蠕虫尹氏蜗牛检疫鉴定方法

蠕虫尹氏蜗牛检疫鉴定方法

国家标准 GB/T36825一2018 蠕虫尹氏蜗牛检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofEobaniavermnicnlata Miller,1774 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36825一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位:福建出人境检验检疫局、宁波出人境检验检疫 局、张家港出人境检验检疫局 本标准主要起草人:王沛、周卫川,崔俊霞、陆军、肖琼
GB/36825一2018 蠕虫尹氏蜗牛检疫鉴定方法 范围 本标准规定了蠕虫尹氏蜗牛Eoban niaUermiculataMuller，1774)检疫鉴定的方法原理、器具与试 剂、现场检疫、实验室鉴定、结果评定以及标本处理和保存 本标准适用于蠕虫尹氏蜗牛的检疫鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注文件的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T30672011软体动物常规检疫规范 术语和定义 SN/T3067一2011界定的以及下列术语和定义适用于本文件 3.1 矢囊dartsack 蜗牛雌性生殖系统中一个藏有1枚或多枚骨针的肌肉质的囊状结构 3.2 lovedart 恋矢 矢囊中钙质或壳质的骨针 注:为蜗牛交配的刺激器官 3.3 盲管diverticulum 受精囊柄分枝形成的空管状结构 3.4 鞭状体lagelum 蜗牛雄性生殖系统中的附器,由阴茎本体末端延伸形成 注:位于阴茎本体和输精管交接处后面的部分 方法原理 蠕虫尹民蜗牛主要随运输工具,种苗和污染的货物远距离传播 该蜗牛为杂食性的有害生物,不需 要特定的寄主植物,凡接触过地面的物品都有可能是污染源 传播方式和传播途径是确定现场检疫的 依据 贝壳、螺体、生殖系统形态特征和线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(cOI)基因序列是实验室鉴定 的主要依据 蠕虫尹氏蜗牛相关信息参见附录A
GB/T36825一2018 5 器具与试剂 5.1器具 5.1.1体视显微镜:10×以上 5.1.2放大镜 手电筒 5.1.3 5.1.4塑料自封袋5*,8" 5.1.5广口标本瓶:500mL 5.1.6孔径土壤筛;4mm 5.1.7小铁铲 5.1.8游标卡尺 5.1.9白瓷盘 5.1.10培养皿. 5.1.11错子 5112剪刀. 5.A13显微饿子 5.1.14显微勇刀 5.1.15微针 1都别耸址 标生 ，20，100l，200l，1000l ,.118移滚他;2后l，1o儿 i微型高心机" 5.1.20PR仪. 5.1.21离心管:l.5ml 5.1.22PCR反应管;0.2ml 5.1.23恒温金属浴 5.2试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合G;B/T6682中相关规定 5.2.175%乙醇 5.2.2无水乙醉 5.2.3硫酸镁 5.2.4动物基因组DNA提取试剂盒 5.2.52×PCR预混合液(2×TaPCRMasterMix) 5.2.6 双蒸水 现场检疫 6 对来自疫区的集装箱、木质包装材料必须重点检查,仔细观察集装箱的底部和四角部位以及所装货 物与木质包装材料是否有蜗牛 对来自疫区的原木,盆景,苗木、水果等未经加工的植物性原材料也应 认真检查,对可能被蜗牛污染的物品可用高压水枪冲洗后再检查 蜗牛爬行过后,一般都会留下银灰色 的丝带状黏液痕迹,这是判定是否有蜗牛污染的重要依据 发现蜗牛,随时装人塑料自封袋或标本瓶带
GB/36825一2018 回实验室做进一步的检验鉴定 发现盆景等携带土壤或其他细碎衬垫材料时,需过筛检查是否有卵或 幼螺 实验室鉴定 7.1测量观察 用游标卡尺测量蜗牛贝壳的壳高和壳宽、卵粒长和宽 用肉眼或放大镜或体视显微镜仔细观察卵 和螺的形态特征 7.2尹氏蜗牛属EobanialHesse. 1915鉴定特征 贝壳大型,圆球形,螺旋部低矮 受精囊具有延伸的盲管,其长度超过受精囊柄 矢囊很小 鞭状 体一般比阴茎和阴茎本体短 本属贝壳形态与耳螺属OalaSchumacher，1817相似,但前者壳口简 单、口缘白色或接近棕色,外唇反折锋利;而后者壳口有时有齿、口缘内侧深褐色,外唇反折,增厚,不 锋利 7.3蠕虫尹氏蜗牛鉴定特征 7.3.1 卵 mmm×4.ltmm 白色,椭圆形,长短径约为3n 7.3.2贝壳 7.3.2.1成螺 贝壳呈低矮圆球形,相当坚固,有4个5个螺层,各螺层适度膨胀 体螺层圆形,在前方强烈向下 倾斜 壳面颜色多变,从黄白色到褐色,常有色带或斑点,呈蠕虫状,一般有4条一5条深褐色条带,螺 旋部色带常断裂成为一系列的斑点 体螺层腹面在色带和挤孔之间的区域为淡白色 壳口和口缘白 色,口缘外折反卷 胚螺层光滑 次螺层有许多发达的锻锤状的雕刻 贝壳无脐孔 壳高14 mm一 24mm， mm32 壳宽22 2mm 贝壳大小有地理分布上的差异,如在希腊的Gavdo、岛,壳高可达 24.5mm33.5mm 参见附录B中图B.1) 7.3.2.2幼螺 幼螺贝壳外形与成螺基本相似,但口缘不外折,脐孔狭窄且开放,生长螺脐孔部分被轴唇外折所遮 盖,至成螺时脐孔完全闭合 7.3.3螺体 浅褐色,腹足背部颜色较深,至腹部逐渐变为淡黄色(参见附录B中图B.2) 7.3.4生殖系统 7.3.4.1生殖系统解剖 将麻醉或闷杀(见9.1)处理后的标本,剥去外壳,将软体固定在蜡盘上,在体视显微镜下,从头部的 体右侧找到生殖孔 解剖从生殖孔开始,先用显微剪刀沿生殖孔外围一圈剪开体壁,然后从背部纵向轻 轻勇开体壁肌肉 仔细辨认外生殖器的各种结构,尤其要注意阴茎牵引肌和输精管及受精囊的辨认 最后将生殖系统从体腔中分离出来
GB/T36825一2018 解剖完后,将生殖系统用解剖微针固定,按标准状态摆放(参见附录B中图B.3),然后进行拍照、绘 图、特征观察和描述 7.3.4.2生殖系统特征 阴茎本体细长,其宽度与鞭状体差不多 阴茎肿胀,呈梭形至棒状 鞭状体也很长,未端逐渐变细 输精管长 阴道长度适中 矢囊不大,棍棒状 恋矢横切面成“十”字状四瓣分裂 游离输卵管扭曲,缠 绕 黏液腺从矢囊基部的上方插人阴道,非常发达,黏液腺2枝,每枝分两个树权,基部长,棒状,每个树 权还继续各分两枝,末端有许多分叉,呈爪状 受精囊柄长,具有相当长而稍微膨胀的颈部和强烈弯曲 的盲管(参见附录B中图B.3) 7.3.5Co基因片段序列鉴定 参见附录C方法提取DNA、PCR扩增和测序,将所测序列与序列数据库(Genbank)登录号为 已知蠕虫尹氏蜗牛的coI基因标准序列进行比对,相似度大于或等于95%确定为蠕虫尹民 KJ995731 蜗牛的疑似样品 8 结果评定 以贝壳形态为基本鉴定依据,螺体和生殖器解剖形态为铺助鉴定特征,并注意与近似种鉴别(参见 附录D).符合7.3.2或同时符合7.3.2、7.3.37.3.4形态特征的蜗牛鉴定为蠕虫尹氏蜗牛 单独查获的 卵粒符合7.3.1形态特征,需按照sN/T3067一2011,8.4饲养鉴定方法进行孵化和饲养实验 符合 7.3.5作为前期初筛或最终鉴定结果的分子佐证,当检测样品的DNA序列与已知蠕虫尹氏蜗牛的 DNA序列同源性大于或等于95%时,确定为蠕虫尹氏蜗牛的疑似样品,需要进一步做形态鉴定 标本处理和保存 g.1标本处理 将蜗牛置于盛满水的瓶中,盖上瓶盖,进行闷杀,蜗牛在慢慢窒息的死亡过程中,逐渐伸展身体;或 逐渐加人少量硫酸镁,进行麻醉闷杀 将闷杀后软体伸展的蜗牛标本置于75%的乙醇溶液中固定,每隔1d2d换1次乙醇溶液,共换 3次4次，便可长期保存于75%的乙醉溶液中 9.2标本保存 经处理后的标本,至少妥善保存6个月,并注明时间,产地、寄主,采集人等信息
GB/36825一2018 附录 A 资料性附录 蠕虫尹氏蜗牛相关信息 A.1名称 学名;Eobaniaermiculaka(Maller，1774) 异名:Heli.rUermiculataMller，1774 英文名;Choeolatebandsnail A.2寄主 杂食性,以各种绿色植物为食 幼螺以腐殖质、植物的幼苗和嫩芽为食;成螺取食各种绿色植物的 茎、,叶和果实,喜食多汁的蔬菜,水果和花卉等园艺作物 A.3分类地位 蠕虫尹氏蜗牛隶属软体动物门Mollusca,腹足纲Gastropoda,肺螺亚纲Pulmonata,柄眼目 Stylommatopgora,大蜗牛科Helicidae,尹氏蜗牛属EobaniaHesse，1913 该属为大蜗牛科一小属,仅 constantinaeForbes，1838)梅西拉尹氏 有3个种 蠕虫尹氏蜗牛的近似种有康氏坦丁尹氏蜗牛E. 蜗牛E massylaeaMorelet，1851. A.4地理分布 大洋州:澳大利亚东南部 亚洲:日本 非洲:地中海沿岸国家 欧洲:地中海盆地:从西班牙东部至克里米亚均有分布,具体分布包括以色列、埃及、西班牙东部、保 加利亚东部、希腊南部和北部、乌克兰克里米 英国伦敦也有分布 北美洲:美国南部加利福尼亚和新奥尔良 A.5危害性 蠕虫尹氏蜗牛主要危害蔬菜草莓饲草、果树、花卉等经济作物 据文献报道,在埃及北部沿海地 区,蠕虫尹氏蜗牛是最重要的农业有害生物,对农作物和果园生产构成了严重威胁.且危害正在逐年 加重 该蜗牛起源于南欧,是一种适应性强、危害严重的杂食性有害生物 由于蠕虫尹氏蜗牛寿命长达 成螺可连续几年产卵,因而极易在新区建立种群,危害作物和破坏生物多样性 该螺人侵美国 5年， 后,在葡萄园生栖危害,对加利福尼亚和德克萨斯的葡萄园构成严重威胁 澳大利亚从地中海地区进口
GB/T36825一2018 水果时,将蠕虫尹氏蜗牛列人检疫性有害生物名单,对于检疫中发现该蜗牛,都进行相应的熏燕灭螺 处理 蠕虫尹氏蜗牛在没有分布,目前口岸已多次截获 鉴于蠕虫尹氏蜗牛的危害性和传人风 险及其在国际上的检疫地位,需要加强对该蜗牛的检疫,警惕其传人国内,危害农林生产
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GB/T36825一2018 录 附 资料性附录) 蠕虫尹氏蜗牛CR鉴定方法 C.1DNA提取 取适量腹足肌肉,用SDS方法或动物基因组DNA试剂盒方法提取DNA C.2co1基因引物 LcO1490;5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3 HcO2198;5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3 PCR目标产物片段大小约为68o bp. C.3 反应体系 pmal/L)0.5ALHco2198(I04mol/L) 反应体系为20L;其中DNA模板2AL，LCO1490(10 0.5L,2XPCR预混合液10L,双猴水7L. C.4CR扩增条件 min,4 94C5min;94C50s,4530s,72C50s,30个35个循环;72C10 C.5测序 将PCR扩增样品送有资质的生物技术公司测序 C.6比对鉴定 将双向测序获得的60bp一70bp长度NA序列,经软件拼接和人工校对后,与G.eonbunlk登录 号为K995731已知蠕虫尹氏蜗牛的co基因标准序列进行比对,相似度大于或等于95%的待鉴样 品确定为蠕虫尹氏蜗牛的疑似样品 0
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蠕虫尹氏蜗牛检疫鉴定方法GB/T36825-2018

蠕虫尹氏蜗牛（学名：Angiostrongylus cantonensis）是一种寄生在老鼠体内的线虫，常以老鼠为食的蜗牛误食了寄生在老鼠肺部的幼虫，成为幼虫的中间宿主。人类通过食用未经彻底加工的蔬菜或螺蛳等含有蜗牛体内的幼虫而感染上蠕虫病，严重者可导致脑膜炎、脑炎甚至死亡。

GB/T36825-2018标准介绍

GB/T36825-2018《蠕虫尹氏蜗牛检疫鉴定方法》是我国针对蠕虫尹氏蜗牛的检疫鉴定标准。该标准规定了对蠕虫尹氏蜗牛进行检疫鉴定的方法和要求，包括采集样品、操作步骤、实验条件等方面。

蠕虫尹氏蜗牛检疫鉴定方法

蠕虫尹氏蜗牛检疫鉴定是为了防止蠕虫病的传播而制定的一项重要措施。下面介绍一下具体的检疫鉴定方法：

采集样品

在可能存在蠕虫尹氏蜗牛的区域，如果园、田野、江河湖泊、污水渠等地，采用人工捕捉或诱捕法收集含有蠕虫尹氏蜗牛的螺类、草本植物及其他生物组织等样品，然后将其放入标准容器中，即可开始实验。

操作步骤

首先，将采集到的样品分别经过洗涤、提取、离心等步骤，使样品中的蠕虫尹氏蜗牛幼虫从中提取出来。然后，将提取出的物质通过显微镜观察其形态特征，并进行其他相关检测，如PCR扩增等。

实验条件

蠕虫尹氏蜗牛检疫鉴定需要在实验室环境下进行，对温度、湿度、光照等因素要求严格。同时，在操作过程中需要注意消毒和防护，确保实验安全。

结语

蠕虫尹氏蜗牛是一种危害人类健康的寄生虫，通过正确的检疫鉴定方法可以有效预防其传播。GB/T36825-2018标准的要求，为蠕虫尹氏蜗牛检疫鉴定提供了指导。希望本文能对您了解蠕虫尹氏蜗牛检疫鉴定方法有所帮助。

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2022/8/12 2:27:47 现行