GB/T34750-2017
副猪嗜血杆菌检测方法
Detectionmethodsforhaemophilusparasuis
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）11.220
- 实施日期2018-05-01
- 文件格式PDF
- 文本页数17页
- 文件大小1.15M
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副猪嗜血杆菌检测方法
国家标准 GB/T34750一2017 副猪嗜血杆菌检测方法 Deteetionmethodsforhaemophilusparasuis 2017-11-01发布 2018-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/34750一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由农业部提出
本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口
本标准起草单位:河南省动物疫病预防控制中心、河南省农业科学院畜牧兽医研究所、河北农业大 学动物科技学院,山东省农业科学院畜牧兽医研究所
本标准起草人:吴志明、闫若潜、张健、赵明军、赵雪丽、宋勤叶、徐引弟、王东方、王淑娟、安春霞、 刘梅芬、张盼盼谢彩华、高凤山、方先珍、吴家强、拜廷阳、王一、刘淑敏
GB/34750?2017 ??? Χ ?涨?????PCR???PCR? ????,??,?,?????,?,? ?и???? ?? bp;(BasePair) DNA;?(DeoxyribonueleicAceid dNTPs,?(DeoxyribonucleosideTriphosphates) MGB;С(MinorGrooveBinder) NAD;(NicotinamideAdenineDinucleotide) PBS;λ?(PhosphateBufferSolution) PCR:????(PolymeraseChainReaction) Taq?;TaqDNA??(TaqDNAPolymerase) TE;Tris-EDTA?(Tris-EDTABuffer) TsA.????(TywiesoAer TSB:???(TrypticSoyBroth 3 3.1?? 3.2? 3.3?? 3.4??? 3.5rPCR? 3.6??(12000x). 3.7?????? 3.8? 3.9??(0.5ul~10L;2L?20AL;20ulL?200L;l00L1000L. 3.10??в 3.11??(?). 3.12????PCR? ? 4.11.5mL???
GB/T34750一2017 4.20.2mLPCR薄壁管或八联管
5 试剂 5.1TSA培养基和TSB培养基(见附录A)
5.2NAD贮存液(见附录A),2C~8C条件下保存
5.3革兰氏染色试剂含草酸铵结晶紫染液、卢戈氏(Lugol)碘液、95%乙醇和沙黄(蕃红)染液,常温条 件下保存
5.4葡萄糖、蔗糖,果糖、乳糖、半乳糖,木糖等微量生化鉴定管,2C一8C条件下保存
5.53%过氧化氢,0.8%碱胺酸冰醋酸溶液,0.5%a-綦胺乙醇溶液,0.1%盐酸二甲基对苯二胺(见附录 A),常温条件下保存
5.6消化液I和TE缓冲液(见附录B),常温条件下保存
5.71×TAE核酸电泳缓冲液,酚-氯仿-异戊醇混合液(25十24十1),0.01mol/L(pH7.2)的PBS,阿氏 液等试剂(见附录B),6×电泳上样缓冲液,75%乙醇,以上试剂2C8C条件下保存
5.8组织悬液、消化液I(见附录B),异丙醉,DNA标准分子量,置一20C保存
5.9阳性对照、阴性对照(见附录B)
5.10巢式PCR扩增用上、下游引物序列(见附录C). 5.11副猪嗜血杆菌巢式PCR检测反应体系(见附录D)
5.12副猪嗜血杆菌实时荧光PCR扩增用上、下游引物及探针序列见附录C)
5.13副猪嗜血杆菌实时荧光PCR检测反应体系(参见附录E)
细菌分离与鉴定 6 6.1样品的采集 无菌采集疑似副猪嗜血杆菌感染病死猪的肺脏、心脏、脑等新鲜组织,胸腔,腹腔、心包积液或关节 液,抗凝血等样品
采集或处理的样品在2C8C条件下保存应不超过24h
采集的样品密封后,采 用保温壶或保温桶加冰密封,运送到实验室
6.2分离培养 6.2.1在生物安全柜中用接种环无菌蘸取样品划线接种于TSA固体培养基上,37C培养24h48h, 使之形成菌落,以供鉴定用
6.2.2取6.2.1中培养的针尖大小(直径约1mm~2mm)圆形,隆起,光滑湿润,无色透明边缘整齐 的小菌落,在TSA固体培养基上进行划线接种纯培养,37笔培养24h48h后,出现上述小菌落
6.3涂片染色镜检 6.3.1涂片在载玻片上滴加1~2滴灭菌蒸懈水后,挑取纯培养的小菌落与灭菌蒸僧水混匀并涂成淋 菌膜
6.3.2干燥将涂片于空气中自然晾干
6.3.3固定将已干燥的载玻片涂面朝上,在酒精灯火焰上通过5次一6次进行固定
6.3.4染色采用革兰氏染色法进行染色,具体操作按照革兰氏染色试剂盒说明书进行,置1000倍 10×100光学显微镜下观察
6.3.5镜检副猪嗜血杆菌为革兰氏染色阴性短杆状或球杆状小杆菌,菌体大小不等,约0.5m× 1.5pm一2.0 Mm)，以纤细杆状居多,无鞭毛,不形成芽抱
GB/34750一2017 6.4“卫星生长现象"试验 在生物安全柜中无菌挑取纯化培养后的单个菌落,平行划线于无NAD的绵羊鲜血平板上，再挑取 金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线,37C条件下培养24h48h后,观察菌落生长情况,副猪嗜血杆 菌无溶血,并具有“卫星生长现象”金黄色葡萄球菌周围的副猪嗜血杆菌菌落较大,而远离葡萄球菌的 副猪嗜血杆菌菌落较小)
6.5增殖培养 在生物安全柜中无菌挑取具有“卫星生长现象”且不溶血的单菌落在TSA固体培养基上进行再次 纯培养后,挑取单个菌落接种于5mlTSB液体培养基中,37C培养24h48h后,液体变混浊,判为 增殖培养成功
6.6生化鉴定 6.6.1糖类发酵试验 在生物安全柜中无菌将生化鉴定管打开,每管按10"g/ml终浓度加人NAD,用接种针无菌挑取 6.5中增殖培养的菌液分别接种于葡萄糖、乳糖、半乳糖、甘露醇木糖等微量生化鉴定管中,37 C培养 24h,观察结果,发酵葡萄糖、半乳糖,不发酵乳糖,甘露醇,木糖者为阳性,否则为阴性
6.6.2触酶试验 吸取6.5中增殖培养的菌液1滴于洁净玻片上,然后滴加1滴3%过氧化氢混匀,30s内观察反应 结果,立即出现大量气泡者判为阳性,无气泡者判为阴性
6.6.3硝酸盐还原试验 将0.8%磺胺酸冰醋酸溶液和0.5%a-莽胺乙醇溶液各0.2mL混合,取混合试剂0.1mL加至6.5 中增殖培养菌液中,立即观察结果,呈现红色者为阳性,无红色出现者为阴性
6.6.4尿素酶试验 吸取6.5中增殖培养的菌液100ML接种于尿索酶试验液体培养基管中,摇匀,于37C培养 0min，60min和120min后分别观察结果,粉红色者判为阳性,不变色者判为阴性
6.6.5氧化酶试验 吸取6.5中增殖培养菌液1滴于洁净载玻片上,加盐酸二甲基对苯二胺溶液1滴,2min内观察结 果,呈现鲜蓝色者判为阳性,2nmin内不变色者判为阴性
6.6.6全自动微生物鉴定仪鉴定 按照全自动微生物鉴定仪使用说明书将6.5中增殖培养的细菌进行微生物鉴定
6.6.7结果判定 糖类发酵试验结果为发酵葡萄糖、半乳糖,不发酵乳糖、甘露醇,木糖;触酶、,硝酸盐还原试验结果均 为阳性;尿素酶、氧化酶试验结果均为阴性的判定为副猪嗜血杆菌阳性;或全自动微生物鉴定仪鉴定结 果为副猪嗜血杆菌阳性的,判定为副猪嗜血杆菌阳性
GB/T34750一2017 副猪嗜血杆菌巢式CR检测 7.1样品的采集,处理、存放和运送 7.1.1样品的采集和处理 7.1.1.1 组织样品 采取有明显病变的肺脏、心脏、脑等新鲜组织样品
用无菌剪刀和锻子剪取待检样品0.5g左右于 组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨,加人0.3mL 0.5mLPBS混匀,将组织悬液转人无菌离心管 中,编号备用
7.1.1.2积液 用无菌注射器采集胸腔、腹腔积液或关节液2mL~3mL,转至无菌离心管中,编号备用
7.1.1.3抗凝血 用无菌注射器先吸人抗凝剂(阿民液)2ml一3mL自耳静脉或前腔静脉采集等量血液,快速混匀 后转人无菌离心管中,编号备用
7.1.1.4增菌培养物 用无菌滴头吸取增菌培养物500"L于无菌离心管中,编号备用
7.1.2存放和运送 采集或处理的样品在2C8C条件下保存应不超过24h
采集的样品密封后,采用保温壶或保 温桶加冰密封,运送到实验室
7.2样品DNA的制备 警示:酚-氯仿-异戊醇具有毒性,小心操作！ 7.2.1取1.5ml无菌离心管,于各管中分别加人待测样品、阴性对照、阳性对照各100AL,再加人 500l消化液I和10AL消化液I,吸头反复吸打混匀(一份样品换用一个吸头);置55C水浴 30min1h
7.2.2分别加人500L盼-氯仿-异戊醇混合液,混匀,于4C条件下12000r/min离心l0nmin. 7.2.3分别吸取离心后的上清液转移至新的1.5ml无菌离心管中(注意不要碰到中间层),加人等体 积-20预冷的异丙醉,混匀,室温放置15min
7.2.44C条件下12000r/min离心15min(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)
轻轻倒去上 清液,倒置于吸水纸上,吸干液体,不同样品应在吸水纸不同地方吸干
加人700lL75%乙醇,轻轻 混匀
7.2.54C条件下120o0!/min离心5min(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)
轻轻倒去上清 液,倒置于吸水纸上,吸干液体,不同样品应在吸水纸不同地方吸干
7.2.64C条件下120o0:/nmin离心30s,将管壁上的残余液体甩到管底部,用微量加样器尽量将其吸 干，一份样品换用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀一面,真空抽干3min一5min或室温干燥10min. 7.2.7加人10ALTE缓冲液,轻轻混匀,溶解DNA,2000r/min离心5s,置-20冻存备用 7.2.8样品DNA的制备可采用上述提取方法也可采用商品化的试剂盒提取
GB/34750一2017 7.3巢式PCR扩增 7.3.1第一轮CR扩增 7.3.1.1配制PCR反应体系I见附录D),室温融化后,瞬时离心使液体全部聚集在管底部,向每管中 加人7.2.7中相应DNA2AL,经充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底
7.3.1.2PCR扩增条件95C预变性5min后,9445s,58C45s,7245s共35个循环,最后 72笔延伸10min
反应结束后取出置于2C8笔条件下保存 7.3.2 第二轮PCR扩增 7.3.2.1配制PCR反应体系I室温融化后,瞬时离心使液体全部聚集在管底部,向每管中加人7.3.1.2 中相应的PCR产物2AL,经充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底
7.3.2.2PCR扩增条件同7.3.1.2. 7.4CR扩增产物的电泳检测 称取12反琼脂糖加人100mL核酸电泳缓冲液中加热至沸腾,充分游化后放凉至50C左右,加人 核酸染色剂10AL,混匀,倒人胶槽制备凝胶板
在电泳槽中加人1×TAE核酸电泳缓冲液,使液面刚 刚没过凝胶
分别取样品PCR扩增产物、阴/阳性对照扩增产物10L和2L6×电泳上样缓冲液混 合后,分则加样到各凝胶孔中,取5LDNA分子量标准加到一凝胶孔中
5Vcn恒压下电30mn 左右,将电泳好的凝胶置紫外投射仪或凝胶成像系统中观察结果,进行判定并做好试验记录
7.5结果判定 7.5.1试验结果成立条件 副猪嗜血杆菌阳性对照的巢式PCR扩增产物电泳后在312bp位置出现特异性条带,同时阴性对 照的PCR扩增产物电泳后没有任何条带(参见附录F),则试验结果成立;否则结果不成立
7.5.2阳性判定 在试验结果成立的前提下,如果样品的PCR产物电泳后在312bp位置上出现特异性条带,判定为 副猪嗜血杆菌核酸检测阳性
7.5.3阴性判定 在试验结果成立的前提下,如果样品在312bp位置未出现特异性条带,判定为副猪嗜血杆菌核酸 检测阴性
副猪嗜血杆菌实时荧光PCR检测 8.1样品的采集、处理、存放及运送 样品的采集、处理、存放及运送应符合7.1的规定
8.2样品DNA的制备 样品DNA的制备应符合7.2的规定
GB/T34750一2017 8.3实时荧光CR扩增 8.3.1在检测区配制与8.2中相同数量的实时荧光PCR反应体系,向每管中加人8.2中相应DNA 2AL，充分混匀后并使液体全部聚集于管底,按照要加样品的顺序摆放好实时荧光PCR反应管
8.3.2将8.3.1中加样后的实时荧光PCR反应管放人实时荧光定量PCR仪内并记录样本摆放顺序
8.3.3反应参数设置;第一阶段,预变性94C/5" min;第二阶段,94C/30s,60/30s,40个循环,在 每个循环的延伸结束时进行荧光信号收集,荧光模式设为FAM/NONE双标记模式
8.4结果判定 8.4.1结果分析条件设定 读取检测结果,阔值设定原则以值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点,不同仪器可根 据仪器噪音情况进行调整
8.4.2 质控标准 围性对照的检测结果应无特定的扩增曲线,且C值>32.0或无;用性对照的c，值应二29.0,且出 现特定的扩增曲线(参见附录F);如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件,此次实验视为无效
8.4.3结果描述及判定 8.4.3.1 阳性 C值<29.0,而且出现特定的扩增曲线,则判定为阳性
8.4.3.2阴性 -32.0或无,并且无特定的扩增曲线,则判定为阴性
8.4.3.3可疑 29.0
GB/T34750?2017 ? B 淶?? ???PCR???CR? ?I B.1 Tris-HCl(pH8.0)?10mmol/L;EDTA(pH8.0)?25nmmol/L;SDS?2004g/mL NaCI?100mmol/I B.2TE? TisHcl(pH8.0)??10molL,EDTA(pH8.0)??1mol/L 1IAE?? B.3 Tris,24.2g;,5.71mL;0.5mol/LEDTA(pH8.0),l0ml;??100mL.,?? ??50?,?1TAE?? B4-?-?? Ts?-·?5" :24:1?? B.50.01mo/L(pH7.2)λ?(PBs) B.5.1A?(0.2mol/??):NaH,POH,O27.6g,??, 1000ml B.5.2B?(0.2mol/L??):NaHPO12HO71.6g,???, 1000mL B.5.30,01mol/LPHBS:A?14ml,B?36ml,NaCl8.5g,?1000mL 121C?15min,4C汸á B.6? 2.05,0.8g,0.055g,0.42g,?100mL.? pH6.1,69kPa,15min?,4C汸á B.7?? 0.01molI.PBS?ù(2000IU/mL),ù(2mg/mL),ù(50pg/ml) ù(1000IU/mL),?20汸á
GB/34750一2017 B.8消化液的配制 称取100mg蛋白酶K溶解于5ml灭菌水中 B.9阳性对照 灭活的副猪嗜血杆菌标准菌株
B.10阴性对照 灭菌的TSB培养基
GB/T34750一2017 录 附 C 规范性附录) 副猪嗜血杆菌巢式PCR和实时荧光PCR检测方法所用引物序列 C.1副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增用上、下游引物序列 副猪嗜血杆菌巢式CR扩增用上、下游引物序列见表C.1
表c.1副猪嗜血杆菌巢式CR扩增用上、下游引物序列 引物名称 浓度/(mol/1L 扩增片段大小 引物序列 P1/P2引物对 -轮CR扩增上游引物P1 5'-TcGGTGATGAGGAAGGGTGA3 20 扩增片段 第 20 -轮PCR扩增下游引物P2 5'-TCGTCACCCTCTGTATGCAC-3 820bp; P3/P引物对 20 第二轮PCR扩增上游引物P3 5'-AGGGTGGTGTTTTAATAGAGCAC-3" 扩增片段 5'-CACATGAGcGTcCAGTATTTTcC-3 第二轮PCR扩增下游引物P4 20 312bp C.2副猪嗜血杆菌实时荧光PCR检测方法所用上、下游引物及探针序列 副猪嗜血杆菌实时荧光PCR检测方法所用上、下游引物及探针序列见表C.2
表c.2副猪嗜血杆菌实时荧光CR扩增用上、下游引物及探针序列 引物名称 浓度/mol/1) 引物序列 扩增片段大小 实时荧光PCR扩增上游引物 5'-AGcAGccGcGGTAATAcG 20 -3 FQ-P1 P/P?引物对扒 增片段 实时荧光PCR扩增下游引物 20 5'-cCTTTAcGcccAGTCATTccC-3" 58bp FQ-P2 实时荧光CR扩增MGB探针 10 FAM5'-AGGGTGCGAGCGT-3'-MGB 0
GB/34750一2017 录 附 D 规范性附录 副猪嗜血杆菌巢式PCR反应体系组成说明及使用注意事项 D.1检测反应体系组成 检测反应体系组成见表D.1 表D.1副猪嗜血杆菌巢式PCR检测反应体系组成 组成成分 数 量 CR反应体系1 20 管(23L/管) CR反应体系l 20管(23L/管) 阳性对照 300ML 阴性对照 300Al 12mL 消化液I 消化液 240Al 12 酚-氧仿-异戊醇 ml 异丙醇 5mL 75%乙醇 9 ml TE缓冲液 6004l 5倍TAE电泳缓冲液 20ml 核酸染色剂 50 上样缓冲液 50 D.2说明 D.2.1PCR反应体系I成分:10×PCR缓冲液(含Mg+),2.5L;2.5mmol/儿LdNTPs,2AL;P1 0.5L，P2.,0.5AL;ExTuqDNA聚合附,0.25L(sU);灭菌双蒸水,17.5AL总体积为23儿 D.2.2PCR反应体系I成分:10×PCR缓冲液(含Mgt),2.54L;2.5nmmol1dNTPs,2Al;P3 0.5AL，P4,0.5AL;ExTagDNA聚合酶,0.25AL(SU);灭菌双蒸水,17.25AL;总体积为23L D.2.3PCR反应体系中含副猪嗜血杆菌标准株特异性引物对、ExTaq酶及各种离子
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GB/T34750一2017 D.3使用时的注意事项 D.3.1由于阳性样品中模板浓度相对较高,注意检测过程中不得交叉污染 D.3.2注意防止试剂组分污染,不同检测体系之间的成分勿混用
D.3.3请按照说明书要求分别在4C、-20C保存不同的试剂,试剂盒有效期为6个月
使用时在室 温下融化,暂放置冰上,使用后立即放回
D.3.4PCR反应体系应避免反复冻融,在使用前应瞬时离心,以保证反应液集中在管底
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GB/34750一2017 附录E 资料性附录 副猪嗜血杆菌实时荧光PCR检测反应体系组成、说明及使用注意事项 E.1检测反应体系组成 检测反应体系组成见表E.1
表E.1副猪嗜血杆菌实时荧光CR检测反应体系组成 组成 数量 12m 消化液1 240l 消化液 酚-氯仿-异戊醇 12ml 异丙醇 15ml 75%乙醇 20ml 600Ml TE缓冲液 荧光R反应液 360Al. Ex Tu藤 6AL 阴性对照 3004L 阳性对照 300Al E.2说明 荧光PCR反应液成分;10×PCR缓冲液(含Mg+),2.5AL;2.5mmol/LdNTPs,2L;ExTag DNNA聚合酶,0.25AL(5U);FQ-Pl,0,54L;FQ-P2,0.54L;探针,lAL;灭菌双蒸水,16.25AL;总体积 为23l
E.3使用时的注意事项 由于阳性样品中模板浓度相对较高,注意检测过程中不得交叉污染
E.3.1 E.3.2注意防止试剂组分污染,不同检测反应体系之间的成分勿混用
E.3.3按照说明书要求分别在2C8C、一20C保存不同的试剂,试剂盒有效期为6个月
使用时 在室温下融化,暂放置于冰上,使用后立即放回
E.3.4反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄漏污 染仪器
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GB/T34750?2017 ?F ?? ???PCR?????PCR? F.1???PCR?? ???PCR???F.1 2000bp 1000p 00p -312bp 300bp 200bp 00bp ?: M -100bpDNA? ??? ?? ?F.1???PCR? F:.2?????CR? ?????PCR??F.2 14
GB/34750一2017 4000 3500 3000 2500 2000 阳性对照 500 000 500 阴性对照 293133 3537 39 13 21 25 27 15 19 23 -500 循环数 图F.2副猪嗜血杆菌实时荧光CR扩增曲线图
副猪嗜血杆菌检测方法GB/T34750-2017
副猪嗜血杆菌是一种革兰氏阴性杆菌，可引起副猪链球菌病，是一种严重的猪源性呼吸道疾病。为了保障猪肉产品的质量安全，必须对其进行检测。目前，GB/T34750-2017是我国针对副猪嗜血杆菌检测的标准。 根据GB/T34750-2017标准，副猪嗜血杆菌可以通过培养和PCR两种方法进行检测。其中，培养法包括直接培养和预处理培养两种方法。直接培养法指将样品直接接种到富含副猪嗜血杆菌生长所需营养物质的培养基上。预处理培养法则需要对样品进行预处理，如采用高温杀菌等方法，以增加检测的准确性。 除了培养法外，GB/T34750-2017标准还规定了PCR方法进行副猪嗜血杆菌检测。PCR方法可以通过扩增DNA片段来检测样品中是否含有副猪嗜血杆菌。与传统培养法相比，PCR方法具有灵敏度高、结果快速等优点。 在实际操作中，需要注意以下事项。首先，样品的采集和保存要严格按照标准要求进行。其次，在进行检测前，应该对试剂盒和仪器进行检查，确保其正常工作。最后，在操作过程中，应该严格遵守安全操作规程，尽量避免对实验人员和环境造成污染。 总之，副猪嗜血杆菌是一种危害较大的猪源性病原体，必须对其进行检测以保障猪肉产品的质量安全。GB/T34750-2017是目前我国针对副猪嗜血杆菌检测的标准，其中包括培养法和PCR法两种方法。在进行检测时，需要注意操作规程，确保结果准确可靠。
