国家标准 GB/T28082一2011 榆枯萎病菌检疫鉴定方法 DeteetionandidentifieationofOphiostomanovo-ulmiBrasier andOphiostomaulmniBuismanNannf 2011-12-30发布 2012-06-01实施国家质量监督检监检疫总局发布国家标准花管理委员会国家标准
GB/T28082一2011 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本标雅起草单位;检验检疫科学研究院本标准主要起草人:吴品珊、严进、杜洪忠
GB/T28082一2011 榆枯萎病菌检疫鉴定方法范围本标准规定了榆枯萎病菌的分离培养,形态学鉴定的方法本标准适用于来自榆枯萎病菌有发生国家和地区的榆属(UlmusL.)苗木,原木,木制品和木包装中榆枯萎病菌的检疫鉴定榆枯萎病菌基本信息中文名;榆枯萎病菌 ulmBrasier; 学名:Ophiosto7 D17ou0- Ophiosomaulmi(Buisman)Nannf. 异名;Ceratocystisulmi(Buism.)Moreau 病害英文名;dutchelmdisease,elmwiltdisease 属真菌界Fungi,子囊菌门Ascomycota,子囊菌纲Ascomycetes,粪科菌亚纲Sordariomycetidae,长喙壳目Ophiostomatales,长喙壳科Ophiostomataceae,长喙壳属Ophiosoma 榆枯萎病菌其他信息参见附录A 方法原理依据无性抱子和有性世代的形态特征和生物学特性,以及其对寄主造成的症状特征进行检测鉴定 4 仪器生物显微镜 4.2体视显微镜 4.3光照生物培养箱 4.4高压灭菌器 4.5超净工作台 4.6电子天平 4.7摇床试剂和培养基试剂琼脂粉,麦芽膏,Oxoid麦芽提取物,榆树枝条,葡萄糖,天门冬酰胺(L-asparagine),磷酸二氢钾 (KH,P(o,),硫酸镁(Mgso7HH,O),硫酸锌(ZnsO.),三氯化铁(FeCl,),维生素B,维生素B,放线菌酮,链霉素,青霉素注放线菌酮为剧毒品,注意防护
GB/r28082一2011 5.2培养基 5.2.1选择性培养基 0.2g放线菌酮溶于100ml水,取50ml加于1000ml.麦芽膏(MA)培养基内,灭菌后冷至45C. 加人10ml含1%链霉素和1%青霉素的混合液 5.2.2麦芽膏培养基MIA 25虽麦芽膏,17只琼脂粉,1000mL 蒸儡水,灭菌 5.2.3榆边材培养基EsA 取50g健康的榆树边材或枝条,去皮粉碎成直径0.5cm的小块，15g琼脂粉,500ml蒸僧水灭菌 5.2.4Tchernof改良培养液 20g葡萄糖、2g天门冬酰胺、1.5g磷酸二氢钾、lg硫酸镁、20mg硫酸锌、10mg三氯化铁、1mg 维生素B和1mg维生素B,.,l000ml蒸僧水,灭菌 5.2.5Oxoid麦芽提取物培养基MEA 33gOxoid麦芽提取物10g琼脂粉1000mL燕懈水.灭菌标准菌株 Opht 2iosto7mao0-uln iA交配型(Amatingtype),雕性;B交配型(CBmatingtype),雄性 A交配型(Amatingtype),雌雕性;B交配型(Bmatingtype),雄性 iostouln ophi 检验检疫科学院保存病菌的标准菌株检测检查苗木,原木或木材的表面，纵向和横向切开树干或枝条检查愉枯萎病菌的2个种引起的外观症状是相同的在树干或枝条的横切面上,可见靠近外面的年轮附近有深褐色斑点或条纹,有时斑点密集,可连成断续的深褐色圆环去掉树皮,木质部上有深褐色纵向条纹,有时条纹不明显,可轻削一层木质,条纹便显现出来切开枝权处,常可找到小蠢的蛙食槽取有如下症状的样品做病菌分离:干枯呈深褐色的枝条,有小蠢蛙食槽痕迹的树皮,横断面上有深褐色斑点或断续的褐色圆环枝干,纵切面有褐色条纹枝干,货物上附着有小蠢虫鉴定 8.1分离培养对变色的木质部,去掉树皮,切取直径为5mm大小,于选择性培养基(见5.2.1)上,20C黑暗培养;对有虫蛙槽的树皮,清除蛙槽内的虫粪和残屑,70%酒精消毒10s30s,无菌水冲洗,灭菌滤纸吸干 10mm 水分,切取边长为5mm 的大小,于选择性培养基上,20C黑暗培养;小蠢虫解肢为5mm大小,70%酒精消毒10s30s,无菌水冲洗,灭菌滤纸吸干水分,于选择性培养基上,20C黑暗培养
GB/T28082一2011 旦有真菌菌落出现,立即分别转皿转皿到ESA培养基,20培养,以期获得粘束梗霉Pest ;转接于Tchernof改良培养液 2sotunuln 中,室温下110r/min振荡培养,以期获得酵母状分生袍子Ba.somyces;转皿到MEA培养基,20C黑暗培养,以做种的鉴定 8.2子囊抱子培育子囊袍子需在A,B型2种交配型同时存在的ESA培养基上形成如确认在ESA培养基上长出褐色粘束梗霉,同时取Ophio oulmi任意亚种)和Ophio ostomaulmi标准菌株的A、B交配 stoaoUo-L 型,分别与分离出的病菌,等距离三角形接种在ESA培养基上,各重复3皿.,20C黑暗培养7d,然后室温(20C25)漫射光下继续培养14d 8 种的鉴定菌落形态、菌落生长速度和最佳生长温度,是区分榆枯萎病菌两个种的主要指标取在MEA培养基上培养的新鲜菌块(2mm大小),转接在MEA培养基中央,共转6皿,3皿置于 20黑暗培养,3皿置于33C黑暗培养 20C黑暗培养2d后,取出培养皿测量菌落直径D,,继续在20C黑暗培养5d,再次测量菌落直径 D,按(D一D.)/5计算病菌5d的平均辐射状生长速度(mm/d) 最后将培养皿置于室温,漫射光继续培养10d,以观察菌落特征 33C黑暗培养2d后,取出培养皿测量菌落直径E,继续在33C黑暗培养8d,再次测量菌落直径 E,按(E一E/8计算待测菌8d的平均辐射状生长速度(mm/d) 最后将培养皿置于室温,漫射光继续培养10d,以观察菌落特征必要时做亚种鉴定(参见附录B 结果判定 9.1ophiost tonanov0-ulni 9.1.1 菌落特征在MEA培养基上,经20C黑暗7d和室温漫射光10d培养后,菌落灰白至乳白色,花瓣状、轮纹明显气生菌丝量中等,常结集成绳索状使菌落有条纹呈现欧亚亚种O.now-ulmisubsp.now-ulmi 的菌落条纹较少,边缘有不规则的叶状浅裂在20C黑暗条件下生长较快生长速度为(2.8mm/d~)3.1mm/d4.8mm/d( O.no0-uln1 5.7mm /d)0.1mm/d0.5mm/d /d),33笔的生长速度为(0mm/ 9.1.2病菌形态菌丝:分隔,直径1lAm6m,气生菌丝常结集成绳索状,菌丝体分生抱子丰富粘束梗霉Pesolwm" ;易在EsA培养基上形成束丝无性态(synnematalanamorph)单个或多 l 个,褐色到黑色，纤细,ln mm2mm长;褐色假根状菌丝附着在培养基上,褐色有隔菌丝平行构成束状顶部张开分枝成透明的菌丝,其上产生分生袍子分生袍子全壁芽殖、单胞,透明、卵形到椭圆形、大小为(24m一6wm)x14m一34m),聚集成乳白色粘性抱子滴(参见附录C》发簇袍spurohrir;可在大多数培养基上形成分生袍子梗多侧生,10pm一30r m(一50Mm),分 Am 4Am)x(24m一3Am),全壁芽生,有0.5pm~1 生袍子(4.54m~14 -1em的细齿,单胞、透明,椭圆形至长形,尖端通常较细、微弯,连有一个小囊领菌丝体分生抱子常聚成粘性滴状,酵母状芽殖
GB/r28082一2011 酵母状分生袍子Ba. a.somyces:在液体培养基中产生,单胞,酵母状芽殖,袍子大小变化很大子囊壳在ESA培养基上表生到部分埋生,有褐色假根状菌丝附着在基质上子囊壳基部球形、黑色,宽75uml40um,刚毛稀少至中度,褐色至黑色、有隔1304m×34m;子囊壳颈部黑色，长 n,顶部9wm一l4pm;颈长度与基部球宽度之 230m一640m(1070m),颈基部直径19m一36Mmm 比通常为1.5~6.2;孔口缘丝茂盛,透明、有隔,少分枝,(20m一604m 1！m2Am);子囊薄壁、球形至卵形,易消解;子囊袍子透明、单胞、桔瓣形,(4.5Am一6Am)×(14m1.5m),聚生成奶白色粘性袍子滴自然条件下产生的交配型B占优势,雌性交配型A强烈排斥o.ulmi的雄性交配型B Ophiostomnaulmi 9.2.1 菌落特征在MEA培养基上经20C黑暗7d和室温漫射光10d培养后,菌落呈光滑蜡质、苔状,轮纹不明显乳白至黄褐色,偶有紫褐色斑块,气生菌丝难辨在20C时,生长速度为(1.5mm/d~)2.0mm/d3.1mm/d(一3.5mm/d),在33C条件下的生 mm/d2.8mm/d 长速度较o ni快,为1.1 no0-ul 9.2.2病菌形态基本一致(9.l.2),雕发簇袍swhrir的岗丝体 o.ulmi的3种分生袍子的形态与o.nor0ulmi 分生抱子和其出芽形成的分生抱子常合生成酵母状团块子囊壳在ESA培养基上表生到部分埋生,有褐色假根状菌丝附着在基质上子囊壳基部球形、黑色,宽1004m~1504m,刚毛稀少至中度,褐色至黑色,有隔1304mX34m;子囊壳颈部黑色,长280m~ 420Am(510Am),颈基部直径为18Am42Am,顶部11m16Am;颈长度与基部球宽度之比通常为2.4一a.5;孔口周丝茂盛,透明.有隔,少分枝,(20, )pm)x(1 m60 m2Am);子囊薄壁、球形至卵形、易消解;子囊抱子透明.单胞、桔瓣形,(4.5 54m~64m)×(1m 11.5Mm),聚生成奶白色粘性袍子滴自然条件下产生的交配型A和B大致相等,雌性交配型A可接受O.nooulmi的雄性交配型B nov0-ulmi和Ophiostomaulmni的特征比较 9.3ophiosoma 特征比较见表1 表1特征比较特征 Obhiosto1uor=ulu Obhiosoului 20 2.8)3.14.8(5.7 1.5)2.03.1(一3.5) 生长速度mm/d 33C 1.1一2.8 0)0.10.5 菌落形态花瓣状、轮纹明显,有条纹光滑蜡质、苔状,轮纹不明显交配型 B型占优势 A型和B型大致相等颈长 230640(~1070 280420(510 Am 子囊壳颈长与基部球 2.43.5 1.5一6.2 直径比
GB/T28082一2011 结论如分离菌的形态特征与鉴定指标吻合,可鉴定为榆枯萎病菌否则,不视为榆枯萎病菌 10 样品保存检疫鉴定后保存样品,以备复验,谈判和仲裁由鉴定人标识确认,样品管理员登记,置于干燥防虫、防鼠处保存,保存期为1年,有特殊需求保存期可适当延长保存期满,需经灭菌后方可处理 11 菌种保藏将病菌接在MEA培养基斜面上,待菌丝布满斜面后,封好盖子，一20C保存
GB/r28082一2011 附录A 资料性附录榆枯萎病菌的分类、,寄主与分布 A.1分类榆枯萎病是榆树上的毁灭性病害,常年危害欧美的林木业,在20世纪30年代和70年代曾引起两次大规模流行愉枯萎病的致病菌已经分化为2个种,Ophiostomaulmi引致欧美的第一次大流行， Ophiostomanowulmi是第二次大流行的致病菌,在《进境植物检疫性有害生物名录》中称为新愉枯萎病菌 Ophiosomanow-wlmi侵袭性较强,其内分为两个亚种 -欧亚亚种Ophios 和美洲亚种Ophiostomanoc0ulmisubsp.americana 本标准将 tomanoo-ulmisubsp，noo-ulm1i 和o hiostomanoo-ulmi统称为榆枯萎病菌 1 Ophiostomaulmni 2 寄主范围 A， ndra),山愉寄主主要为愉属(UlmusL.)树木以美洲榆(U. ),荷兰榆(U.holla aericana (U.glabrau),英国愉(U.procera)等较为感病,人工接种可为害椭属(ZelkovuS.) 该病菌是欧美愉属上的重要有害真菌,可侵染各龄榆树,引致榆树干枯、死亡,称为榆枯萎病,或荷兰榆病 A.3分布亚洲;亚美尼亚、阿塞拜疆、格鲁吉亚、伊朗、土耳其、乌兹别克斯坦哈萨克斯坦仅Ophio.toma no0ulmi 欧洲,阿尔巴尼亚,爱尔兰、丹麦,挪威、瑙典,波兰、,捷克,斯洛伐克,匈牙利,法国,德国、奥地利、荷兰、瑞士、英国,比利时,西班牙,葡萄牙,意大利、罗马尼亚、希腊、摩尔多瓦、乌克兰,俄罗斯、圣马力诺塞尔维亚、波黑(仅Ophi0 wsomanoww-ulmi),克罗地亚(仅O)phiostomanw-ulmi),斯洛文尼亚《仅 Obhiostomamo0-ulmi)、保加利亚(仅Ohiostomanoorulmi)、马其顿(仅Obhiostomano0-ulmi)、白俄罗斯(仅Ophioomaulmi)、芬兰(仅owhioomaulmi) 美洲,美国,加拿大大洋洲;新西兰(仅Ophiooma no0-ulmi)
GB/T28082一2011 附录 B 资料性附录欧亚亚种ophiostomanoo-ulmisubsp.novo-ulmi和美洲亚种 Ophiostomano0-ulmisubsp.americana的鉴定方法 B.1鉴定 B.1.1交配型的测定亚种的鉴定首先要确定供试菌的交配型取标准菌株ophiostoma0-ulmi任意亚种的交配型 A和B以及待测菌,等距离三角形分别接种在ESA培养基上,重复3m,20C黑暗培养1周后,在室温 (20C一25C)漫射光下继续培养两周 B.1.2A交配型的培养经测定交配型为A的供试菌,在MEA培养基上20C黑暗培养;取标准菌株美洲亚种的B交配型为受体,接种于EsA培养基,20C黑暗培养14d,再漫射光下继续培养7d,使菌落长满全m;切取MEA 培养基上的待测菌2cnm为供体,菌面朝下贴放在受体菌落的一侧,另以标准菌株美洲亚种和欧亚亚种的A交配型为供体对照,同法分别置于受体的另外部位,重复3皿,室温漫射光下培养 10d后记录各供体上每lcmm”的子囊壳数目 B.1.3B交配型的培养经测定交配型为B的供试菌,在MEA培养基上20丫黑暗培养;取标准菌株欧亚亚种的A交配型为受体,接种于EsA培养基,20黑暗培养14d,再漫射光下继续培养7d,使菌落长满全皿;切取MEA 培养基上的待测菌2em为供体,菌面朝下贴放在受体菌落的一侧,另以标准菌株美洲亚种和欧亚亚种的B交配型为供体对照,同法分别置于受体的另外部位,重复3皿,室温漫射光下培养 10d后记录各供体上每1cm'的子囊壳数目 B.2结果判定 B.2.1交配型判定若待测菌与交配型B的交界处产生子囊壳,则待测菌为A交配型;若待测菌与交配型A的交界处产生子囊壳,则待测菌为B交配型 B.2.2A交配型亚种判定若待测菌与受体(美洲亚种B交配型)所生子囊壳数目与供体对照美洲亚种A交配型所生子囊壳数目大致相等,是供体对照欧亚亚种A交配型所生子囊壳数目的10倍30倍,则待测菌为美洲亚种若待测菌与受体(美洲亚种B交配型)所生子囊壳数目与供体对照欧亚亚种A交配型所生子囊壳数目大致相等,是供体对照美洲亚种A交配型所生子囊壳数目的1/10~1/30,则待测菌为欧亚亚种 B.2.3B交配型亚种判定若待测菌与受体(欧亚亚种A交配型)所生子囊壳数目与供体对照欧亚亚种B交配型所生子囊
GB/r28082一2011 壳数目大致相等,是供体对照美洲亚种B交配型所生子囊壳数目的10倍30倍,则待测菌为欧亚亚种若待测菌与受体(欧亚亚种A交配型)所生子囊壳数目与供体对照美洲亚种B交配型所生子囊壳数目大致相等,是供体对照欧亚亚种B交配型所生子囊壳数目的1/10~1/30,则待测菌为美洲亚种
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榆枯萎病菌检疫鉴定方法GB/T28082-2011

榆枯萎病菌是引起榆树死亡、枯萎的一种严重病原菌，会导致叶片黄化、干枯、掉叶等症状。为了保障榆树的生长和发展，需要对该病原菌进行有效的检疫鉴定。

鉴定方法

根据GB/T28082-2011标准，榆枯萎病菌的检疫鉴定可以采用以下方法：

PCR法：通过聚合酶链反应扩增病原菌的DNA序列，再通过特异性引物检测其存在与否。
ISCR法：利用榆科植物中的ISCR元件，针对榆枯萎病菌的16S rRNA基因进行扩增和检测。
TaqMan PCR法：结合荧光探针技术，通过PCR扩增并实时检测榆枯萎病菌的存在。

这些方法都具有高灵敏度、高特异性和高准确性，能够迅速鉴定出榆枯萎病菌的存在。

标准GB/T28082-2011

该标准规定了榆枯萎病菌的检疫鉴定方法及其操作要求，其中包括样品采集、处理、试剂准备、实验步骤等内容。该标准的制定和实施，可以为榆树种苗生产、盆栽育苗、大田栽培以及进出口商品的检验提供技术标准。

结论

榆枯萎病菌是一种危害严重的植物病原菌，其检测和鉴定具有重要意义。GB/T28082-2011标准规定了多种检测方法，可以根据具体情况选择合适的方法进行鉴定。希望本文能对从事相关工作的人员提供帮助。