牛奶和奶粉中螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素残留量的测定液相色谱-串联质谱法

牛奶和奶粉中螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T22988一2008 牛奶和奶粉中螺旋霉素、吹利霉素、 竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素 残留量的测定液相色谱-串联质谱法 Determinationofspiramyein,pirlimycin,oleandomycin,tilmicosin， andmilkpowder erythromycinandtylosinresiduesinmilk LC-MS-MSmethod 2008-12-31发布 2009-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22988一2008 前 言 本标准的附录A,附录B为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准起草单位;秦皇岛出人境检验检疫局、河北出人境检验检 疫局 本标准主要起草人:郭春海、艾连峰、段文仲、陈瑞春、马育松、窦彩云、刘宝圣、张增利庞国芳
GB/T22988一2008 牛奶和奶粉中螺旋霉素、毗利霉素、 竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素 残留量的测定液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了牛奶和奶粉中螺旋霉素,毗利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素残留量的 高效液相色谱-串联质谱测定方法 本标准适用于牛奶和奶粉中螺旋霉素,毗利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素残留量的 测定和确证 本标准的方法检出限;牛奶为14g/kg,奶粉为84g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分:总则与定义 GB/T6379.1一2004,IsO5725-1:1994,IDT GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,IsO5725-2:1994,IDT GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一2008,IsO36961987,MOD 原理 用乙晴提取试样中的分析物,固相萃取柱净化,高效液相色谱-串联质谱测定,外标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 乙睛,液相色谱纯 4.2甲醇,液相色谱纯 4.3乙股,液相色谱纯 甲酸铵,液相色谱纯 4.5磷酸氢二钠 4.6氢氧化钠 4.7甲醇-水溶液(3十7);300nL甲醇与700mL水混合 4.85moal/几氢氧化钠浴液,称取20g氢氧化钠,用水浴解,定容至100mL. 0.1nmol/L磷酸盐缓冲溶液;6g磷酸氢二钠(4.5)溶解于450ml.水中,用氢氧化钠(4.8)溶液调 节pH=8,加水至500 ml .,使用前配制 4.100.1mol/儿甲酸铵溶液;0.63g甲酸铵(4.4)加水溶解至1000mL 4.11标准品;螺旋霉素(spiramyein,CAs8025-81-8),毗利霉素(pirlimyein,CAs:79548-73-5、竹桃 霉素(oleandomycin,CAs:7060-74-4)、替米卡星(tilmi n,CAS.l08050-54-0)、红霉素(erythromyein, icosi
GB/T22988一2008 CAS:ll4-07-8)、泰乐菌素(tylosin,CAs:1401-69-0),纯度均大于等于98%. 4.12标准储备液;分别精确称取适量标准品,用甲醇配制成1004g/ml的标准储备液 4.13混合标准中间工作液;取标准储备液(4.12)各ltml至100mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配 制成混合标准工作液,浓度为14g/ml 4.14滤膜:0.45 m 4.15HLB固相萃取柱或相当者:500mg,6mL 使用前依次用3mL甲醇、3mL水和3nmL磷酸盐 缓冲溶液(4.9)预处理 仪器和设备 5.1高效液相色谱-串联质谱仪;配有电喷雾离子源(ES 5.2离心机转速大于3000; r/min 5.3旋涡混合器 5.4旋转蒸发仪 5.5氮吹仪 5.6固相萃取装置 试样的制备与保存 牛奶 取均匀样晶约250g装人洁净容器作为试样,密封置4C下保存,并标明标记 6.2奶粉 取均匀样品约250g装人洁净容器作为试样,密封,并标明标记 测定步骤 提取 牛奶 称取4g,准确至0.01g,牛奶样品于50mL具塞离心管中,加人20mL乙睛振荡提取2min后、 一次,合并上清液于 3000r/min离心10min,移取上清液过滤至鸡心瓶中 再用10ml乙晴重复提取- 同一鸡心瓶中 7.1.2奶粉 称取0.5g,准确至0.01g,奶粉样品,加人4ml水于50ml具塞离心管中,混匀 加人20ml乙 晴振荡提取2nmin后,3000r/min离心10min,移取上清液过滤至鸡心瓶中 再用10mlL乙睛重复提 取一次,合并上清液于同一鸡心瓶中 7.2净化 将提取液于45C下旋转蒸发至约4ml左右,加人2ml磷酸盐缓冲液(4.9),混匀后,转移到已条 件化的HLB固相拳取柱(4.15)上,再用2mL磷酸盐缓冲液洗涤鸡心瓶两次,洗液一并转移到柱上,以 小于2mL/min流速滴下 接着依次用3mL水和2mL甲醇-水溶液(4.7)淋洗并抽干柱,最后用6mL 乙晴洗脱并收集于10ml带刻度的玻璃管中(此过程流速小于2ml/min) 洗脱液在45C水浴上氮 气吹至约1nmL.用甲酸胺溶液(4.10)定容至2mL涡旋混合后.过0.45am滤膜供HPLC-MS-MS 分析 空白基质溶液的制备 将取牛奶阴性样品4g,奶粉阴性样品0.5g,精确到0.01g,按7.1和7.2操作 1 HLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称,给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不是表示对该 产品的认可 如果其他产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品
GB/T22988一2008 7.4测定条件 7.4.1液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下 a)色谱柱;苯基柱,5Am,150mm n×2.1mm(内径)或相当者; 色谱柱温度:30C; D) 进样量15L; c 流动相梯度及流速见表1 d 表1液相色谱梯度洗脱条件 0.1%甲酸水溶液/% 甲格 % 时间/min 流速/pL/min 0.00 200 80 20 6.00 200 20 80 20 8.00 200 80 8.01 200 80 20 10.0 200 80 20 7.4.2质谱参考条件 质谱参考条件如下 a)离子化模式;电喷雾正离子模式(EsI十); b)质谱扫描方式;多反应监测MRM); 鞘气压力104kPa; c 辅助气压力:l38kPa D 正离子模式电喷雾电压(IS);4000; 毛细管温度;350C 游内诱导解离电压.0v g h Q1为0.7,Q3为0.7; 碰撞气:高纯氲气; 碰撞气压力:0.2Pa: k)参考保留时间、监测离子对和裂解能量见表2. 表2参考保留时间监测离子对和裂解能量 化合物名称 保留时间/min 监测离子对(m/e) 裂解能量/eV 843.50/173,87” 36 螺旋霉素 4.73 843.50/540.09 29 25 411.12/111.98" 毗利霉素 4.78 411.12/363.02 14 688.46/158.20" 35 竹桃霉素 5,62 688.46/544.30 20o 4 869.57/173.83" 替米卡星 5.83 869.57/155.89 37 734.18/157.88" 33 红霉素 6.12 734.18/576.13 20 916,36/173.80 38 泰乐菌素 6.33 916.36/772.18 28 为定量离子对,对于不同质谱仪器,仪器参数可能存在差异,测定前应将质谱参数优化到最佳
GB/T22988一2008 7.4.3液相色谱-串联质谱测定 7 .4.3.1定性测定 每种被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同实验条件下,样品中待测物质的保留时间， 与混合基质标准校准溶液中对应的保留时间偏差在土2.5%之内且样品谱图中各组分定性离子的相对 丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较,偏差不超过 表3规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度K K>50 20GB/T22988一2008 表4牛奶中四种分析物的添加浓度范围及重复性和再现性方程单位为微克每千克 化合物名称 添加浓度范围 重复性限r 再现性限R .876 螺旋霉素 gR=0.822 110 lgr=1.1344lgm一0.8 1lgm一0,4995 1一10 r=0,1762用-0,0356 R=0.2104m十0.1712" 毗利霉素 1~10 竹桃霉素 gr=0.9909lg从一0.8121 gR=1.1o10g从一0.5519 替米卡星 1~10 =0.135m+0.0002 R=0.4061m一0.3118 红霉素 l10 lgr=0.8294lgm一0.9144 lgR=0.8442lgm-0.6306 泰乐菌素 l~10 gr=1.1755lgm一0.8883 gR=0.9544lgm-0,5613 注:m为两次测定值的算术平均值 表5奶粉中四种分析物的添加浓度范围及重复性和再现性方程单位为微克每千克 化合物名称 添加浓度范围 重复性限" 再现性限R -0.9740T -0.6973 R=0.85651 螺旋霉素 880 lgr- lg朋 g1 lgm一0.4092 80 =0.1811m一0.0675 R=0.2055m十1.1866 毗利霉素 8 竹桃霉素 -80 =0.1387m十0.2924 R=0.3701m-1.4134 -80 =0.1374m+0.2364 R=0.3727m-2.1249 替米卡星 红霉素 -80 lgr=0.8404lgm-0.6594 gR=0.8448lgm-0.5026 880 泰乐菌素 lgr=1.0699lgm-0.813 gR=0.9585lgm一0.5348 注，朋为两次测定值的算术平均值 如果差值超过重复性限,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 9.3再现性 在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R),被测物的添加浓度范 围及再现性方程见表4和表5
GB/T22988?2008 ?A ?? ????(MRN)?? ù?ù?ù???ù????????(MRM)?? ?A.1 RT:0.00-10.50 RT:0.00-10.50 RT:4.73 RT:5.83 100 100? ? 869.57/173.83 50- 843.50/173.87 50- 6.87 0.57 2.413.595.60 733B37 RT:4.73 RT:5.83 100 00 ? ù 869.57155.89 0 0 843.50/540.09 6.88 5.60 .14 Z.368.45 2.413.78 RT:4.78 RT:6.12 100- I" ù ? 50 411.12/111.98 g ù 734.18/157.8 RT:4.78 RT:6.12 100- 100- ù 50- 0- ù 4.12/763.2 734.18/576.13 RT;5.62 RT:6.33 00 I00 ù ?? 688.46/I58.20 50- 50- 916.36/173.80 RT:5.62 RT:6.33 100- 100- ù ?? 916.36/72.18 688.46/544.30 50 0- 10 t/min ?A.1????(IRM)??
GB/T22988一2008 附 录 B 资料性附录 回 收 率 六种化合物的添加浓度及其平均回收率范围数据,见表B.1 表B.1六种化合物的添加浓度及其平均回收率范围数据 牛奶 奶粉 化合物名称 添加浓度/(g/kg 平均回收率范围/% 添加浓度/4g/kg 平均回收率范围/% 78,0一87.0 79.198.0 78.095.0 79，498.1 16 螺旋霉素 82.2~97.2 79.8105 40 78.0~96.4 8o 79.6105 10 77.097.0 77.8~96.6 73.094.5 16 70.094.4 毗利霉素 81.2l00 40 68.392.0 10 78.392.0 80 78.4一94.5 78.0一105 74.8~98." 75.093. 5 16 85.6105 竹桃霉素 82.298.0 4o 80.3~99.8 10 74.596.0 80 79,3~105 85.0108 76,9~109 72.594.5 16 81.398.l 替米卡星 77.696,6 40 83.8ll1 1o 72.4一93.6 80 81.l一l01 74.095.0 73.4~89.4 81.5~96.5 85.0~94.4 16 红霉素 77.0~93.6 40 76,0~101 10 79.491.1 8o 77.0~94.6 77.088.0 81.0105 76.089.0 16 78.196.9 泰乐菌素 79.295.0 83.8107 40 74.092.6 l0 80 78.698.5