mL
滴染法染菌时,将经灭菌的载体片平铺于无菌平皿内,用移液器逐片滴加菌液,必要时用接种环涂 匀整个载体表面
置36C士1C恒温培养箱或室温干燥备用
5.1.3.5每个菌片(载体)的回收菌量应为1×10CFU/片一5×10CFU/片 5.1.4注意事项 5.1.4.1用浊度计测定的菌悬液浓度,只用于在滴染菌片时对菌悬液稀释度的估计
作为菌悬液含菌
GB/38502一2020 浓度或菌片染菌量的正式报告(如杀菌试验中阳性对照组菌悬液或菌片所含菌量),应以活菌培养计数 的实测结果为准,不宜使用根据比浊法判定的估计值
5.1.4.2菌液滴加不宜过快,避免流散影响染菌的准确性 5.1.4.3细菌繁殖体在载体上干燥的过程中,可引起部分死亡
宜提高初始菌浓度,以便达到所需的回 收菌量
5.1.4.4配制菌悬液和制备菌片时,应严格无菌操作,以防污染杂菌,影响杀菌试验的结果
5.1.4.5保存菌液的容器使用橡皮塞时,应将其预先煮沸10min进行脱硫处理
5.1.4.6菌悬液和菌片应随时放人冰箱内,尽量缩短室温放置时间,以减少细菌的自然死亡
5.2活菌培养计数技术 5.2.1实验器材 5.2.1.1 实验试剂 稀释液、细菌培养基、胰蛋白脖大豆琼脂培养基(TSA)、胰蛋白陈大豆肉汤培养基(TSB)等(见附录 B)
5.2.1.2实验设备与耗材 刻度吸管(1.0mL、5.0nml,10.0mL),移液器(10L、,20L,100aL、,200L、1mL,5mL)及配套 的蛆料吸头、电动混匀器、浊度计、恒温培养箱
5.2.2操作程序 活菌培养计数一般使用倾注法(有特殊规定者除外)
倾注法操作程序如下 菌悬液可直接进行培养计数
将菌片和小型固体样本直接投人含5.0ml稀释液的无菌试管 a 中,将棉拭采样端剪人管内
用电动混匀器混合20s,或在手掌上用力振打80次,将菌洗下形 成菌悬液
将试管按需要数量分组排列于试管架上,每管加人4.5mL稀释液
各组由左向右,逐管标上 b '10-',10,,等
10 将菌悬液样本用电动混匀器混合20s,或在手掌上用力振打80次随即吸取0.5mL加至10- 管内
将10-'管用电动混匀器混合20s,或在手掌上用力振打80次,混匀,再吸取出0.5mL加人 0-管内
如此类推,直至最后一管
必要时,还可作某稀释度的1:1或1:4稀释
选择适宜稀释度试管(以预计生长菌落数每平板为15CFU300CFU者为宜),吸取其中混 合均匀的悬液1.0mL加于无菌平皿内
每一稀释度接种2个平皿
一般应接种2个3个 不同稀释度
将40C一45C熔化的培养基,倾注于已加人样液的平皿中,每平皿15mL20mL
将平盖好,即刻轻轻摇动混匀,平放
待琼脂凝固后,翻转平板使底向上,置36C士1C嗜 g 热脂肪杆菌芽胞的培养温度为56士2,黑曲霉菌的培养温度为30C士1)恒温培养箱 内培养
h) 培养至规定时间,计数菌落数
对于现场试验样本,应每日观察并记录菌落数
计数菌落时，一般以肉眼观察,必要时用放大镜检查
以每平板菌落数在15CFU300CFU 的稀释度为准记录结果
对黑曲霉菌活菌计数时,以每平板菌落数在15CFU~100CFU的 稀释度为准记录结果
对菌量极少的样本,按实际菌落数计算最终结果
根据稀释倍数和接种量计算每毫升菌液中或每一菌片(染菌载体)上的平均菌落数
GB/T38502一2020 5.2.3活菌计数中技术操作误差的测定 平板间、稀释度间误差率不应超过10%
按式(1),式(2)计算误差率 习N-N P,= ×100% 习N 式中 P 平板间误差率,%; 平板间菌落平均数; N N 各平板菌落数,单位为菌落形成单位(CFU). 习A一A .(2 ×100% SA 式中: -稀释度间菌落数误差率,% P A 稀释度间菌落平均数; A -各稀释度菌落数,单位为菌落形成单位(CFU)
5.2.4注意事项 5.2.4.1严格无菌操作,防止污染
5.2.4.2认真检查实验器材有无破损,以防丢失样本和污染环境
5.24.3注意菌液的均匀分散
5.2.4.4取液要准确,尽量减少误差
5.2.4.5每吸取一个稀释度样液,应更换一支吸管或吸头
5.2.4.6样液加人平皿后应尽快倾注培养基,避免样液干燥
5.2.4.7倾注时培养基温度不得超过45C,以防损伤细菌或真菌
5.2.4.8倾注和摇动应尽量平稳,勿使培养基外溢,确保细菌分散均匀,便于计数菌落
5.3残留消毒剂化学因子)的去除方法 5.3.1原则要求 5.3.1.1应有效去除残留的消毒剂或消毒剂的影响
5.3.1.2对试验微生物无害,不减少其回收菌量
5.3.1.3不破坏培养基的营养成分,不影响其透明度
5.3.2去除方法 5.3.2.1稀释中和法(中和剂法》 在消毒剂与微生物作用到达设定时间时,取样加于适宜种类和浓度的中和剂中,将残留消毒剂迅速 中和,使其不再持续杀灭和抑制微生物的方法
其操作要点如下 将经消毒剂作用过的微生物样本,在达到规定作用时间,即刻取样移人鉴定合格的中和剂溶 a 液中; 所用中和剂的浓度与用量应与鉴定试验结果规定的相同 b 即刻混匀,并按规定时间吸取样液进行随后的培养检测 c d 应在规定时间内进行样本接种培养基以前的操作,以免微生物与中和剂或中和产物接触过久
GB/38502一2020 5.3.2.2过滤冲洗法 将经消毒剂作用过的微生物样本,立即加人适量稀释液中混匀通过适量稀释,可减轻消毒剂的持 续作用),并倾人装有微孔滤膜的滤器内,接真空系抽吸过滤(或加压过滤)后,再加适量稀释液冲洗,同 时过滤,可去除残留的消毒剂
多用于难以找到适宜中和剂的消毒效果试验
其操作要点如下 微孔滤膜、滤器灭菌后备用 a b 初次过滤后,应使用对微生物无害的稀释液进行冲洗,以洗净消毒剂为准; 冲洗、滤净后,以无菌操作方法取出微孔滤膜,进行随后的培养检测
c 5.3.3注意事项 5.3.3.1每次吸液,均应更换无菌吸管,以防交叉污染
5.3.3.2所用吸管的容量宜尽量与拟吸取的液体量相近,不要用大吸管吸取少量液体 5.3.3.3试验条件可影响残留消毒剂的去除效果,故每进行一种消毒效果试验,均应按规定对所选方法 进行去除效果的鉴定试验
5.4中和剂鉴定试验 5.4.1实验器材 5.4.1.1实验菌悬液和菌片(见5.l). 5.4.1.2实验试剂稀释液、培养基(见附录B)
5.4.1.3实验设备与耗材:刻度吸管(1.0ml,5.0mL),平皿、恒温水浴箱电动混匀器
5,4.2 设计原则 5.4.2.1通过所设各组试验结果综合分析,应可确定所用中和剂是否具有良好的中和作用,对试验用微 生物恢复和培养无不良影响
5.4.2.2试验中所用消毒剂的浓度应为杀菌试验中使用的最高浓度
5.4.2.3同一消毒剂对多种微生物进行杀灭试验时,所用中和剂应按微生物种类分别进行鉴定试验 对细菌繁殖体,一般在大肠杆菌,金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌中任选其一进行试验,特殊情 a 况按试验结果再行选择; 5 对细菌芽胞、白色念珠菌、黑曲霉菌、分枝杆菌应分别进行鉴定试验 当用其他特定微生物进行杀灭试验时,均应以该特定微生物进行中和剂鉴定试验
c 5.4.2.4鉴定时根据所用杀菌试验方法,相应使用悬液或载体进行试验
5.4.3实验分组 各组试验如下 第1组;中和剂十菌悬液; aa 第2组:(消毒剂十中和剂)十菌悬液 b) 第3组;稀释液十菌悬液; c d)第4组:稀释液十中和剂十培养基
中和剂悬液定量鉴定试验操作程序 5.4.4 根据试验分组,准备足量试管和平皿,依次进行编号
将黄悬液用等量适合浓度的有机干扰物稀释 成2.5×10CFU/ml1.5×10'CFU/ml,作为试验菌悬液
鉴定试验包括4组:
GB/T38502一2020 第1组,取0.4mL标准硬水于试管内,加人4.5mL中和剂,混匀,置20C土1C水浴中5min a 后,再加人0.1mlL试验菌悬液,混匀,作用10min,分别吸取1.0ml.接种于两个平皿中,做活 菌培养计数; b)第2组;取0.4ml消毒剂于试管内,加人4.5ml中和剂对于酸性氧化电位水检测时,取 0.5ml消毒剂于试管内,加人4.4ml中和剂混匀,置20C士1笔水浴中5min后,再加人 0.1mL试验菌悬液,混匀,作用10min,分别吸取1.0mL接种于两个平皿中,做活菌培养 计数 第3组:取0.4ml标准硬水于试管内,加人4.5mL.稀释液,混匀,置20C士1C水浴中51 min 后,再加人0.1mlL试验菌悬液,混匀,作用10min,分别吸取1.0mL.接种于两个平皿中,做活 菌培养计数; d 第4组:分别吸取稀释液、标准硬水与中和剂各0.5ml于无菌平内,倒人上述试验同批次的 培养基15ml~20mlL,培养观察
5.4.5中和剂载体定量鉴定试验操作程序 根据试验分组,准备足量试管和平皿,依次进行编号
各组分别用适宜的无菌定量吸管按以下程序 吸取或添加试剂和试验样本
将适宜浓度的菌悬液用等量适合浓度的有机干扰物稀释作为试验菌悬 液,载体试验用菌量应保证其回收菌量在2.5×10'CFU/片1.5×10CFU/片之间
鉴定试验包括 4组 a 第1组:吸取中和剂5.0mL于无菌试管中,将其置20C士1C水浴中5min后,用无菌慑子 夹人1菌片,并使浸透于中和剂内,作用10 后,用电动混匀器混合20s,或将试管振打 min 80次,混匀,分别吸取1.0mL接种于两个平皿中,做活菌培养计数; b 第2组吸取中和产物溶液(按每片浸有消毒剂的载体加人含5.0mL中和剂的量制备中和产 物)5.0ml于无菌试管内,将其置20C士1C水浴中5min后,用无菌慑子夹人1菌片,并使 浸透于中和产物溶液中,作用10 1后,用电动混匀器混合20s,或将试管振打80次,混匀. min 分别吸取1.0ml接种于两个平皿中,做活菌培养计数; 第3组;吸取稀释液5.0mL于无菌试管内,将其置20C士1C水浴中5min后,用无菌慑子 夹人1菌片,并使浸透于稀释液中,作用10min后,用电动混匀器混合20s,或将试管振打 80次,混匀,分别吸取1.0mL接种于两个平皿中,做活菌培养计数 d 第4组:分别吸取稀释液与中和剂各1.0ml于无菌平皿内,倒人上述试验同批次的培养基 5ml20ml,培养观察
5.4.6评价规定 试验结果符合以下全部条件,判为合格 第1组,第2组和第3组有相似量试验菌生长，悬液试验作用体系中菌量在50CFU/ml a 300cFU/ml之间,载体试验菌量在25xIeFU/片一1.5XI0crU/片之间
其组间菌落 数误差率应不超过15%
按式(3)计算第1组、第2组和第3组间菌落数误差率 X一X， 习 ×100% P，= 习X 式中 组间菌落数误差率,%; 三组间菌落平均数; 各组菌落平均数,单位为菌落形成单位(CFU)
X D)第4组无菌生长
否则应更换试剂,重新试验
GB/38502一2020 试验重复3次,每次试验均应符合a),b)的要求
5.4.7注意事项 5.4.7.1试验所分各组均有其特定意义,不得任意删减
5.4.7.2无菌操作,保持试验用液和器材的无菌,注意更换吸管,保证试验的准确性
5.4.7.3实验组序应按本标准执行
5.5过滤冲洗法去除残留消毒剂试验 5.5.1实验器材 5.5.1.1过滤设备:灭菌处理的滤器、微孔滤膜(孔径为0.45um)、真空泵(或抽滤泵》
5.5.1.2稀释液和冲洗液:应不影响滤膜的性质,对微生物无伤害作用
可用生理盐水、PBS,稀释液 见附录B)、含吐温80的PBs,可中和部分消毒成分的中和剂
5.5.1.3其他器材随试验微生物确定
5.5.2设计原则 5.5.2.1通过所设各组试验结果综合分析,应可确定所选方法是否对测试消毒剂有良好的去除作用,对 试验用微生物恢复和培养无不良影响
5.5.2.2试验中所用消毒剂的浓度应为杀菌试验中使用的最高浓度
5.5.2.3同一消毒剂拟对多种微生物进行杀灭试验时,所用中和剂应按微生物种类分别进行鉴定试验 具体如下 a 细菌繁殖体,可在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌中任选其一进行试验 细菌芽胞、白色念珠菌、黑曲霉菌、分枝杆菌应分别进行鉴定试验; b 当用其他特定微生物进行杀灭试验时,均应以该特定微生物进行中和剂的鉴定试验
c 5.5.2.4鉴定中应根据杀灭试验的设计,选择合适的试验方法
一般悬液鉴定试验结果可用于载体 试验
5.5.3过滤冲洗去除方法的鉴定 根据实验分组,准备足量试管和平皿,依次进行编号
将菌悬液用等量适合浓度的有机干扰物稀释 成1×10'CFU/mL5×10'CFU/mL,作为试验菌悬液
其试验分以下3组进行 第1组;吸取1.0nml试验菌悬液于试管内,加人4.0mL标准硬水,混匀,取1.0nml加人到过 a 滤器中,然后加人50ml蒸馏水作冲洗过滤处理,然后直接将滤膜有菌面朝上贴于平板表面 放置在36C士1C恒温培养箱中培养48(真菌和芽胞培养72h),计数菌落数; 第2组吸取0.,2mL试验菌悬液直接加人到过滤器中,然后加人150m500mL冲洗液于 b 过滤器中,做第1次冲洗过滤处理,再加人50ml蒸僧水做第2次冲洗过滤处理,最后将滤膜 有菌面朝上贴于平板表面,放置在36C士1C恒温培养箱中培养48h(真菌和芽胞培养72h),计 数菌落数; 第3组;吸取4.0ml消毒剂于试管中,加人0.5ml有机干扰物,再加人0.5mL稀释液,混匀 取1.0ml加人到过滤器中,加人150ml500ml冲洗液做第1次冲洗过滤处理,再加人 50mL冲洗液做第2次冲洗过滤处理,冲洗后吸取0.2mL试验菌悬液直接加人到过滤器中 再加人50ml蒸憎水做第3次冲洗过滤处理,然后将滤膜有菌面朝上贴于平板表面，置 36C士1C恒温培养箱中培养48h(真菌和芽胞培养72h),计数菌落数
GB/T38502一2020 5.5.4评价规定 试验结果符合以下全部条件,可判为合格 第1组,第2组和第3组测定的结果,菌悬液菌数应在20CFU/滤膜~100CFU/滤膜之间,其 a 组间菌落数误差率不得超过15%
组间菌落数误差率的计算见式(3)
b 试验重复3次,每次试验均应符合a)的要求
5.6细菌杀灭试验 5.6.1实验器材 5.6.1.1实验菌种;金黄色葡萄球菌,大肠杆菌、铜绿假单胞菌和枯草杆菌黑色变种芽胞等微生物的悬 液或菌片
5.6.1.2消毒剂作用浓度应以实验菌与消毒剂的混合液中有效成分的最终浓度为准
5.6.1.3去除残留消毒剂的中和剂或设备
5.6.1.4实验试剂消毒剂稀释用标准硬水、有机干扰物质、TsA培养基(见附录B)、含中和剂的胰蛋 白陈大豆肉汤培养基(中和剂TSB),中和剂经鉴定合格
5.6.1.5设备与耗材;刻度吸管(1.0ml,5.0mL)、恒温水浴箱、恒温培养箱,电动混匀器,秒表
5.6.2实验分组 试验中应分以下各组 实验组 a 按测试目的有两种选择; 第一种适用于消毒产品鉴定
根据使用说明书,选定试验菌和一个消毒剂浓度(即产品使 用说明书中指定的最低浓度)以及3个作用时间说明书指定最短作用时间,指定最短作 min,则 用时间的0.5倍,指定最短作用时间的1.5倍
如说明书指定最短作用时间为20n mn,20min和30mim)进行试验. 3个作用时间应分别为10min 第二种适用于消毒产品日常监测
根据所试菌种和消毒剂对该菌的杀灭能力,选定一种 或以上的微生物和一个消毒剂浓度即产品使用说明书中指定的最低浓度)以及1个作用 时间说明书指定最短作用时间)进行试验
D阳性对照组 用标准硬水代替消毒剂溶液,按上述同样的步骤进行试验
所得结果代表试验体系中的菌液 浓度,以其作为对照组活菌浓度
5.6.3悬液定量杀菌试验操作程序 5.6.3.1按照5.1.2配制实验用菌悬液,使其浓度为1×10'CFU/mL5×10CFU/mL(回收菌落数为 1×10'CFU/ml一5×10'CFU/mL)
5.6.3.2按照产品说明书要求配制消毒液
无特殊说明者一律使用无菌硬水配制,配制的浓度为待测 浓度的1.25倍(例如要评价的消毒液浓度为200mg/L,则应配制的浓度为250mg/I),置20C士1C 水浴备用
5.6.3.3取消毒试验用无菌试管,先加人0.5mL试验用菌悬液,再加人0.5mlL有机干扰物质,混匀,置 20笔士1C水浴中5min后,用无菌吸管吸取上述浓度消毒液4.0ml注人其中,迅速混匀并立即计时 5.6.3.4待试验菌与消毒剂相互作用至各设定时间,分别吸取0.5ml试验菌与消毒剂混合液加于 4.5ml中和剂中,混匀
10
GB/38502一2020 5.6.3.5各管试验菌与消毒剂混合液经加中和剂作用10min后,分别吸取1.0ml样液,按5.2进行活 菌培养计数
5.6.3.6同时用标准硬水代替消毒液,进行平行试验,作为阳性对照
5.6.3.7所有试验样本均置36C士1C恒温培养箱中培养,对细菌繁殖体培养48h观察最终结果;对 细菌芽胞应培养72h观察最终结果
5.6.3.8试验重复3次,计算各组的活菌浓度(CFU/mL),并换算为对数值(N),然后按式(4)计算杀灭 对数值 KL=N
一N， 式中 KI 杀灭对数值; N
对照组平均活菌浓度的对数值， 实验组活菌浓度对数值
N、 计算杀灭对数值时,取小数点后两位值,可以进行数字修约
但是,如果消毒实验组平均生长菌落 数小于1时,本标准规定此时的杀灭对数值,即大于或等于对照组平均活菌浓度的对数值(KL>N.)
5.6.4载体浸泡杀菌试验操作程序 5.6.4.1载体浸泡定量杀菌试验操作程序 5.6.4.1.1按照5.1.3制备实验用菌片,使每个菌片的回收菌数为1×10"CFU/片5×10CFU/片
5.6.4.1.2取无菌平皿,标明所注人消毒液的浓度
按每片5.0ml的量,吸取相应浓度的消毒剂溶液 注人平皿中 5.6.4.1.3将盛有消毒剂平皿置20C士1C水浴5min,用无菌锻子取预先制备的菌片3片分别放人 平皿中,并使之浸没于消毒液
5.6.4.1.4待菌液与消毒剂相互作用至各设定时间,用无菌子将菌片取出分别移人一含5.0mL中和 剂试管中
用电动混匀器混合20s,或将试管在手掌上振打80次,中和作用10min
混匀后,吸取 ，直接接种平,每管接种2个平m,测定存活菌数
l.0ml 5.6.4.1.5另取一平皿,加人10.0 .0m稀释液代替消毒液,放人2片菌片,作为阳性对照组
其随后的 试验步骤和活菌培养计数与上述实验组相同
5.6.41.6所有试验样本均在36c1C恒温培养箱中,对细菌紧殖体培养48h观察最终结果;对绷 菌芽胞培养72h观察最终结果
5.6.4.1.7试验重复3次,计算各组的活菌量(CFU/片),并换算为对数值(N),然后按式(5)计算杀灭 对数值 KL=N一N 5 式中 KI 杀灭对数值; N 对照组平均活菌量的对数值; 实验组活菌量对数值
N
5.6.4.2载体浸泡定性灭菌试验操作程序 5.6.4.2.1按照5.1.3制备实验用菌片,使每个菌片的回收菌落数为1×10CFU/片5×10'CFU/片
5.6.4.2.2取无菌平皿,标明所加人消毒液的浓度
按每片5.0ml的量,吸取相应浓度的消毒剂溶液 加人平皿中
5.6.4.2.3将盛有消毒剂平皿置20C士1C水浴5min,用无菌锻子取预先制备的菌片6片分别放人 11
GB/T38502一2020 平皿中,并使之浸没于消毒液
5.6.4.2.4待试验菌与消毒液相互作用至设定时间,用无菌辍子将菌片取出分别移人含5.0ml中和剂 肉汤试管中
用电动混匀器混合20s,作为实验组样本
5.6.4.2.5另取一平皿,加人20.0mL
标准硬水代替消毒液,放人4片菌片,作用至设定时间,取出 2片,分别移人含5mL中和剂试管中,其随后的试验步骤与上述实验组相同,作为阳性对照组样本
另 取出2片,分别移人一含5.0ml中和剂肉汤试管中,按5.2进行活菌培养计数,作为菌数对照组样本
5.6.4.2.6所有试验样本均在36C士1C恒温培养箱中培养,对细菌繁殖体培养48h,观察最终结果; 对细菌芽胞培养7d,观察最终结果
5.6.4.2.7试验重复5次,计算各组的活菌量(CFU/片)
5.6.5滤膜过滤悬液定量杀灭试验 5.6.5.1菌悬液的制备和定量杀灭试验同5.6.3.1、5.6.3.2和5.6.3.3,滤膜孔径0.45Am 5.6.5.2待试验菌与消毒剂(分别预先置20C士1C水浴中5nmin)相互作用至各设定时间,分别吸取 1.0ml试验菌与消毒剂混合液加人到过滤器中过滤,然后加人150ml500ml冲洗液做第1次冲洗 过滤处理,再加人50ml蒸僧水做第2次冲洗过滤处理,将滤膜有菌面朝上贴于平板表面,置36C士1C 恒温培养箱中培养至规定时间 5.6.5.3吸取0.5mL试验菌悬液于试管内,加人0.5mL有机干扰物,再加人4.0mL标准硬水,混匀
做10倍系列稀释后取适当稀释度1.0mlL加人到过滤器中,然后加人50ml蒸憎水作冲洗过滤处理 然后将滤膜有菌面朝上贴于平板表面,置36C土1C恒温培养箱中培养至规定时间,计数菌落数,作为 阳性对照
5.6.5.4分别吸取稀释液、蒸馏水和硬水各1.0mL于无菌平皿内,倒人上述试验同批次的培养基 15ml20mL,置36C士1C恒温培养箱中培养至规定时间,计数菌落数,作为阴性对照
试验重复3次,计算各组的活菌量(CFU/mL或CFU/片),并换算为对数值(N),然后按式(4) 5.6.5.5 或式(5)计算杀灭对数值
5.6.6评价规定 5.6.6.1评价消毒效果时,要求在产品说明书指定的浓度与3个作用时间,重复试验3次
在产品指定 最低浓度与最短作用时间,以及最短作用时间的1.5倍时,要求悬液定量杀灭试验中各次的杀灭对数值 均大于或等于5.00
载体定量杀灭试验中,各次的杀灭对数值均大于或等于3.00,判定为消毒合格
在 产品指定浓度与最短作用时间的0.5倍时,可允许对不同细菌或在部分重复次数中,出现不合格结果
5.6.6.2对载体浸泡定性灭菌试验,阳性对照组有菌生长且菌数符合要求,阴性对照组无菌生长,5次 试验均无菌生长,判定为灭菌合格
5.6.6.3报告中应将各次试验的结果全部以表格的形式列出
阳性对照组应列出各次实验菌浓度,以 及平均实验菌浓度
实验组应列出杀灭对数值,例如,杀灭对数值大于或等于5.00时,可表示为 “>5.00”而不必列出具体的数字;杀灭对数值小于5.00时,应列出具体的数字(例如2.58,4.65)
5.6.7注意事项 5.6.7.1在杀菌试验中,每次均应设置阳性对照
5.6.7.2试验中所使用的中和剂、稀释液和培养基等,各批次均应进行无菌检查,发现有菌生长,则全部 试验重做
5.7分枝杆菌杀灭试验 5.7.1实验器材 5.7.1.1实验菌株;龟分枝杆菌脓肿亚种CMCC93326(ATcC19977). 12
GB/38502一2020 5.7.1.2实验试剂;分枝杆菌培养基,0.1%胰蛋白陈的生理盐水溶液、消毒剂稀释用硬水,有机干扰物 质(见附录B),鉴定合格的中和剂
5.7.1.3实验设备与耗材;试验菌及其菌悬液或菌片的制备所需器材,刻度吸管、恒温水浴箱、电动混匀 器、计时装置、恒温培养箱
龟分枝杆菌脓肿亚种菌悬液的制备 5.7.2 5.7.2.1以无菌操作方式开启冻干菌种管,用毛细吸管吸取适量营养肉汤于管中,吹吸数次,使菌种融 化分散
取含5.0ml10.0ml营养肉汤的试管,滴人少许菌种悬液,置36C士1C培养18h一24h 用接种环取第1代培养的菌悬液,划线接种于分枝杆菌培养基平板上,置36士1C培养72h
挑取 上述第2代培养物中典型菌落,接种于分枝杆菌培养基斜面,置36C士1培养72h,即为第3代培养 物
密封后,4C保存,时间不超过6周
5.7.2.2试验时,取第3代斜面培养物在分枝杆菌干燥培养基斜面上按上述方法连续传代,培养方法与 第3代相同,取第5代第6代的分枝杆菌培养基斜面72h培养物,用5.0nmL吸管吸取3.0mL~ 5.0mL稀释液加人斜面试管内,反复吹吸洗下菌昔
用吸管将洗液移至另一含有6g一7g玻璃珠的 无菌圆锥底塑料试管中,在电动混匀器混合5min,将菌液吸人到另一试管内制成菌悬液
5.7.2.3将制成的菌悬液,进行活菌培养计数(见5.2),按其结果用稀释液稀释至所需浓度
5.7.2.4菌悬液保存在4C冰箱内备用,当天使用不得过夜
5.7.3实验分组 试验分为下列各组 实验组:按5.6.3规定选定消毒剂浓度与作用时间 a 5 阳性对照组;以标准硬水代替消毒剂溶液,按5.6.3规定程序进行试验,所得结果代表试验体 系中所含受试菌的活菌浓度; 阴性对照组;观察同次试验用相关溶液和培养基有无污染
5.7.4试验程序 杀灭试验.悬液定量杀灭试验和载体浸泡定量杀灭试验等
其操作程序按5.6.3.5.6.4进行接种 后的平皿应放人干净的塑料袋内,置36C士1C恒温培养箱中培养7d,观察最终结果
5.7.5评价规定 5.7.5.1悬液试验时,回收菌量为1×10'CFU/mL~5×10"CFU/mL
载体试验时,回收菌量为1× 10CFU/片5×10CFU/片
5.7.5.2评价消毒效果时,按产品使用说明书指定的使用浓度和3个作用时间,重复试验3次
具体评 价规定如下 a 用悬液定量杀菌试验评价杀菌效果时,在产品规定使用浓度与最低作用时间,以及最短作用时 间的1.5倍时.各次试验的杀灭对数值均应大于或等于4.00;在产品规定使用浓度与最短作用 时间的0.5倍时,允许杀灭对数值小于4.00,判定为实验室试验该产品对分枝杆菌污染物消毒 的有效剂量; 用载体浸泡定量杀菌试验评价杀菌效果时,在产品规定使用浓度与最短作用时间和最短作用 b 时间的1.5倍时各次试验的杀灭对数值大于或等于3.00;在产品规定使用浓度与最短作用时 间的0.5倍时,允许杀灭对数值小于3.00,判为实验室试验该产品对分枝杆菌污染物消毒的有 效剂量
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GB/T38502一2020 5.8真菌杀灭试验 5.8.1实验器材 5.8.1.1试验菌及其菌悬液或菌片;白色念珠菌ATcC10231和黑曲霉菌ATcC16404袍子悬液与菌 片,按5.8.2.1和5.8.2.2所示方法制备
根据消毒剂特定用途和特殊需要,可选择相应的菌株
5.8.1.2实验试剂:沙堡液体培养基,琼脂、麦芽浸膏琼脂培养基(MEA),麦芽浸膏营养肉汤培养基 MEB)、磷酸盐缓冲液、消毒剂稀释用硬水、有机干扰物质(见附录B)、鉴定合格的中和剂
5.8.1.3实验设备与耗材;刻度吸管(0.1mL1.0mL,5.0mL),恒温水浴箱,电动混匀器、计时装置、恒 温培养箱
5.8.2真菌悬液制备 5.8.2.1白色念珠菌悬液按以下步骤制备 以无菌操作方式开启冻干菌种管,用毛细吸管吸加适量沙堡液体培养基于菌种管中,轻轻吹 a 吸,使菌种沉淀物融化分散
取含5.0mL10.0mL沙堡液体培养基试管,滴人少许菌种悬 液,置36C士1C培养18h一24h
用接种环取第1代培养的菌悬液,划线接种于沙堡琼脂培 养基平板上,置36C士1C培养18h一24h
挑取上述第2代培养物中典型菌落,接种于沙堡 琼脂斜面,置36士1C培养18h~24h,即为第3代培养物
b)取第3代第6代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物(18h一24h),用5.0mL吸管吸取 .0mL一5.0ml稀释液加人斜面试管内反复吹吸,洗下菌苔
随后,用5.0mL吸管将洗液 移至另一无菌试管中,用电动混匀器混合20s,或在手掌上振打80次,以使白色念珠菌悬浮 均匀
悬液定量杀灭试验时,菌悬液浓度为1×10CFU/ml5×10CFU/ml回收菌量为 1×10CFU/ml~5×10CFU/mL);载体定量杀菌试验时,菌片制备按5.1.3要求进行
菌悬液保存在4C冰箱内备用,当天使用不得过夜
d 怀疑有污染时,应以菌落形态、革兰染色与生化试验等方法进行鉴定
菌落形态可直接用显微 e 镜观察
菌体形态可在涂片后直接用高倍显微镜观察,也可用墨水阴地法染色(将菌与黑墨水 在玻片上混匀,推成薄膜)后观察
5.8.2.2黑曲霉菌(ATcc16404)抱子悬液或菌片按以下步骤制备 以无菌操作方式开启冻干菌种管,用毛细吸管吸取少量麦芽浸膏营养肉汤培养基加到菌种管 a 中,轻轻吹吸,使菌种沉淀物融化分散
取少许沉淀物悬液加到含5.0mL麦芽浸膏营养肉汤 培养基试管中,置30C士1恒温培养箱中培养42h一48h
用接种环划线接种第1代培养 物于MEA培养基平板,置30士1C恒温培养箱中培养42h一48h
取平板培养物中的典 型菌落,接种于麦芽浸膏营养肉汤培养基,置30C士！C恒温培养箱中培养42h一48h,即为 第3代培养物
b nL第3代培养物;接种罗低服;并摇动使菌液布满MEA 用10.0ml吸管吸取5.0ml~10.0 培养基表面,将多余肉汤培养物液体吸出,置30C士1C恒温培养箱中培养42h48h 向罗氏瓶培养物中加人5.0ml~10.0ml0.05%体积分数)吐温80生理盐水溶液,刮洗黑曲 霉菌分生袍子于溶液中,将袍子悬液移人装有玻璃珠的锥形瓶中,轻轻振摇1min后,过滤除 去菌丝后，显微镜下(400倍)观察是否仍有菌丝存在,若有可经5000r/min~6000r/min离 心201 再次在显微镜下(400倍)观察,必要时重复上述步骤 mn
黑曲霉菌分生袍子悬液在2C~8C储存不能超过2d,使用前,混合均匀,在显微镜下(400倍 观察是否有袍子出芽,若有则不得使用
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GB/T38502一2020 悬液定量杀灭试验时,菌悬液浓度为1×10CFU/mL~5×10CFU/ml(回收菌量为1×10" CFU/ml一5X10'CFU/mL)
菌片以滴染法制备
染菌后,置二级生物安全柜内干燥备用
回收菌量应为1×10CFU/片 f 5×10°CFU/片
5.8.3 实验分组 分为下列各组: 实验组:按5.6.2规定,确定消毒剂浓度与作用时间,对受试菌种的杀灭能力进行测定 a b 阳性对照组:以标准硬水代替消毒剂溶液,按5.6.2规定程序进行试验,所得结果代表试验体 系中所含试验菌的活菌浓度; 阴性对照组:观察同次试验用相关溶液和培养基有无污染
5.8.4试验程序 悬液定量杀菌试验,载体浸泡定量杀菌试验的操作程序均见5.6
白色念珠菌使用沙堡琼脂培养 基,黑曲霉菌使用麦芽浸膏琼脂(MEA)
活菌培养计数时,白色念珠菌在36C土1C恒温培养箱中培养72h观察最终结果;黑曲霉菌在 C恒温培养箱中培养72h观察最终结果
30 5.8.5评价规定 评价消毒效果时,按产品使用说明书指定的使用浓度和3个作用时间,重复试验3次
具体评价规 定如下 在产品规定使用浓度与最短作用时间,以及最短作用时间的1.5倍时,各次试验的杀灭对数值 a 均应大于或等于4.00,判定为消毒合格 b)用载体浸泡定量杀菌试验评价杀菌效果时,在产品规定使用浓度与最短作用时间,以及最短作 用时间的1.5倍时,各次试验的杀灭对数值大于或等于3.00,判定为消毒合格 5.9消毒剂杀菌作用影响因素试验 5.9.1实验器材 实验菌种;菌片与菌悬液(按5.1的要求和方法制备). 5.9.1.1 5.9.1.2实验试剂;中和剂(经中和剂试验鉴定合格)、盐酸(用无菌纯化水配制,氢氧化钠(用无菌纯化 水配制);有机物,根据消毒剂的使用对象选择,如酵母粉、血清,蛋白脉、牛血清白蛋白
5.9.1.3实验设备与耗材;恒温水浴箱、冷水浴装置(可放人试管架的容器,以冰水调节水温)、温度计、 pH计
5.9.2试验微生物的选择 根据所测消毒剂鉴定需要决定
一般情况下,对细菌繁殖体应选择大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,作 为革兰阴性细菌与阳性细菌的代表;对细菌芽胞应选择枯草杆菌黑色变种芽胞
也可直接选择特定的 微生物进行试验
5.9.3消毒剂浓度和作用时间的设定 试验应分为两组,各组消毒剂浓度和作用时间的设定如下 实验组:各种因素影响的测定,均用杀灭相应微生物试验所得最低有效浓度和3个作用时间进 a 15
GB/T38502一2020 行杀灭试验
以该最低有效浓度所需的最短有效时间和最短有效时间的2倍、3倍为3个作 用时间
试验结果应测出合格杀灭对数值的最低有效剂量
必要时,可根据需要调整消毒剂 浓度或作用时间,若最短有效时间较长(大于30 可根据情况适当缩短作用时间的组距
min 对最短有效时间较短者(小于51 ),可根据情况适当延长作用时间的组距 min b 阳性对照组:用标准硬水代替消毒剂溶液,按5.9.3a)进行试验
所得结果代表活菌浓度
5.9.4有机物对杀灭微生物效果影响的测定 5.9.4.1以小牛血清为有机物代表,应设置无小牛血清对照组,含25%小牛血清组,含50%小牛血清组 等3组
各组所用消毒剂浓度和作用时间,见5.9.3.
5.9.42菌悬液与无菌小牛血请按11与31比例混合,分别配成含50%与25%小牛血请的菌悬 液
此含小牛血清的菌悬液,可用于悬液定量杀菌试验,亦可滴染菌片进行载体定量试验
5.9.4.3以悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验进行测定,试验程序见5.6
5.9.4.4试验应重复3次
5.9.4.5计算每次试验的杀灭对数值和平均杀灭对数值
5.9.5温度对杀灭微生物效果影响的测定 设置10C士1,20C士1c,30C士1C等,以10C为间隔
各组消毒剂浓度和作用时间 5.9.5.1 的设置见5.9.3
5.9.5.2以悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验进行测定,试验程序见5.6
5.9.5.3试验应重复3次
5.9.5.4计算每次试验的杀灭对数值和平均杀灭对数值
5.9.6pH对杀灭微生物效果影响的测定 以该消毒剂的使用浓度pH和使用浓度的pH加2,pH减2,设3组进行试验
对消毒液pH 5.9.6.1 的调节,先用pH计测定原消毒剂的pH,在偏酸时慢慢滴加氢氧化钠溶液,偏碱时慢慢滴加盐酸溶液以 调整
随时用pH计测定消毒剂的pH
当达到所要求的pH后,停止调整,进行随后的试验
必要时 在pH调整后可测定有效成分含量以观察是否受到pH变化的影响
5.9.6.2各pH组所用消毒液浓度和作用时间,见5.9.3
5.9.6.3以悬液定量杀灭试验或载体浸泡定量杀灭试验进行测定,试验程序见5.6
5.9.6.4试验应重复3次
5.9.6.5计算每次试验的杀灭对数值和平均杀灭对数值
5.9.7评价规定 有机物影响试验以不含小牛血清组为对照,温度影响试验以20C土士1C组为对照,pH影响试验以 消毒剂使用溶液pH组为对照
具体评价规定如下 任一组中第1个第3个作用时间杀灭效果均合格,判为该组所试因素无影响 a b) 任一组中第1个作用时间杀灭效果不合格,第2个,第3个作用时间杀灭效果合格,判为该组 所试因素有轻度影响; 任一组中第1个,第2个作用时间杀灭效果不合格,第3个作用时间杀灭效果合格,判为该组 所试因素有中度影响; d)任一组中第1个第3个作用时间杀灭效果均不合格,判为该组所试因索有重度影响
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GB/38502一2020 附 录 A 规范性附录 实验室及人员要求 实验室要求 A.1 消毒实验室进行致病微生物包括分枝杆菌、黑曲霉菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 的消毒学试验时或检测现场标本时,应在生物安全I级以上的实验室内进行,并符合GB19489中的相 关要求
实验室应采取封闭式布局,具备完成相关试验所需仪器设备,且便于清洁、消毒
A.2人员要求 .2.1消毒产品检测的实验室人员应为经过消毒学实验操作技术培训的专业人员
A. ..2.2实验审核人员应具有中级专业技术职称、,5年以上的消毒产品检测经历,并经过专门培训
N A.2.3实验室技术负责人和质量负责人应具有高级专业技术职称、5年以上的消毒产品检测经历,并 经过专门培训
A.3无菌操作要求 A.3.1试验开始前,应以湿式方法清洁台面和室内地面
A.3.2实验人员应穿戴工作服、防护鞋、口罩、帽子,进行无菌检验时,正确穿戴好无菌隔离衣、鞋套、帽 子和口罩
A.3.3每吸取一次不同样液应更换无菌吸管,接种环(针)应在火焰上烧灼灭菌后,才可再次使用,也可 用一次性使用的无菌吸管和接种环(针). A .3.4要求无菌的试剂,如蒸僧水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养基、标准硬水、中和剂等,均应灭菌
A.3.5无菌器材和试剂,使用前应检查容器或包装是否完整,有破损者不得使用
A.3.6正在使用的无菌器材和试剂不得长时间暴露于空气中
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GB/T38502一2020 附录 B 规范性附录) 试 剂 B.1 稀释液 B.1.1胰蛋白膝生理盐水溶液(IPs) 胰蛋白贿 1.0g 氯化钠 8.5g 先用900ml.以上蒸憎水溶解,并调节pH值在7.0士0.2(20),最终用蒸僧水加至1000ml,分 装后,于121C压力燕汽灭菌20min备用
B.1.2磷酸盐缓冲液(PBs.0.03mol/L.pH7.2) 2.83 无水磷酸氢二钠 g .38g 磷酸二氢钾 蒸水加至 1000ml 将各成分加人到1000mL蒸水中,待完全溶解后,调节pH至7.2,于121C压力蒸汽灭菌20nmin 备用
B.1.3标准硬水(硬度342mg/L) 氧化钙(CaC1. 0.304g 0.139 氯化镁(MgC
6H.O) g 蒸僧水加至 1000ml 将各成分加人到1000mL蒸水中,待完全溶解后,用0.45um滤膜过滤除菌备用
B.1.4生理盐水 氯化钠 8.5g 蒸水加至 1000ml 将氯化钠加人到1000ml蒸僧水中,待完全溶解后,于121C压力蒸汽灭菌20min备用
B.2革兰染色液 第1液;结晶紫溶液 结晶紫乙醇饱和溶液 100mL 结晶紫 4g一8发 100 95%乙醇 ml 1%草酸胺溶液 第2液;卢戈碘液 碘化钾 2g 18
GB/38502?2020 lg ? 200mL 3?:? 1)95% 2)??? 100mL 95%? 70ml 30mL ? 4?;????? ??? 10ml ? 5?10g 5%??? 90ml 900ml ? B.3?????? 1?;5.00%??? 2?:0.5%??? B.4л ??? 30?3g 1000mL ? ???(??0.45Am)?,?汸 B.5?? 10 ? g ? 5g ? 5g 5g ? ? 1000ml ???и?,pH7.27.4,?,?,?,121C? 201 mln B.6? 10g ? 5g ? 5g ? 1000ml ????,pH7.27.4,?,121C?20miná 19
GB/T38502?2020 B.7???(ISB ?? 1.5%g/100mL) ??? 0.5%g/100mL) ? 0.5%g/100mL) ???,pH?7.2?0.2,121C?20miná B.8????(TsA ?? 1.5%(g/100mL) ??? 0.5%g/100mL ? 0.5%g/100m) 1.6%g/100ml ? ???,pH?7.2?0.2,121C?20miná B.9?? 40g ? 10g ? 20g ?? 1000ml ???,??,pH5.6?0.2,115C?30miná B.10?? 40g 10g ?? 1000mL ???,??,pH5.6?0.2,115C?30miná B.11??(MEA ? 30g ??? 3g ? 15g ??? 1000ml ???,121C?20min,?pH6.9?0.2á 20
消毒剂实验室杀菌效果检验方法GB/T38502-2020
实验室是进行科学研究和实验的场所，也是教育和培训人才的重要基地。而实验室中的细菌、病毒等微生物对于实验结果和员工健康都会造成影响。
消毒剂的使用可以有效地杀灭这些微生物，保障实验室环境的卫生和员工的健康。然而，不同种类的消毒剂对微生物的杀菌效果有着差异，因此需要通过检验方法来评估消毒剂的杀菌效果。
GB/T38502-2020标准规定了一套严格的实验室消毒剂杀菌效果检验方法。该方法主要包括以下几个步骤：
- 1.准备样品：从实验室环境中采集一定数量的微生物作为样品。
- 2.制备稀释液：将样品加入适量的生理盐水中，制成一定浓度的菌液。
- 3.制备试验板：将含有不同浓度消毒剂的培养基倒入培养皿中，制成试验板。
- 4.接种菌液：在试验板上均匀涂布菌液。
- 5.置于恒温箱中：将试验板置于恒温箱中，让菌落自行生长。
- 6.观察并比较：观察试验板上菌落的生长情况，并比较不同浓度消毒剂的杀菌效果。
通过以上步骤的操作，可以得到不同浓度消毒剂的杀菌效果，并确定最佳的消毒剂使用浓度。这样做可以保证实验室环境的卫生和员工的健康，同时也能有效地提高实验的准确性和可靠性。
总之，消毒剂的使用对于实验室环境的卫生和员工的健康至关重要。而消毒剂的杀菌效果检验方法可以帮助我们评估不同种类消毒剂的杀菌效果，从而选择最适合实验室使用的消毒剂。
