GB/T34720-2017
山羊接触传染性胸膜肺炎诊断技术
Diagnostictechniquesforcontagiouscaprinepleuropneumonia
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）11.220
- 实施日期2018-05-01
- 文件格式PDF
- 文本页数14页
- 文件大小958.96KB
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山羊接触传染性胸膜肺炎诊断技术
国家标准 GB/T34720一2017 山羊接触传染性胸膜肺炎诊断技术 Diagn0stietechniquesforcontagiowseaprinepleuropneumonia 2017-11-01发布 2018-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T34720一2017 引 言 本文件的发布机构提请注意,声明符合本文件时,可能涉及附录D与《一种用于检测山羊支原体山 羊肺炎亚种抗体的间接血凝诊断试剂盒》相关的专利的使用
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GB/34720一2017 山羊接触传染性胸膜肺炎诊断技术 范围 本标准规定了山羊接触传染性胸膜肺炎临床症状、病理变化、流行病学临床诊断及病原分离鉴定、 PCR、间接血凝试验等实验室诊断的技术要求
本标准适用于山羊接触传染性胸膜肺炎的诊断
缩略语 下列缩略语适用于本文件
bp;碱基对(BasePair) tagiousCaprinePleuropneumonia) CCPP:山羊接触传染性胸膜肺炎(Cont CcCU;颜色变化单位(ColorChangeUnit DNA:脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid NTPs;脱氧核糖核苷三磷酸(DeoxyribonucleosideTriphosphates) lHIA:间接血凝试验(IndirectHeamagglutionAssay Mecp;山羊支原体山羊肺炎亚种(M ycoplasnacapricoluumsubsp.capripneunoniae) MTA:改良Thiaucourt氏琼脂培养基(ModifiedThiaucourt'sAgar MTB:改良Thiaucourt氏肉汤培养基(ModifiedThiaucourt'sBroth PBS:;磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferSolution PCR;聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction) PPL.O;类胸膜肺炎微生物(Pleuropneumonia-likeOranism) TAE:核酸电泳缓冲液(Tris-Aceticacid-EDTA Taq酶:TaqDNA聚合酶(TaqDNAPolymerasey 临床诊断 3.1临床症状 3.1.1急性病例:潜伏期2d一28d
初期病羊咳嗽、不愿走动并出现发热(达41C或以上),逐渐出现 呼吸急促(有时会发出呼噜声)和剧烈咳嗽等症状,发病后期,病羊四肢外展站立且脖颈伸直,口鼻持续 流涎,鼻孔逐渐被脓性分泌物堵住,舌头伸出,死亡 3.1.2慢性病例;病程持续时间长,可达数月,一般仅表现消瘦、厌食、间歇性咳嗽、流涕和发热(持续 3d10d)等
3.2病理变化 3.2.1病变仅局限于胸腔
3.2.2急性病例:肺组织肝变(多数为单侧非对称性肝变,呈葡萄酒颜色,肺和胸膜粘连、胸腔积有纤 维性渗出液等,严重时胸腔渗出物暴露于空气中在肺表面形成一层胶状包膜
3.2.3慢性病例肺组织局部出现小面积肝变或坏死灶
GB/T34720一2017 3.3流行病学 3.3.1本病主要依靠飞沫和接触传播，一年四季均有流行,冬春季节多发
3.3.2所有年龄、性别的山羊对本病均易感
耐过病羊在相当长时间内可通过呼吸道向外界排毒,成 为传染源
3.3.3环境和应激因素如营养缺乏、气候骤变,羊群密集、长途调运、寒冷潮湿等情况下易诱发本病
3.3.4非疫区首次发病羊多呈急性经过,死亡率高;疫区羊发病多呈慢性经过,死亡率低
3.4临床诊断结果判定 符合3.1、3.2,3.3的临床症状、病理变化及流行病学特征的发病羊,可判定为疑似山羊接触传染性 胸膜肺炎
实验室诊断 4.1样品的采集与运输 4.1.1样品的采集 4.1.1.1将棉拭子伸人待检山羊鼻腔内采集分泌物;无菌采集肺脏病变部位、特别是病变部位和非病变 部位交界处的肺组织和纵隔淋巴结;若有胸水则无菌采集后,分别放人灭菌容器保存
4.1.1.2无菌采集羊颈静脉血,常规方法分离血清
4.1.2样品运输与保存 4.1.2.1样品采集后,置冰上冷藏送至实验室检测 4.1.2.2血清储存应置于一20C冰箱,检测前应在56C水浴灭活30min
4.1.2.3棉拭子、组织样品和胸水储存应置于一70C冰箱
4.2器械与设备 4.2.1普通培养箱:37C
4.2.2组织匀浆设备 4.2.3低温台式高速离心机
4.2.4生物安全柜或超净工作台 4.2.5普通光学显微镜
4.2.6PCR扩增仪
427电泳仪和电泳情
42.8灰胶成像系统或紫外检渊仪 4.2.9祸旋振荡器 4.2.10微型震荡器
4.2.11水浴箱
4.2.1296孔V型(110°)聚苯乙烯血凝反应板
4.2.13移液器
GB/34720一2017 4.3病原分离与鉴定 4.3.1试剂与材料 除另有规定外,生物试剂为生化试剂级、化学试剂为分析纯
MTB培养基(见A.1)、MTA培养基 见A.2). 4.3.2样品处理 min,取上 4.3.2.1鼻拭子置于1ml.MTB培养基中,充分捻动,挤干后弃去拭子,3000r/min离心l0 清0,5ml,作为接种材料
4.3.2.2组织样品用剪刀剪碎,每0.lg加MTB培养基0.9ml,研磨匀浆,3000r/min离心l0min,取 上清0.5ml,作为接种材料
4.3.2.3胸水用MTB培养基1;1稀释后,3000r/min离心10min,取上清0.5mL,作为接种材料
4.3.3样品接种 取样品上清液接种4.5mLMTB培养基标记为10-'管,并作10倍系列稀释至10-管
同时,从 各个稀释度(10-l~10')试管中取0.2ml接种MTA培养基(培养皿),用封口膜封口
将3个稀释度 的MTB试管和MTA平皿置37c培养
4.3.4观察结果及克隆纯化 4.3.4.1MTB培养物 4.3.4.1.1连续观察7d
若培养基颜色变黄、,不浑浊或轻微浑浊,则判为样品分离疑似阳性,取样按 .3.5方法进行鉴定;同时取样接种到MTA培养基上,按4.3.4.2方法进行克隆纯化 4.3.4.1.2若培养基变黄但明显浑浊,应将3管培养物用孔径0,454m微孔滤膜过滤后,再接种到 MTB培养基中,按4.3.4.1.1方法进行观察和克隆纯化
4.3.4.1.3若培养基不变黄且不浑浊,则3管均盲传1代,按4.3.4.1.1方法进行观察和克隆纯化;盲传 后仍未变黄则弃之
4.3.4.2TA培养物 4.3.4.2.1接种3d后每天用低倍显微镜(4倍10倍物镜)观察培养皿,连续观察至第15天
若有支 原体生长,应为典型的有“中心脉”菌落;肉眼不易看见的极小的水滴状圆形略带灰色的微小菌落,中央 有乳头状突起,直径约0.2mm一0.5mm;则判为样品分离疑似阳性
切取菌落含琼脂块),倒置在一 个新的MTA培养基的琼脂表面,轻轻动琼脂块进行克隆纯化,切取克隆纯化的单个菌落(含琼脂块)进 行鉴定
4.3.4.2.2若15d后仍未见支原体菌落生长,则弃之
4.3.5支原体鉴定 将4.3.4.1和4.3.4.2中样品分离疑似阳性的培养物和克隆纯化的单个菌落,按照4.4做进一步 鉴定
4.3.6结果判定 样品分离疑似阳性，且PCR方法鉴定结果阳性,则判为山羊接触传染性胸膜肺炎病原分离阳性,表 述为检出山羊支原体山羊肺炎亚种
否则,表述为未检出山羊支原体山羊肺炎亚种
GB/T34720一2017 4.4CR方法 4.4.1试剂与材料 灭菌生理盐水(0.85%氯化钠溶液),市售基因组DNA提取试剂盒,2×PCR反应预混合液(含Tag 酶),6×PCR上样缓冲液,DNA分子质量标准,适宜的核酸染料,TAE电泳缓冲液(见B.1),1%的琼脂 糖电泳凝胶板(见B.2).
采用引物Mc力pe-F/Mcpspe-R用于山羊支原体山羊肺炎亚种核酸的检测,粑基因为ureD基 因,产物大小为318bp
上游引物(Mecp-spe-F);5’-ATCATTTTTAATCCCTTCAAG3’
下游引物(Mc力-spe-R);5'-TACTATGAGTAATTATAATATATGCAA-3’ 引物浓度均配成20pmol/AL 4.4.2样品处理 鼻拭子、组织和胸水等样品按4.3.2方法处理,将获得的上清液经13000r/min离心20min后,弃 上清,收集沉淀,提取DNA
MB培养物l3000r/min离心20min后,弃上消,收集沉淀,提取DNA MTA单个菌落(含琼脂块),浸人1mL灭菌生理盐水,室温浸泡30min,涡旋震荡,3000r/min离 心10min,取上清,l3000r/min离心20min后,弃上清,收集沉淀,提取DNA
4.4.3样品DNA提取 用市售基因组DNA提取试剂盒,按试剂盒说明书操作,提取基因组DNA,立即进行PCR反应或 -20C保存
4.4.4PCR反应 反应体系 4.4.4.1 按下列方法配制50LPCR反应体系 2×PCR预混合液(含Taq酶)25L 上游引物 1L 下游引物 1l 灭菌去离子水 18AL DNA模板 5L 每次反应设阴、阳性样品对照,阴性样品对照用MTB培养基提取的DNA作为模板,阳性对照用 Mee灭活培养物提取的DNA作为模板;同时设阳性质粒对照(含靶基因片段序列,参见附录C)和空 白对照(灭菌去离子水)
4.4.4.2反应程序 953min进行预变性;然后进行35个循环的扩增(94C30s,47C30s,72C30s),最后72C 延伸5min,4C保存
4.4.5反应产物电泳观察 取PCR产物各5L(包括被检样品,阴性对照样品、阳性对照样品、阳性质粒对照和空白对照)分 别与1AL.6×PCR上样缓冲液混匀,连同DNA分子质量标准,在1%琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像
GB/34720一2017 系统中观察结果
4.4.6质控标准 当阳性对照(样品、质粒)有318bp的特异性扩增条带,阴性样品和空白对照没有相应的条带,说明 质控合格
4.4.7结果判定 样品有大小为318bp的特异性扩增条带判为PCR结果阳性,表述为检出山羊支原体山羊肺炎亚 种核酸
样品无特异性的阳性扩增条带判为PCR结果阴性,表述为未检出山羊支原体山羊肺炎亚种 核酸
4.5血清学检测间接血凝试验 4.5.1试剂与材料 间接血凝试验抗原,间接血凝试验阴性对照血请、阳性对照血清,间接血凝稀释液,配制方法见附 录D.
操作方法 4.5.2 稀释被检血清和阴阳性对照血清 4.5.2.1 在96孔聚丙乙烯反应板上进行
每份血清用1排孔,从第1孔开始,至第8孔,每孔滴加稀释液 25L,用微量移液器吸取被检血清25AL加人第1孔,充分混匀后吸取25L加人第2孔依次做倍比 连续稀释至第7孔(1:2、1:4、1:81:128),混匀后从第7孔弃去25L,第8孔作为空白对照
4.5.2.2加间接血凝试验抗原 从第1孔开始,至第8孔,每孔滴加间接血凝试验抗原25AL
4.5.2.3震荡 加间接血凝试验抗原后将V型反应板放在微型震荡器上震荡1nmin.盖上玻璃板,置37C温箱孵 育2h,观察和判定凝集程度
4.5.2.4凝集程度的判定标准 用下列符号表示红细胞凝集程度 “十十十十”,表示100%红细胞被凝集,形成一层均匀膜,布满整个孔底
十”,表示约75%红细胞被凝集,在孔底形成一层薄膜,面积比前者稍小 ,表示约50%红细胞凝集,在孔底形成薄膜凝集,边缘松散或呈锯齿状
“+”,表示约25%红细胞凝集,在孔底呈稀薄、散在、少量凝集,孔底有小圆点
“士”,表示25%以下红细胞凝集,沉于孔底,但周围不光滑或中心有空斑
,表示无红细胞凝集,完全沉于孔底,呈光滑的圆点
4.5.3实验成立的条件 所设各项对照出现如下结果则试验成立,否则应重做: -空白对照孔应全部无红细胞凝集,凝集强度为“ 阳性血清对照孔应全部凝集,凝集强度为“十十十+”
GB/T34720一2017 -阴性血清对照孔仅1;2稀释度允许有不同程度凝集,其余各孔均应无凝集,凝集强度为“- 4.5.4结果判定 以出现4.5.2.4中“十+”或以上凝集反应的最大稀释孔判定为样品的血凝效价
当实验符合4.5. 的条件,样品血凝效价>1;8判为抗体阳性,表述为山羊接触传染性胸膜肺炎血清学阳性
样品血凝 效价<1;2判为抗体阴性,表述为山羊接触传染性胸膜肺炎血清学阴性
当样品血凝效价介于二者之 间判为可疑,应重新检测,重新检测结果仍为可疑,则判为抗体阳性,表述为山羊接触传染性胸膜肺炎血 清学阳性
5 综合判定 凡具有4.3.6、4.4.7、4.5.4中任何一项阳性者,均判为山羊接触传染性胸膜肺炎阳性
GB/34720一2017 录 附 A 规范性附录 病原分离溶液的配制 MIB培养基 A.1 A.1.1成分 PPL0肉汤(不含结晶紫 21g/L 25%鲜酵母浸液 100mL/L 灭活马血清 200mL/L 5%醋酸钝溶液 4mL/L 青霉素 20万IU/I 葡萄糖 2g/L 丙酮酸钠 N 2 g/ 0.4%盼红 0.18mL A.1.2制备方法 将21lgPPLO肉汤溶于700ml.去离子水中,116C高压灭菌30min,其余成分混合溶解后用0.22m 滤膜过滤,无菌加人冷却的PPLo肉汤中,用灭菌的1mol/L氢氧化钠调pH至7.67.8,分装试管或 锥形瓶等,2C8C保存备用
MITA培养基 A.2.1成分 PPIL0琼脂 35g/几 200mL/L 灭活马血清 100ml/I 25%酵母浸出液 4mL/1 5%醋酸钝 20万IU/I 青霉素 萄糖 2g/L 丙酮酸钠 2g/L 0.4%酚红 5ml/L A.2.2制备方法 PPL0琼脂35g溶于700mL去离子水,l16C高压灭菌30min,其余成分用0.22m滤膜过滤 灭菌后的PPI0琼脂冷却至50C左右时加人预热到50C左右的滤膜过滤部分,用灭菌的1mol/几氢 氧化钠调pH至7.6~7.8,倾倒平皿或斜面等,2C一8C保存备用
GB/T34720一2017 附 录 B 规范性附录) PCR反应溶液的配制 B.1TAE电泳缓冲液(pH8.0)的配制 Tris(羚基甲基氨基甲婉)碱 242g EDTA 37.2g 冰乙酸 57.1mL 加去离子水至1000mL,使用前用去离子水50倍稀释
B.21%的琼脂糖电泳凝胶板制备 将琼脂糖1g加人100mL1×TAE电泳缓冲液中,加热融化,温度降至60C左右时加人适宜的核 酸染料,均匀铺板,厚度为3mm5mm
GB/34720一2017 录 附 C 资料性附录 PCR检测电泳例图及靶基因片段的NA序列 CR检测电泳例图 C.1 PCR检测电泳例图见图C.1
M 2000be 1000bp 750bp 500bp 318bp 250bp 100bp 说明: M -DNA分子质量标准D1.2000; 阳性质粒对照 空白对照; 阳性样品对照 阴性样品对照
图C.1PCR检测电泳例图 C.2PCR扩增靶基因(areD)片段序列 大写字母为引物所在位置(Gabes株,GenbankAeeessionNo.AY529462). ATCATTTTTAATCCCTTCAAGtE tagtggaatttgcaggtgcagtatttccattattaattggtgttgttttaaaacaacaagat gtattagcttcaggatcaattacagcattttcatttgcatcagggttagttaacttaattactccaacaagtggtgttgttatgggagttattgcaattaca agaatcgattatggaaaatttgtaaaaggtattagtccatttgtagcagtattatcagtaagttcattaaccttattattgataggtggagcaattggtgg aaTTGCATATATTATAATTACTCATAGTA(318bp) aacaa
GB/T34720一2017 附 录 规范性附录) 间接血凝试验材料的制备和溶液的配制 D.1 间接血凝试验阳性对照血清的制备 D.1.1Mecp免疫用抗原的制备 D.1.1.1灭活抗原 用MTB培养基培养Mccp模式株F38,取对数生长期培养物2L(>l.0×10'CCU/mL),向菌液中 加人40%甲醛溶液,使其终浓度为0.2%,随加随摇,使其充分混合,置37C灭活12h(以瓶内温度达 37C开始计时),期间振摇3次4次,灭活后4C12000r/min离心30min,沉淀物用0.15mol/几L bH6.4PBs悬浮,如上离心洗涤3次后,配成原培养液体积的1/100,测定浓度后稀释至10mg/mL备用
D.1.1.2弗氏佐剂抗原 市售弗氏不完全佐剂与Meep灭活抗原等量混合、乳化,制成弗氏不完全佐剂抗原备用;市售弗氏 完全佐剂与Meep灭活抗原等量混合、乳化,制成弗氏完全佐剂抗原备用
D.1.2免疫家兔和分离血清 选用体重2kg左右的健康雄性家兔
第一次免疫,用充分乳化的弗氏完全佐剂抗原,于每只兔两 后腿足部皮下,帼淋巴结处及背部皮下多点接种,接种量为1.5mL,14d后仍以上述抗原和剂量由背部 皮下多点接种,进行第二次免疫;隔11d后,以弗氏不完全佐剂抗原,由每只兔肩部肌肉2点,背部皮下 mL 多点接种,接种剂量为3mL,为其第三次免疫;l1d后,取制备好的不含佐剂的灭活抗原(10mg/n 由每只兔耳静脉注射1.5ml,进行第四次高免,隔14d后采血,常规方法分离血清
D.2间接血凝试验阴性对照血清的制备 选取经血清学证实为山羊接触传染性胸膜肺炎抗体阴性的健康山羊,预静脉采血,无菌分离血请 或选取健康雄性家兔,心脏或颈动脉插管采血,无菌分离血清
D.3间接血凝试验抗原的制备 D.3.1Meep纯化多糖抗原的制备 用MTB培养基培养Mcep模式株F38,取对数生长期培养物2L.(>1.0×10'cCCU/ml),12000r/nmin 离心30min,取上清液,用冰醋酸调节上清液pH至5.0,煮沸1h,待冷却后用普通滤纸过滤,收集滤液; 于滤液中加人无水乙醇至最终浓度为80%,充分振摇,离心收集沉淀,沉淀物即为多糖抗原粗制品
将 粗制多糖抗原溶解在适量灭菌水中,加人等体积配置好的60%苯盼(体积分数),混匀,68C水浴1h,取 出置4C过夜后,经6000r/min离心30min,取上清,并用0.1mol/L氯化钙溶液透析24h;加人2倍 体积的无水乙醇,混匀,置4C过夜后,再经7000r/min离心30min,收集沉淀物用无水乙醉和丙酮分 别洗涤,然后用灭菌水溶解,过滤除菌后,即为纯化多糖抗原
将多糖抗原浓度稀释为150 4g/mL， -20C保存备用
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GB/34720?2017 D.3.25%?? ?????в??,??? ,???,???(5ml10mL),2C8C 2???,??,3000 r/min 30min,?,0.15mol/1 pH7.2PBS,?4,5%?? D.3.3??? ?5%??52~8?2.5%?1?,??? 2h,3000r/min5min,?,0.15mol/IpH7.2PBS,?3, 5%???,0,01%,2C8C?档???,5%? ??1;20000?,37C??30min,3000r/min5min, ?,0.15mol/LpH6.4PBS,?3,5%?-??? D.3.4??? ??15%?-??1Meep??,37C??30min,? ,3000r/mm5min?,ú1%??0.15mol/p7.2PIs, ?310%???,????1%??,???? D.4??? D.4.1? (Na;PO.12H.O) 1934g KHPO 2.86g ?(NaCI 4.25g ??1000mL D.4.2? ?????,103.41kPa(121C)?30nmin,99ml.?? ?(56C??30min)1mL,????
山羊接触传染性胸膜肺炎诊断技术GB/T34720-2017
引言
传染性胸膜肺炎是一种常见的家畜疾病，会危及山羊的生命健康。目前，山羊接触传染性胸膜肺炎的情况比较普遍，如何诊断和治疗成为山羊养殖过程中需要解决的问题之一。为此，我国发布了《山羊接触传染性胸膜肺炎诊断技术》行业标准，即GB/T34720-2017。
GB/T34720-2017介绍
GB/T34720-2017是我国发布的《山羊接触传染性胸膜肺炎诊断技术》行业标准。该标准规定了山羊接触传染性胸膜肺炎的诊断方法、实验室检测方法等方面的内容。
诊断方法
本标准规定了山羊接触传染性胸膜肺炎的诊断方法，包括临床症状的观察、病理学检查、细菌学检测等。其中，病理学检查和细菌学检测是诊断该疾病的主要手段之一。
病理学检查
本标准规定了病理学检查的内容和方法，包括采集组织标本、制备镜片、染色、镜检等步骤。通过病理学检查可以确定山羊是否患有该疾病，并评估其病情的严重程度。
细菌学检测
本标准规定了细菌学检测的内容和方法，包括样品采集、培养、生化鉴定、药敏试验等步骤。通过细菌学检测可以确定病原体的种类和对药物的敏感性，为后续的治疗提供依据。
实验室检测方法
本标准还规定了实验室检测方法，包括酶联免疫吸附试验、PCR技术等。这些检测方法可以用于快速、准确地确定山羊是否感染了传染性胸膜肺炎。
结论
GB/T34720-2017是我国行业标准中关于山羊接触传染性胸膜肺炎诊断技术的重要标准之一。掌握该标准对于保障山羊养殖行业的稳健发展具有重要意义。
