GB/T18636-2017
蓝舌病诊断技术
Diagnostictechniquesforbluetongue
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）11.220
- 实施日期2018-05-01
- 文件格式PDF
- 文本页数29页
- 文件大小2.29M
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蓝舌病诊断技术
国家标准 GB/T18636一2017 代替GB/T186362002 蓝舌病诊断技术 Diugostietechmiquesforbluetongue 2017-11-01发布 2018-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T18636一2017 目 次 前言 范围 2 规范性引用文件 3 临床诊断 3.I流行病学 3.2临床症状 3.3病理变化 3.4结果判定 病毒分离 4.1器材 4.2试剂 4.3试验程序 4.4病毒鉴定 4.5结果判定 免疫酶染色 5.1器材 试剂 5.2 5.3试验程序 5.4试验成立条件 5.5结果判定 抗原捕获酶联免疫吸附试验(AC-ELISA 器材 6.l 6.2试剂 6.3样品 6.4试验设计 6.5试验程序 6.6试验成立的条件 6.7结果判定 定型微量中和试验 7.1器材 试剂 7.2 7.3试验准备 7.4筛检试验程序 7.5 试验成立的条件 7.6结果判定 蚀斑及蚀斑抑制定型试验 8 8.1器材
GB/T18636一2017 8.2试剂 8.3蚀斑试验程序 8.4蚀斑抑制试验程序 8.5结果判定 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR 9.1器材 9.2试剂 10 9.3试验程序 0 9.4试验成立的条件 9.5结果判定 10 荧光RT-PCR检测 0.1器材 试剂 ll 10.2 10.3试验程序 12 0.4阔值设定 13 10.5试验成立的条件 : 3 0.6结果判定 琼脂免疫扩散试验(AGID) 13 1l 1.1器材 5 1.2试剂 15 1.3试验程序 14 1.4结果判定 14 12竞争酶联免疫吸附试验(C-ELISA) 5 15 12.1器材 12.2试剂 15 12.3试验程序 5 2.4读数和抑制率计算 16 12.5试验成立的条件 16 12.6结果判定 l 16 +中 13诊断结果判定 13.1疑似病例 16 3.2确诊病例 16 16 13.3隐性感染 附录A(规范性附录》细胞培养液的制备 17 附录B(规范性附录免疫酶染色试验用溶液的配制 18 19 附录C规范性附录酶联免疫试验和定型微量中和试验用溶液的配制 附录D(资料性附录)Karber方法 21 附录E(规范性附录)蚀斑及蚀斑抑制定型试验 22 23 附录F规范性附录RT-PCR试验用溶液和引物的配制 附录G(规范性附录)荧光RT-PCR引物和探针的合成与配制 24 25 附录H规范性附录琼脂平板的制备
GB/T18636一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准代替GB/T18636一2002《蓝舌病诊断技术》,与GB/T18636一2002相比,除编辑性修改外， 主要技术变化如下 -增加了临床诊断 -增加了反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测方法; -增加了荧光RT-PCR检测方法
本标准由农业部提出
本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口
本标准起草单位云南省畜牧兽医科学院、深圳出人境检验检验局
本标准主要起草人李华春、朱建波、花群义.肖雷,宋建领、李乐、高林、苗海生 本标准历次版本发布情况为: GB/T186362002
GB/T18636一2017 蓝舌病诊断技术 范围 本标准规定了蓝舌病(Bluetongue，BT)诊断的技术方法和试验程序
本标准适用于反乌动物蓝舌病的诊断、流行病学调查及检疫
所述方法包括临床诊断、病原分离和 鉴定、病原核酸检测以及血清学检测,其中: Virus，BTV) 病毒分离适用于从动物的血液,脏器和精液中分离蓝舌病病毒(Bluetongue -LinkedImmunosorbent 免疫酶染色和抗原捕获酶联免疫吸附试验AntigenCaptureEnz nzyme Assay， ACELISA)适用于对分离到的病毒进行血清群的鉴定; 定型微量中和试验和蚀斑及蚀斑抑制定型试验适用于对分离到的BTV进行血清型的鉴定 TranscriptionPolymeraseChainReaction，RT-PCR)和荧光 反转录聚合酶链式反应(Reverse RT-PCR检测适用于动物的血液、脏器和精液中BTV核酸的检测，也适用于对分离到的病毒 进行血清群鉴定; -琼脂免疫扩散试验AgarGellmmunodiffusion，AGID和竞争酶联免疫吸附试验 CompetitionEnzyme-LinkedImmunosorbentAssay,C-ELISA)适用于血清样品中BTV抗 体的检测
规范性引用文件 下列文件中对于本文件的应用是必不可少的
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 s/T1193基因检验实验室技术要求 临床诊断 3.1流行病学 3.1.1蓝舌病是由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒引起,由库蝶通过叮咬传播,感染反刍动物 致其发病的非接触性传播的虫媒病毒病
3.1.2BTV主要引起绵羊发病和死亡,牛和山羊常为隐性感染,偶有发病和死亡
3.1.3蓝舌病的发生和分布与库蝶有密切关系,主要爆发于库螳大量活动的夏秋季节,特别以池塘、河 流多的低洼地区多见
3. .1.4易感动物对口腔途径感染有很强的抵抗力,发病动物的分泌物和排泄物内病毒含量极低,不会 引起蓝舌病的传播
3.2临床症状 3.2.1潜伏期3天9天
病初羊体温为40.5C42C,呈稽留热型,一般持续2天3天
3.2.2病羊双唇水肿及充血,出现流诞和流鼻涕等现象
口腔充血,后呈青紫或蓝紫色,很快口腔黏膜
GB/T18636一2017 发生溃疡和坏死,鼻腔有脓性分泌物,干后呈痂,引起呼吸困难
鼻腔和口腔病变一般在5天7天 愈合
3.2.3舌头充血、点状出血、肿大,严重的病例舌头发绀,表现出蓝舌病的特征症状
3.2.4角基部和蹄冠周围有红圈
蹄冠和蹄叶发生炎症,甚至有些动物蹄壳脱落,出现跛行,行动 僵直
3.2.5有时腹泻,粪便带血,孕羊流产
3.2.6全身皮肤呈弥散性发红,皮肤上有针尖大小出血点或出血斑,被毛易折断和脱落
3.2.7致死多由于并发肺炎和胃肠炎所致
动物的死亡率与许多因素有关，一般为2%30%,如果感 染发生在阴冷、湿润的深秋季节,死亡率更高
3.2.8 一般情况,牛感染TV后几乎不表现临床症状,但可长时间保持病毒血症
欧洲BTV-8型感 染牛后能出现流涎、流鼻涕和口腔充血等临床症状 3.3病理变化 3.3.1鼻液稀薄,并有水样或黏液性出血 3.3.2脾脏肿大
肾充血和水肿,皮质部可见界限清楚的淤血斑 肺表现为肺泡充血,局部水肿,支气管充满泡沫,胸腔可能积有数升浆液样液体
3.3.3 3.3.4心包积水,有点状出血,左心室与肺动脉基部常有明显的心内膜出血
3.4结果判定 反刍动物出现上述临床症状和病理变化且符合蓝舌病流行病学特点,可判定为疑似蓝舌病
确诊采集发热期病畜的血液.也可采集死后不久尸体上淋巴结、脾脏、肝脏等进行实验室诊断 病毒分离 4.1器材 4.1.1鸡胚孵化器(35C),恒温培养箱(30C)及二氧化碳培养箱(37C). 4.1.2冰箱(4C、一20C和一80C) 4.1.3微型雕刻电钻、照蛋器、组织捣碎器、超声波粉碎器低速离心机及倒置显微镜
4.1.4平皿,眼科剪刀,眼科锻子
4.1.596孔组织培养板(平底,简称96孔板),单道微量加样器(0.5l10AL54l~10L、40AlL 200L,200L1000L)及滴头,多道加样器及滴头
4.2试剂 4.2.1细胞;蚊子细胞(C6/36),仓鼠肾细胞(BHK-21)或非洲绿猴肾细胞(Vero)
4.2.2细胞培养液(配制方法见附录A)
4.2.3l0日龄l1日龄鸡胚
4.3试验程序 4.3.1样品采集和保存 无菌采集动物的肝素抗凝血、脏器脾、肝、肾,淋巴结)或精液
用于病毒分离的样品应置冷藏容器 中保存,在24h内送到实验室,并立即进行处理
GB/T18636一2017 4.3.2样品处理 4.3.2.1 生物安全措施 样品处理的生物安全措施按照GB19489进行
4.3.2.2血液样品处理 取肝素抗凝血200AL,加人1mLPBs(磷酸盐缓冲液),1000r/min离心10 min;细胞沉淀再用 lmLPEs洗涤2次,离心弃上清液;细胞沉淀加人900lL灭菌双燕水,混匀,确保红细胞充分裂解 经处理的样品当天使用,使用前置4C保存,剩余样品置一80C保存备用
4.3.2.3组织样品处理 取动物脾、淋巴结、肝、肾各2g,剪碎后加人10mlPBs(含青霉素2000IU/ml、链霉素2000"g nmL),置乳钵中研磨,4C冰箱中浸提4h
取上清液2mL用超声波裂解处理(100nA、1min~2min) 3000r/min离心20min,取上清液1mL,加人4ml灭菌双燕蒸水,混匀
经处理的样品当天使用,使用 前置4C保存,剩余样品置一80C保存备用 4.3.2.4精液样品处理 取精液样品0.2ml,用PBS作1:10稀释,经处理的样品当天使用,使用前置4C保存,剩余样品 置一80C保存备用
4.3.3鸡胚接种 443.3.1选择10日龄一1日龄发育良好的鸡胚,在照蛋灯下,用铅笔在鸡胚上标记静脉位置和开孔 区,涂抹碘消毒,用微型雕刻电钻开窗备用
4.3.3.2在生物安全柜内,用标注好样品编号的1mL注射器,吸取制备好的样品准备接种鸡胚 4.3.3.3在照蛋灯下,每个鸡胚静脉接种0.lml样品,每份样品接种5个鸡胚,接种后用擦镜纸封口， 置35C孵化箱培养
4.3.3.4每日观察一次并记录,24h内死亡的鸡胚为非特异性死亡,废弃
4.3.3.5分别收集接种后24h120死亡的鸡胚和120h后存活的鸡胚肝脏,将其按质量体积比 1:10加人PBS捣碎,2000r/min离心10min
取上清液备用
4.3.4细胞接种 4.3.4.1将4.3.3.5制备的上清液用第6章(AC-ELISA)或第9章(RT-PCR)或第10章(荧光RT-PCR 的技术方法进行检测
用检测结果为阳性的样品接种两个长满单层C6/36细胞的培养管或25cm'培 养瓶,每管(瓶)接种0.2mL,置于30C恒温培养箱培养7天,移至4C保存
4.3.4.2将接种后7天的两管(瓶)C6/36细胞吹打后合并,接种两管瓶)BHK-21细胞,每管(瓶 0.2mL,加人维持液,置于37二氧化碳培养箱培养,每天在显微镜下观察1次,将出现细胞变圆或脱 落等细胞病变效应(CPE)的管(瓶)或接种后7天未出现CPE的管《瓶)移至4C保存
出现CPE者收 获,无CPE者在BHK-21细胞盲传三代,仍无CPE者弃之
4.3.5病毒保存及工作液的制备 4.3.5.1将出现CPE的BHK-21细胞收获,2000r/min离心20min,病毒悬液用1ml无菌小管分装 置一80C保存作为原始毒
4.3.5.2取1管原始毒于BHK-21细胞上传代1次,分装,一80C保存,记为“原始毒十1”
4.3.5.3“原始毒十1"按4.3.5.2方法增殖,分装,部分-80保存,作为贮存毒液,部分4C保存,作为
GB/T18636一2017 工作毒液,用于病毒鉴定
4.4病毒鉴定 对4.3.5.3中分离到的病毒,选用第5章(免疫酶染色试验)或第6章(AC-ELISA)或第9章(RT PCR)或第10章(荧光RT-PCR)检测方法进行血清群鉴定
也可选用第7章(定型微量中和试验)或第 8章(蚀斑及蚀斑抑制定型试验)进行血清型鉴定
4.5结果判定 上述血清群或血清型鉴定中的任何一项阳性者,可判定为病毒分离阳性
5 免疫酶染色 5.1器材 5.1.1恒温箱(37C),二氧化碳培养箱(37C)
5.1.2冰箱(4C和一20C),倒置显微镜
5.1.396孔组织培养板(平底)、滴头、三角烧瓶(50mL),吸水纸
5.1.4多道加样器、单道加样器(0.5"l10AlL5AL40L、40L200ML、,200A 1000AL 5.2试剂 5.2.14.3.3.5或4.3.5.3获得的病毒未知毒株
5.2.2蓝舌病病毒悬液,流行性出血病病毒悬液 5.2.3BHIK-21细胞,使用浓度2.5×10个细胞/ml3.3×10个细胞/ml
5.2.4细胞培养液(配制方法见附录A)
5.2.5 小鼠抗蓝舌病病毒VP7单克隆抗体(BTV-Mab),4C保存
5.2.6 山羊抗鼠免疫球蛋自clgG)辣根过氧化物酶联结合物，一20保存,使用前解冻,置4C备用 5.2.7细胞固定液(8%的福尔马林),0.05%吐温20的PBs(PBST),1%明胶PST
5.2.8底物;3-氨基-9-乙基咔哗(AEC)液(配制方法见附录B)
5.3试验程序 5.3.196孔组织培养板中加待检病毒,每个样品4孔,每孔加人20ML 5.3.2设细胞对照4孔,每孔加人细胞生长液20AL;阳性对照4孔,每孔加人已知蓝舌病病毒悬液 20L;阴性对照4孔,每孔加人加其他环状病毒群成员如流行性出血病病毒20L 5.3.3每孔加人BHK-21细胞悬液180AL,置37C5%二氧化碳培养箱培养,逐日观察
当样品孔出 现细胞病变时,每孔加人细胞固定液200AL,室温静置10n ,移弃细胞固定液和培养液
min， 5.3.4PBsT洗涤5次
5.3.5用含1%明胶的PBST将BTV-Mab稀释至体积分数为20%的工作液,每孔加人50L,置湿盒 中,37 C孵育min 5.3.6PBST洗涤5次
5.3.7用含1%明胶的PBST按1:1000稀释酶结合物，每孔加人50AL,置湿盒中,37C孵育 90min
5.3.8PBST洗涤5次,在吸水纸上拍干
5.3.9每孔加底物100AL,室温静置30min. 5.3.10PEBST洗涤2次,在吸水纸上拍干
GB/T18636一2017 5.4试验成立条件 用倒置显微镜观察判定
当阴性对照和细胞对照孔细胞不着色,而阳性对照孔中的感染细胞被染 成红棕色时,试验成立
5.5结果判定 样品中有红棕色细胞,则判为阳性,否则判为阴性
抗原捕获酶联免疫吸附试验(Ac-EL.IsA) 6.1器材 6.1.1恒温箱37),冰箱(4C和一20C).
6.1.2微量振荡器、混合仪、酶标洗板仪及酶标读板仪
6.1.396孔高吸附性酶标板、单道加样器(0.5AL104L、5AL40AL,404L一2004L,200L~ 1000AL及滴头,多道加样器及滴头、50ml三角烧瓶、吸水纸
6.2试剂 6.2.1捕获抗体;牛(或羊)抗BTV抗血清,一20C保存
6.2.2检测抗体;兔抗BTV核衣壳抗血清，一20保存
6.2.3酶结合物;山羊抗兔lgG辣根过氧化物酶结合物，-20保存,使用前解冻,置4C备用
6.2.4阳性对照:BTV细胞毒或感染的鸡胚组织悬液
6.2.5阴性对照;正常细胞培养物或鸡胚组织悬液
6.2.6缓冲液;碳酸盐缓冲液(pH9.4)、乙酸-柠檬酸盐缓冲液(pH6.0、磷酸盐缓冲液(pH7.4、含5% 脱脂奶的PBST(PBST-SM)
配制方法见附录C 6.2.7底物;四甲基联苯胺储存液(室温避光保存),30%过氧化氢(H,O),配制方法见附录C
6.3样品 6.3.14.3.3.5的上清液 6.3.24.3.4.2的出现细胞病变的细胞培养物,使用前用PBST倍比稀释
6.3.3临床样品,处理方法见4.3.2
6.4试验设计 每个样品两孔,两个不同BTV血清型作阳性对照各2孔,细胞或鸡胚组织悬液作阴性对照2孔
6.5试验程序 用碳酸盐缓冲液将捕获抗体作1:1000倍稀释,每孔加人50nlL至酶标板,置密闭温盒中,4c 6.5.1 过夜
6.5.2PBST洗涤5次
6.5.3按每个样品两孔,每孔50L.分别加人待检样品和对照样品,室温静置60min,再置37C振荡 30min
6.5.4PBST洗涤5次
GB/T18636一2017 6.5.5用PBSTSM按1;2000稀释检测抗体,每孔加50L,37C振荡30 min 6.5.6PBST洗涤5次
6.5.7用PBST-SM按l:3000稀释酶结合物,每孔加504L.,37C振荡30min
6.5.8PBST洗涤5次,在吸水纸上拍干
6.5.9将底物按比例稀释(取9.7ml乙酸-柠檬酸缓冲液,分别加人300AL四甲基联苯胺储存液和 5L30%过氧化氢),每孔加50AL,置37C避光反应10nmin15min,每孔加人50AL2mol/I硫酸 终止反应
6.5.10 s0)
在酵标读板仅读取4a0nm波长的光度吸收值(oD 6.6试验成立的条件 阳性对照的ODa大于0.8,阴性对照的ODo小于阳性对照OD的15%时,试验成立
6.7结果判定 样品孔OD大于或等于阴性对照孔OD的两倍时判为阳性,否则判为阴性
定型微量中和试验 7.1器材 7.1.1二氧化碳培养箱(37C),冰箱(4C和一80C). 7.1.2倒置显微镜、微型振荡器、磁力搅拌器
7.1.396孔平底细胞培养板,单道微量加样器(0.5l10l,5Al~10AL、404l一200AL,200l l000AL)及滴头,多道加样器及滴头
7.2试剂 7.2.1病毒 待检病毒选用第5章(免疫酶染色试验)或第6章(AC-ELISA)或第9章(RT-PCR)或第10章(荧 光RT-PCR)检测方法进行血清群鉴定，经鉴定为BTV的毒株,通过细胞空斑克隆纯化3次后一80C 保存备用
对照病毒应为国际标准毒株
7.2.2阳性血清 BTV24个血清型国际标准阳性血清(中和抗体效价,筛检试验不低于1:20,确认试验不低于1:320).
7.2.3阴性血清 无BTV抗体和细胞毒性的牛血清
7.2.4细胞 Vero细胞,使用浓度1.5×10个细胞/mL
7.2.5细胞培养液及维持液 配制方法见附录A
7.2.60.1%綦黑蓝染色液 配制方法见附录C
GB/T18636一2017 7.3试验准备 7.3.1病毒繁殖 7.3.1.1将vero细胞应用转管或静止培养方法培养,当细胞形成单层后,换为维持液培养
7.3.1.2接人待检病毒,37C培养,连续观察7天,记录CPE
7.3.1.3细胞出现CPE后,用吸管吹打管壁,取病毒悬液用同样的方法接种Vero细胞连续传3代 5代
7.3.1.4将最后一代的病毒液分装于1ml病毒管作为待检病毒贮存液-80C保存
7.3.1.5将待检病毒贮存液接种于单层Vvero细胞上,37C培养,逐日观察,待CPE达到75%以上时收 毒,分别置于一80C和4C冻融3次,置无菌离心管2000r/min离心20nmin,取上清液分装于1mL 小管,4C保存备用
7.3.2毒价滴定 7.3.2.1将待检病毒和对照病毒用细胞生长液作10-110-"稀释 7.3.2.2按每孔50AL,每个稀释度8孔将稀释后的病毒加进96孔平底细胞培养板
设细胞对照孔 8孔，每孔各加人细胞生长液50AL
上述各孔再补加人细胞生长液50AL.随后加人细胞悬液100L 7.3.2.3 7.3.2.4置37C含5%的二氧化碳培养箱内培养,连续观察10天,每天记录结果
7.3.2.5当细胞无污染，且细胞对照孔中的细胞层完整的前提下,计算细胞半数感染量TCID.(参见附 录D) 7.4筛检试验程序 7.4.1试验设计及记录表见表！
表1各型BTV血清和对照排列 序号 12 17 V10" C.C 10 18 V10- C.C 11 19 V10- C.C 12 C.C 20 V10 V0I0 13 21 V10" V10- V1o 14 2 15 23 V10'" V10" V10 H 16 24 V10" V10" V10- 注1表中粗黑框表示细胞培养板内各孔的布位
1~9为检测区,1012为对照区
注2:黑框内数字表示不同型标准血清的型号,每型血清各加人3孔 注3;V表示病毒对照,V10'~V10-4个稀释度,每个稀释度占用4孔 注4.c.c.表示细胞对照
注5;s为阴性血清对照 注6:本表如不填写上述数字,即可作记录表用
7.4.2阳性血清经5630min处理后,作1;20稀释
GB/T18636一2017 7.4.3将待检病毒用细胞生长液稀释为每50L含100个TCID.a,作为病毒工作液
7.4.4将50AL
阳性血清,50AL待检病毒液分别加人对应的孔,振荡后置37C中和1h,然后加人 00AL细胞悬液
7.4.5按下列步骤设置病毒对照、细胞对照和阴性对照 病毒对照:取病毒工作液,用细胞生长液作稀释10"、l0-1、10-子、10-?四个稀释度,每个稀释度4孔. 每孔50AL.加100L细胞悬液,补生长液50L达到总量200L 细胞对照,设4孔,每扎加细胞悬液10L补生长液100AL达到总量200山 阴性对照;设4孔，每孔加人1:20稀释的阴性血清50L.,蓝舌病病毒工作液50L,细胞悬液 00L
7.4.6置37C含5%二氧化碳培养箱培养,连续观察10天,每天记录结果
7.4.7培养10天后,每孔加人0.1%禁黑蓝染色液50AL100ML,室温静置2h3h,用水漂洗 晾干
7.5试验成立的条件 7.5.1细胞对照组应不出现细胞病变
7.5.2病毒对照,应保证在100个TCID.的病毒液10和10-稀释度的各孔均出现CPE,10-"有12个 孔出现细胞病变,10-'和10-'孔全无细胞病变
7.5.3阴性对照应全部出现细胞病变
7.6结果判定 7.6.1符合7.5的条件,出现细胞病变记为cPE十,不出现细胞病变为cPE一
若某一型抗体组均无 细胞病变,其他型的抗体组均有细胞病变,则可初步认为是该血清型病毒,再按7.6.2进一步确认;若两 个或两个以上的血清型抗体组无细胞病变,则认为可能是其中的某个型,按7.6.3作进一步鉴定;若所 有抗体组均出现细胞病变,按7.6.4进行
7.6.2 稍毒仅被某狸标准用性血请中相.将待定想糊毒与初定狠的同则标准毒分别作10 10-"稀 120稀释的初定型标准阳性血清50AL.后四 释,每个稀释度加8孔,每孔50l,其中前四孔每孔加1 孔每孔加1:20稀释的阴性犊牛血清50AL,振荡混匀,37C5%二氧化碳培养箱中培养10天,判定结 果
当标准阳性血清中和滴度较其阴性血清孔高两个或两个以上,而待检病毒也出现类似情况,则可判 定为该型病毒
7.6.3有细胞病变的两型的阳性血清(已知滴度),分别作1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320 等倍比稀释,每稀释度均为4孔,每孔各加100TCD被测病毒,各种试剂的加样量和顺序按7.4.4进 行
以四孔完全抑制细胞病变的最高稀释度作为判定终点,若某型抗体中和滴度比其他型高出两个或 两个以上并与标准毒试验结果基本一致,则可定为该型
7.6.4均不被24个血清型抗体中和的病毒,可能为多型混合感染或新的血清型,则需进行克隆化,克 隆化的病毒再按上述方法做血清型特异鉴定,若仍然不被24个血清型抗体中和,则需要进一步鉴定
8 蚀斑及蚀斑抑制定型试验 8.1器材 8.1.1二氧化碳培养箱(37C)、冰箱(4和一80C) 8.1.2倒置显微镜、微型摇床,磁力搅拌器
8.1.36孔细胞培养板、单道微量加样器(0.5AL10AL、5L10AL、40AL200AL200lL 1000AL及滴头,10ml吸管
GB/T18636一2017 8.2试剂 8.2.1细胞:Vero细胞
参考阳性血清;以1一24型蓝舌病病毒制备的无菌高效价、型特异性血清,琼扩效价在1:2以 8.2.2 上,一20C保存
8.2.3病毒:将保存病毒在敏感细胞上繁殖数代,反复冻融3次,离心取上清液，-80C保存
8.2.4滤纸圆片,0.5%中性红,4%低熔点琼脂糖(配制方法见附录E. 8.3蚀斑试验程序 8.3.1将Vero细胞(0.5×10个细胞/mL)加人6孔细胞培养板,每孔2mL.,放人湿盒内置37C5% 二氧化碳培养箱培养48h一72h直至长成致密单层
8.3.2用吸管将长满单层的6孔细胞培养板中的培养液吸出
8.3.3将待测病毒用无血清细胞培养液从10-l10-'递次稀释,将0.2ml10-了~10-'的病毒稀释液 分别加人细胞培养板1孔5孔,第6孔加0.2mL细胞培养液作为细胞对照
将细胞培养板置微型摇 床轻轻摇动.37C感作60min. 8.3.4用加样器依次从细胞对照孔、10-了~10将病毒液移弃
8.3.5将1%低熔点琼脂糖 50 3.5mlL4%低熔点琼脂糖与25C10.5ml细胞培养液混匀)迅速加 人细胞培养板,每孔2 ,室温静置15min,放人湿盒内置37C二氧化碳培养箱培养
2m 8.3.624后,逐日显微镜下观察蚀斑出现情况至96h
300 8.3.7将14mL1%低熔点琼脂糖加人 L0.5%中性红混匀后迅速加人细胞培养板,每孔1mL
室温静置15min,放人湿盒内置37 二氧化碳培养箱培养24 h
8.3.8结果判读:蓝舌病病毒在Vero细胞上形成直径约1mm近圆形白色蚀斑,健康细胞层颜色为深 红色计数各稀释度蚀斑数并作记录,计算每毫升蚀斑形成单位(PFU/mL 8.4蚀斑抑制试验程序 8. .4.1按照8.3.1方法培养细胞 8.4.2用吸管将长满单层的6孔细胞培养板中的培养液吸出
8.4.3将待检病毒稀释至10'PFU/mL,每孔加人0.2ml,37C感染60min,吸出病毒液
8. .4.4将1%低熔点琼脂糖(50C3.5ml4%低熔点琼脂糖、25c10.5mL细胞培养液和300AL. 0.5%中性红混匀)迅速加人细胞培养板,每孔2mL室温静置15minm 8.4.5将24个型参考阳性血清按一定顺序,用滤纸片浸人血清后,轻轻置于琼脂上静置15min后,记 清型号,将细胞培养板放人湿盒内置37C二氧化碳培养箱培养
8.4.648h后逐日观察结果,测量抑制圈直径
并作好记录,拍照
8.5结果判定 相应型血清的抑制圈为围绕血清滤纸片的边缘较整齐的深红色的环形带,直径在1.2cm一2.0cm 之间,可判定某病毒为该血清型;个别情况下,另一型也同时出现一定的抑制圈,但抑制圈的直径一般不 超过0.6cm,边缘较不整齐,颜色较淡,此为交叉反应所致
反转录聚合酶链式反应(RT-CR g.1器材 9.1.1PCR检测仪、高速台式冷冻离心机、台式离心机、混匀器、冰箱(4C、一20C和一80C).
GB/T18636一2017 g.1.2微量可调移液器(10ML、100AL、1000AL)及配套带滤芯吸头,离心管(2mL),PCR反应管
所 有实验容器均用DEPC水处理后高压灭菌分装
9.2试剂 若无特殊说明,所有化学试剂均为常规分析纯级试剂
9.2.1琼脂糖、漠化乙锭、去离子甲酰胺、异丙醇
1xTAE电泳缓冲液,配制方法见附录F
实验用水 应符合GB/T6682的要求 9.2.2市售核酸提取试剂盒和核酸扩增试剂盒均按说明书使用
9.2.3引物;引物的序列和配制见附录F
本标准中的蓝舌病病毒反转录聚合酶链式反应检测方法中 所采用的引物与OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》(2014)中的引物序列一致
9.2.4阳性对照;BTV细胞培养物浓度为100TCIDa,用细胞培养液或BTV阴性健康牛EDTA抗凝 血稀释》 9.2.5阴性对照细胞培养液或BTV阴性健康牛EDTA抗凝血
9.3试验程序 本方法的实验室生物安全管理见GB19489,实验室设置与管理见SN/T1193
9.3.1病毒RNA提取 9.3.1.1取n个灭菌的1.5mL离心管,其中"为被检样品、阳性样品与阴性样品的总数,在离心管上 做好标记
g.3.1.2将组织病料匀浆,加PBS液制成1;8至1:12悬液,2000r/min离心10 nmin,取上清备用 血液10001 r/min离心10min,细胞沉淀加等体积的无RNase的水混合备用
阴、阳性对照无需前 处理
9.3.1.3用市售核酸提取试剂盒提取病毒RNA
提取的RNA液冰上保存备用,若需长期保存应放置 于 -80C冰箱 9.3.2病毒双链RNA变性 在PCR反应管中加人所提取的核酸样品2AL,甲酰胺1AL,95C5min,速取出置冰上
g.3.3RT-PCR扩增反应 9.3.3.1RT-PCR反应体系配制 9.3.2的反应产物管内,按下列方法配制25LRT-PCR扩增反应体系 10×一步法RNAPCR缓冲液 2.5l 25mmol/LMg(C 5l 0mmol/LaNP混合物 2.54l 0U/aLRnase抑制剂 0.5l U/L.AMVRTaseXI.反转录酶 0.5Al 5 5U/ALAMIV-OptimizedTaq酶 0.5L 引物BTVM6-A和M6-B混合液 0.5L 无RNase水 0L 9.3.3.2RT-CR反应参数设置 将9.3.3.1的PCR反应管放人P(CR检测仪,按下列参数进行反应 10
GB/T18636一2017 第一阶段,48C30min,95C3min,1个循环; 第二阶段,94C30s,5530s,72C30s,40个循环 第三阶段,72仑10mim.4C保存
9.3.4nested-PCR扩增反应 9.3.4.1nestet-CR反应体系配制 在新的PCR管内,按下列方法配制25 tdPCR扩增反应体系: uneste 10×Taq缓冲液 2.5AL 0.12l 5U/LTaq酶 2.5mmol/L.dNTP混合物 2l 引物BTVM6-C和M6-D混合液 1 9.3.3.2的RT-PCR扩增产物 1 Al 双蒸水 18.5Al g.3.4.2nestet-CR反应参数设置 将PCR反应管放人PCR检测仪,按下列参数进行反应 第一阶段,94C2min,1个循环; 第二阶段,94C30s,51C30s,72C20s,30个循环; 第三阶段,72C10min,4" ,4C保存
9.3.5琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物 9.3.5.1取10ALnested-PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳
9.3.5.25V/em恒压电泳20min 9.3.5.3凝胶成像仪下观察电泳结果,拍照记录
9.4试验成立的条件 阳性对照样品出现100bp扩增条带,同时阴性对照样品无扩增目标条带 g.5结果判定 符合9.4的条件,被检样品扩增产物电泳出现100bp目标条带,判断为RT-PCR扩增阳性,表明样 品中存在蓝舌病病毒核酸
被检样品无扩增条带,判断为RT-PCR扩增阴性,表明样品中无蓝舌病病 毒核酸
10 荧光RI-PCR检测 10.1器材 10.1.1荧光PCR检测仪、高浊台式冷冻离心机、台式离心机、混匀器
10.1.2冰箱(4C、一20C和一80C) 10.1.3微量可调移液器(10AlL、,100AL,1000AL)及配套带滤芯吸头、离心管(2ml),PCR反应板或 PCR反应管、,荧光PCR反应板或荧光PCR反应管
0.2试剂 除特别说明以外,本标准所用试剂均为分析纯
1
GB/T18636一2017 0.2.1市售核酸提取试剂盒和荧光核酸扩增试剂盒均按说明书使用
0.2.2引物和探针;引物和探针的合成和配制见附录G 0.2.3阳性对照:BTV细胞培养物(浓度为100TCID.0,用细胞培养液或BTV阴性健康牛EDTA抗 凝血稀释 0.2.4阴性对照:细胞培养液或BTV阴性健康牛EDTA抗凝血
0.3试验程序 本方法的实验室生物安全管理见GB19489,实验室设置与管理见SN/T1193
0.3.1RNA提取 参照9.3.1进行
10.3.2荧光RT-PCR扩增 10.3.2.1 扩增试剂准备 取n个灭菌的1.5mL离心管,其中n为被检样品、阳性样品与阴性样品的和
从试剂盒中取出相 应的荧光RT-PCR反应液,RT-PCR酶混合液,在室温下融化后,2000r/min离心5s
按表2计算试 剂用量,吸取到一个离心管中,充分混合均匀
表2荧光RI-PCR反应体系配制表 体系组分 每个反应的用量/4l n个反应的用量/AL. RT-PCR混合物 2X 12.5 2.5×(n+1 25×RT-PCR酶混合物 刀十l n十1l 混合引物各20mo/儿 混合探针各34mol/1) n+1 总量 15,.5 15.5×(n十1 注:n为被检样品、阳性样品与阴性样品的和
0.3.2.2试剂分装 标记荧光PCR反应板(管),将混合好的反应液分装到PCR板(管)中,每孔(管15.5L
10.3.2.3病毒双链RNA变性 标记PCR变性板(管),将提取的核酸样品加人PCR变性板(管)中,每个核酸样品12L
95C 5min 变性,速取出置冰上
10.3.2.4加变性RNA于反应液 将9.5L变性后的RNA移加至对应的含有反应混合液的荧光PCR反应板(管)中,封板(或盖紧 管盖),2000r/min离心30s
0.3.2.5荧光Rr-PCR反应 将荧光PCR反应板(管)放人荧光PCR检测仪,按下列参数进行反应 第一阶段,42c10min,1个循环; 12
GB/T18636一2017 第二阶段,95C3min,1个循环; 第三阶段,95C5s,60C40s,40个循环 在第三阶段每个循环的退火延伸时收集荧光 10.4阔值设定 试验检测结束后,根据收集的荧光曲线和C值判定结果
直接读取检测结果
闵值设定原则根据 仪器噪声情况进行调整,以值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准
10.5试验成立的条件 0.5.1阴性对照无C值并且无扩增曲线
0.5.2阳性对照的C值应一28,并出现典型的扩增曲线
否则,此次试验视为无效
0.6结果判定 10.6.1阴性 无Ct值并且无典型扩增曲线,表明样品中无蓝舌病病毒核酸
10.6.2阳性 Ct值<35,且出现典型的扩增曲线,表明样品中存在蓝舌病病毒核酸 10.6.3可疑 如35
GB/T18636一2017 非特异性反应;在抗原孔与待检血清之间的沉淀线粗而混浊,或与标准阳性血清孔沉淀线交叉 并直伸孔边时则认为非特异性反应(见图6); 试验后24h、48h、72h判定为凡出现沉淀线均应记录,并判为阳性,凡72h仍未见沉淀反应 者判为阴性
图3阳性(1,3,5 图4阴性(1,3,5 图5弱阳性(5 图6非特异性(3,5 12 竞争酶联免疫吸附试验(C-ELISA 2.1器材 12.1.1 普通恒温箱(37)、水浴箱(37C)
12.1.2冰箱(4和一20C),微量振荡器、混合仪、酶标洗板仪及酶标读板仪
96孔中度吸附性酶标板.单道加样器(0.5l-10L5Al一0L..0ML一200ML.30l- 12.1.3 1000AL)及滴头,多道加样器及滴头、50nml三角烧瓶
12.2试剂 2.2.1阳性对照血清:BTV抗体阳性的牛血清或羊血清,中和抗体效价1:640
用1:10、1:80僧 稀释作为强、弱阳性对照血清
2.2.2阴性对照血清;蓝舌病抗体阴性的牛血清或羊血清,试验中以1:l0稀释
2.2.3单克隆抗体(单抗);鼠抗蓝舌病病毒VP7单克隆抗体(BTV-Mab)
2.2.4酶结合物;山羊抗鼠免疫球蛋白G(Ig(G)辣根过氧化物酶结合物,一20C保存,使用前解冻,置 4C备用
2.2.50.05mol/几L碳酸盐缓冲液(pH9.6),乙酸-柠檬酸盐缓冲液(pH6.0),磷酸盐缓冲液(PBST 四甲基联苯胺储存液、30%过氧化氢(H.O).含1%脱脂奶的PBsT(PBST-SM)、1mol/硫酸
配制 方法见附录C 2.3试验程序 12.3.1 包被抗原 用碳酸盐缓冲液将抗原稀释到指定的工作浓度,加人96孔中度吸附性酶标板,每孔50l,4C过 夜
用PBST洗板5次,铝箔袋抽真空密封4C保存
2.3.2加样 2.3.2.1待检样品;将待检血清用PBST-SM作1:10稀释,每份样品2孔,每孔50L
加人酶标板
2.3.2.2对照样品;将强阳性血清,弱阳性血清和阴性血清分别用PBST-SM作1:10稀释,每个对照 样品设2孔,每孔加50lL
空白对照两孔,每孔加PBST-SM50L
2.3.3反应 置37C温箱振荡1h 15
GB/T18636一2017 12.3.4加BIV-Mab 用PBST-SM将BTV-Mab稀释到指定的工作浓度,每孔加50AL
37C温箱振荡30 min
12.3.5加酶结合物 用PBST-SM将酶结合物稀释到指定的工作浓度,每孔加50AL
37C振荡30min 12.3.6洗板 用PBST洗板5次,在吸水纸上拍干
12.3.7加底物和终止液 将底物按比例稀释(取9.7mL乙酸-柠檬酸缓冲液,分别加人300L四甲基联苯胺储存液和5AL 30%过氧化氢),每孔加100AL,置37C避光反应10min15min,每孔加人1004L2mol/儿硫酸终止 反应 12.4读数和抑制率计算 2.4.1在酶标读板仪读取450nm波长的光度吸收值(ODm). 12.4.2抑制率(%)(I)按式(1)计算 -)m 式中 样品光度吸收值; A 标准阴性光度吸收值
12.5试验成立的条件 阴性对照OD应在范围0.8~1.4内;强阳性抑制率应大于85%;弱阳性抑制率应在35%一50% 之间
如果实际值与此值偏离较大,则不具备判定条件
12.6结果判定 样品的抑制率(I)大于60%判为蓝舌病病毒抗体阳性;小于40%判为阴性;40%60%判为弱阳 性,应重复,如仍为此值可定为弱阳性
13 诊断结果判定 13.1疑似病例 符合没4者
13.2确诊病例 疑似病例和4.5或9.5或10.6中任何一项阳性者
13.3隐性感染 符合4.5或9.5或10.6或11.4或12.6中任何一项阳性者,但不符合3.2者
第11章(AGID)的方法存在特异性差和结果判读主观的缺点,建议对l1.4检测阳性动物用第12 章(CELISA)的方法进行验证
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GB/T18636一2017 附 录 A 规范性附录 细胞培养液的制备 A.1MEM营养液的配制 MEM干粉 9.6g 去离子水 1000mL 充分溶解后经0.224m孔径微孔滤膜滤过除菌
细胞培养生长液是在滤过除菌营养液的基础上,按10%加人灭活犊牛血清和100IU/m青霉素 和链霉素,然后用7.5%NaHcO溶液调整pH值至7.2 细胞培养维持液是在滤过除菌营养液的基础上,按2%加人灭活犊牛血清和100IU/mL青霉素和 链霉素,然后用7.5%NaHCO溶液调整pH值至7.2
A.2NM199营养液的配制 M199干粉 9.Gg 1000mL 去离子水 充分溶解后经0.22m孔径微孔滤膜滤过除菌
细胞培养生长液是在滤过除菌营养液的基础上,按10%加人灭活犊牛血清和100IU/mL青霉素 和链霉素,然后用7.5%NaHco溶液调整pH值至7.2
细胞培养维持液是在滤过除菌营养液的基础上,按2%加人灭活犊牛血清和100IU/mL青霉素和 链霉素,然后用7.5%NaHcOo溶液调整pH值至7.2
胰酶消化液配制 氯化钠纳(NaCI 8g 氯化钾(KCI 0.4g 磷酸二氢钾(KHPO 0.4g 磷酸氢二钠(NaHIPO12HO 0.08g 碳酸氢(NaHCO. 0.35总 EDTANag 0.2g Trypsin 2.5g 用去离子水定容至1000mL.,静置4h,用0.224m孔径微孔滤膜滤过除菌
分装-20c保存
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GB/T18636一2017 附录 B 规范性附录) 免疫酶染色试验用溶液的配制 PBsT B.1 氯化钾(KCI 0.20" 磷酸氢二钠(NagHPO 2.29g 磷酸二氢钾(KH,PO 0.20" 加水至 1000ml 吐温-20 0.50mL B.2 1%明胶PBST 称取明胶1g,加PBST100m溶解,4C保存备用
B.33-氨基-g-乙基咔哩(AEC)液 20 3-氨基-9-乙基咔陛(AEC mg 3ml 二甲基亚碱(DMsO) 将AEC用DMsO溶解后,加至50ml乙酸盐缓冲液(pH6.0)中,再加30%过氧化氢30L.充分 混匀备用该溶液不适宜保存,现用现配.
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GB/T18636?2017 ? C 淶?? ???к? c.10.05mol/L?λ?(p9.6 ?(Na.cO 1.59g ?(NaHcO. 2.93g 0.10g ? 1000mL 4C汸á C.2-?? ?: 8.2 1000m ??? ?: 2.10 g 100mL ?? ??pH9.6,?4C档 ??(TMIB)? ?3.y,5,;'-??30mg1o0mL?,?С???,?? ?档 C.410PBST ?(NaCI 80g ?(KCl 2g (Na;HPO. 22.9 g (KH.PO. 2g -2o 5ml ? l000ml ?,·?á C.5PBS?? 100 10PBST ml 900 ?? mml 19
GB/T18636?2017 C.6PBST-SM PBST 100mL ?? 1g 2mol/ 160mL ??? 20ml ? C.80.1%??? 1.0g ?(naphthaleneblack 60.0ml (?) 13.6g ? 100ml 20
GB/T18636一2017 附 录 D 资料性附录 Karber方法 Karber法的计算见式(D.1)用常用对数(lIg)计算 lgTCID(或LD.,EIDm)=L十d(s一0.5) D.1 式中 病毒的最低稀释度的对数(Ig); -稀释系数,即组距; 细胞病变比值的和
以下例(见表D.1)说明: 表D.1病毒cID.滴定 病毒稀释度 病毒稀释度对数(Ilg 细胞病变比值 10 4/4 l0 10-" 4/4 10- 3/4 10- 2/4 -6 10-？ 0/4 本例L=一2.d=-1,=4/4十4/4十4/4+3/4十2/4+0/4=4.25 代人公式:lgTcID=一2+(一1×(4.25一0.5)》 =一5.75 TCID=10-5破 查反对数表可得TCID.=1/560000 如各稀释度均为0.1mL,那么1mL中含5600000个TCID或106.石个TCIDn
病毒毒价通常以每毫升含多少TCID.或LD,ELDm)表示,本例病毒毒价为每毫升含5600000个
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GB/T18636?2017 ? 淶??) ???? E.1???? ??0.2cm??,С103.4kPa30min?,??á E.20.1%? 0.1g????,103.4kPa?30min,4C?汸á E.34%?? ??4??100mL?,103.4kPa?30 C档 min.4 22
GB/T18636一2017 附录 规范性附录 RT-PCR试验用溶液和引物的配制 F.150xIAE电泳缓冲液 Tris 242g Na;EDTA2H.O 37.2g 醋酸 57.1mL 去离子水 1000mL F.21×IAE 50×TAE 20m 1000mL 去离子水 F.3琼脂糖凝胶 琼脂糖粉末 2g 1×TAE电泳缓冲液 00ml. 微波炉中溶解后,冷却至60笔左右,加人澳化乙锭贮液使其最终浓度为0.5gml,并充分混匀
F.4RT-PCR引物序列合成及配制 表F.1Rr-CR引物序列合成及配置 用途及检测靶基因位置 引物名称 序列(5'-3') BTVM6-AGTTCTCTAGTTGGCAACCACC 用于RT-PCR扩增BTVRNA6片段的第11一284位核苷酸 BTVM6-BAAGCCAGACTGTTTcCCcGAT 用于RT-PCR扩增BTVRNA6片段的第11284位核酸 BTVM6-CGCAGCATTTTGAGAGAGCGA用于Nested-PCR扩增BTVRNA6片段的第170270位核昔酸 BTVM6-DCCCGATCATACATTGCTTCCT用于Nested-PCR扩增BTVRNA6片段的第170270位核昔酸 注1引物可由生物公司合成,纯度为HPIC级
注2:用DEPC水溶解,稀释引物
将RT-PCR扩增用引物BTVM6-A和BTVM6-B混合,终浓度为各20mol/I; 将NestedPCR扩增用引物BTVM6-C和BTVM6-D混合,终浓度为各20mol/L
一20C保存备用. 23
GB/T18636一2017 附 录 G 规范性附录) 荧光RI-PCR引物和探针的合成与配制 引物和探针的序列、合成与配制见表G,1
表G.1引物和探针的序列合成与配制 引物或探针名称 序列(5'-3' 粑基因中的位置 GCGTTCGAAGTTTACATCAAT BTVrsa291F 291-31l BTVrsa387R CAGTCATCTCTCTAGACACTCTATAATTACG 387-357 BTVuni291F GCTTTTGAG6 GTGTAcGTGAA 291-31l1 BTVuni381R TcTcccTTG;AAAcTcTATAATTAcG 381-357 BTV-1-RSA341-320 FAM-CGGATCAAGTTCACTCCACGGT-BHQ1 341-320 FAM-TccTccGGATCAAGTTCACTcCAC-BHQ1 346-323 BTV-Sl-346-323 注1:引物BTVrsa291F和BTVrsa387R主要用于扩增东方型BTV毒株的RNA1目标片段,探针BTV-S1 RSA341-320主要用于检测东方型BTV TV毒株的RNA 1的扩增片段 注2:引物BrVuni291F和Tvuni381R主要用于扩增西方型;TV毒株的RNA1目标片段,，探针BTv-s1 RSA341-320主要用于检测西方型BTV毒株的RNA1的扩增片段
注3引物和探针可由生物公司合成,纯度为HPLC级 注4:合成好的4条引物用无RNase的水溶解,稀释并混合,浓度为各20Hmol/L,一20保存备用
注5合成好的2条探针用无RNase的水溶解,稀释并混合,浓度为各3molL,-20笔保存备用 24
GB/T18636一2017 附 录 规范性附录 琼脂平板的制备 琼脂糖 0.9g 生理盐水 100mL 按1:10000比例加人叠氮钠或硫柳汞,调整pH值至7.！~7.6之间,103.4kPa高压消毒20min 融化的琼脂待冷至45C一50C时,倒人直径9cmm平皿中,每平皿约15ml,厚度约为4mm,待琼脂凝 固后置4C保存备用
蓝舌病诊断技术GB/T18636-2017
蓝舌病是一种由蓝舌病毒引起的急性传染病，主要发生在家畜中。为了有效地控制和预防蓝舌病的传播，必须采用准确、可靠的诊断技术进行检测和监测。
为此，国家标准化管理委员会于2017年发布了《蓝舌病诊断技术规范》（GB/T18636-2017）。该规范对蓝舌病的诊断方法、样本收集、实验室诊断等方面进行了详细说明，旨在提高蓝舌病的诊断准确性和一致性。
根据GB/T18636-2017，蓝舌病的诊断应采用多种方法相结合的方式进行，其中包括临床观察、病原学检测、血清学检测和分子生物学检测等。每种方法都有其特点和适用范围。
临床观察是一种简单有效的诊断方法，通过观察感染动物的临床症状、体征和病程等来判断是否患有蓝舌病。病原学检测则可以直接从感染动物的血液、组织或其他样本中检测到蓝舌病毒，是一种非常准确的诊断方法。血清学检测和分子生物学检测则可以检测到动物体内对蓝舌病毒产生的免疫反应和病毒核酸等关键指标，具有高度灵敏度和特异性。
此外，GB/T18636-2017还对样本采集、实验室诊断流程、质量控制等方面进行了详细规定，以确保诊断结果的准确性和可靠性。
综上所述，蓝舌病诊断技术规范GB/T18636-2017为蓝舌病的诊断和监测提供了科学的、标准化的方法和流程，有助于提高蓝舌病防控工作的效果和水平。
