最大拟长针线虫检疫鉴定方法

国家标准 GB/T32766一2016 最大拟长针线虫检疫鉴定方法 DeteetionandidentifieationofParalongidorusma.xinmusBitschli,1874) Siddiqi.1964 2016-06-14发布 2017-01-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/I32766一2016 最大拟长针线虫检疫鉴定方法 范围 本标准规定了最大拟长针线虫的检疫鉴定方法 本标准适用于观赏植物、蔬菜、果树等多种植物、土壤及栽培介质中最大拟长针线虫的检疫和鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T24831一2009香蕉穿孔线虫检疫鉴定方法 SN/T21222008进出境植物及植物产品检疫抽样 最大拟长针线虫基本信息 学名;Paralongidorusma.rimus(Bitschli,1874)siddiqi,1964 异名;DorylainmusmarimusBiutschli,1874;Dorylaimus(Longidorus)marimus(Butschli,1874) Micoletzky,1922;Longiorusma.rinus(Bitschli,1874Thorne8.Swanger,1936;Longior4sna.ri musMeyl.1954;LongidorusmeyiSturhan.1963;最大异长针线虫 分类地位;线虫门Nematoda,无侧尾腺纲Adenophorea,矛线目Dorylainmida,矛线亚目Dorylaimina,长 针总科Dorylaimoidea,长针科Iongidoridae,长针亚科Longidorinae,拟长针属Paralomgidorus 方法原理 最大拟长针线虫成虫的形态学特征,寄主范围和地理分布(参见附录A)作为主要的鉴定依据 器材和试剂 5.1器材 生物显微镜、体视显微镜(具透射光源),加热板,水浴锅、离心机 自封袋,钟面皿或培养皿,载玻 片,盖玻片,网筛(20目,100目、500目,烧杯(500mL、1000mL),漏斗、漏斗架、乳胶管或硅胶管、止 水夹、小毁子、剪刀、挑针、浅盘、滤纸或卫生纸、酒精灯、干燥器和试管等 5.2试剂 4%甲醛,指甲油、甘油,无水乙醇,冰醋酸,石蜡和蔗糖等 现场检疫 将其主要寄主植物(参见附录A)作为现场检疫最重要的对象 注意观察植株的生长状况、根部为
GB/T32766一2016 害状,以及根际是否带土壤或栽培介质 重点选择上述可疑植物材料及土壤或栽培介质取样 如无可 疑症状则按要求随机取样 具体抽样方法详见SN/T2122一2008中5.5 实验室检测鉴定 7.1 线虫分离 植物栽培介质或少量的土壤样品,采用直接过筛法或悬浮过滤法分离线虫;大量的土壤样品,采用 蔗糖离心法分离线虫 具体分离方法参见附录B 7.2体视显微镜镜检 在体视显微镜下观察分离获得的线虫样品 最大拟长针线虫的虫体较大,呈长蠕虫形,行动较为缓 挑取线虫若干条制成临时玻片或永久玻片在生物显微镜下观察线虫形态 慢 具体玻片标本制作方法参见GB/T24831-2009中附录C 7.3生物显微镜镜检和测计 对照最大拟长针线虫雌、雄虫的主要鉴定特征进行重点观察、拍摄、测量和计算 在线虫样品数量 充足时,应观察雌、雄虫各20条以上 形态鉴定特征 8.1拟长针线虫属形态鉴定特征 8.1.1雌虫 线虫虫体大,头部连续,缢缩显著;侧器口横裂状,侧器囊漏斗状至倒马状;齿尖针细长,有时高度 硬化.基部平滑或呈叉状;齿托基部无凸缘,有时明显增厚;齿针导环为单环,位于齿尖针前半部;双生殖 腺,对伸回折,子宫无骨化结构;尾短,呈半球形或圆锥形 8.1.2雄虫 双生殖腺,对伸;交合刺粗壮,有侧附导片;泄殖腔区有1对交配乳突,其前紧接着有1列腹中交配 乳突 8.2最大拟长针线虫形态鉴定特征 8.2.1测计值 最大拟长针线虫的测计值见表1 表1最大拟长针线虫测计值(Sturhan,1963 测计项目 雌虫 雄虫 4683 9.84(7.60~12.35 8.55,10.70 L/mm
GB/T32766一2016 表1(续 测计项目 雌虫 雄虫 107(77一133 97,l10 15,6(12.8一23.7 12.9,l4.1 250(178一320 190,237 38.3(36.140.4 ODS/am1 171.5(152187 171,173 ODP/Am 3.5(42~70) 52.5,56 0GR/Am 41(37~47 39.5,43 注:n -体长/虫体前端至食道与肠连接处 -测量的线虫标本数目;l虫体体长;d体长/最大体宽;h 体长/尾长;V 虫体前端至阴门的距离×100/体长;oDs 齿尖针长度;oDP 齿托长 的距离;c 度;O(GR 导环至头端的距离 8.2.2形态特征描述 8.2.2.1雌虫 虫体大,长7mm~12mm,热杀死后虫体呈开螺旋形,虫体后半部弯曲;头与身体连接处的前部分 表皮厚度为7um一10um,体中部表皮厚度为4Am~7um,尾末端表皮厚度为10um~18m;头部 圆,宽度为35Am一39um,高度小于宽度的一半 侧面观时,头部膨大,在接近侧器孔后部位置处深度 缢缩;腹面观时,侧器孔处轻度缢缩,并有向后的浅度凹陷;唇区通常有6个内环乳突和10个外环乳突; 侧器倒马霾状,宽封状开口达唇区宽的2/3;齿针全长220Am一20834m;齿尖针长1524m~187m,齿 尖针基部宽3xm;齿托长42Am一7 Am;基部无凸缘;导环距头端36Am47Am,宽7m9Am;神 经环距头端224 与神经环位置水 丛m284丛m,位于食道腺中部稍靠后的位置;半月体长5丛m7m， ,距头端2324m288um;食道腺前部细,弯曲呈环状与食道腺基部重叠 食道腺基部长143 平 m" 163丛m,宽25丛m35丛m 背食道腺核位于背食道腺开口后一段距离,第一对亚腹食道腺核位于食道 腺中部附近,第二对亚腹食道腺核位于食道腺基部,不明显 食道与肠间瓣门钝凸锥形,长36um,但有 时不明显;阴门横裂,裂缝长度约为阴门处体宽的1/4;双生殖腺、对生、等长,回折;直肠前区可变,长度 为肛门处体宽的4倍~17倍;直肠长度约几乎为肛门处体宽一半;尾短,钝圆,长26 丛m38Am,约是 肛门处体宽的一半(e'=0.44~0.60) 具2对或3对尾乳突 一对在亚腹面,另一对在亚背面或侧面 8.2.2.2雄虫 极为少见 体前端与雕虫相似,后端向腹面弯曲程度较大交合刺强壮,长10m一I06am;侧附导片长 32 ,具有指状的末端;有1对泄殖腔区交配乳突和14个~1个泄殖腔前腹面交配乳突 24m一35m， 8.2.2.3形态特征图 最大拟长针线虫形态鉴定特征图参见附录C 8.2.2.4与近似种的区别 鉴定过程中应注意该线虫与其近似种拟最大拟长针线虫的形态区别,详见附录D.
GB/T32766一2016 结果判定 符合第8章形态鉴定特征以及测计值的可判定为最大拟长针线虫 10 样品和资料保存 10.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存 对已鉴定出最大拟长针线虫的样品应置于密封塑料袋中保 存于4笔冰箱,至少保存3个月,以备复核,谈判和仲裁 10.2线虫保存与处理 从检测样品中分离并鉴定为最大拟长针线虫的线虫材料,应妥善保存 将剩余的线虫杀死、,固定后 制成永久玻片标本保存,也可用4%甲醛固定后长期保存 标本标签中应尽量写明样品编号,种名、制 作时间、制作人、寄主、产地等信息 10.3资料保存与处理 完整的原始实验记录包括样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等 检测报告要 有实验人员和审核人员签字 全部资料归档,妥善保管,以备复核,谈判和仲裁
GB/T32766?2016 ?A ?? ??? A.1? ??????Phaseolwsvwlgaris,?Frugariaananassa, DahliapinnataCarpinus,?Daucuscarotavarsativa?Brassicaoleraceavar botrytis,?Cucumissativws,?Aiumorrum,?Chrysanthemumsinense,?Compositae ?Abies,Quercus,?L.arir,Solanumtuberosum,?Solanumtaberosum ?An4Acer,ɡοUmbelliferaePinusGadiolusgandaensis, Phlor,?Piswm.sariowm?Heianhusanas,°Thua,?Nioianatahacum., Aiwn.cepa.Robinid?PiceaCoryu A.2? ?;:?,? :? A.3? ?????????档??治? Σ???,Σ,????????Strawberrylatent virus(SLRSV)??顣 rlngspot
GB/T32766一2016 附 录 B 资料性附录 最大拟长针线虫的分离方法 B.1直接过筛法 步骤1;将大约200enm'碾碎的土壤浸人桶中水内,间歇搅拌约1h: 步骤2;将悬浮液通过5目筛网倒人51的水桶中,滤去粗大的残渣; 步骤3;水桶中加满水,用力搅拌使之完全悬浮后静置25s; 步骤4;将悬浮液通过3个100目(1500Am)的筛网 步骤5;用小水流轻轻将筛网上的残留物冲洗到烧杯中; 步骤6;继续将木桶加满水,充分搅拌后静置15s,过筛收集残留物(同步骤4,5):; 步骤7;将步骤5,6的残留物搅拌后冲洗到170目(900Am)的筛网内,淋洗出含有线虫的残留物 待镜检 B.2悬浮过滤法 将100mL的土壤倒人有水的盆盘)I中,经彻底的搅拌后,将悬浮液倒人盆I中;经搅拌后将盆 I中的悬浮液倒人100目的筛网上;用水将筛网上的残留物冲洗到烧杯中;准备一只加有不锈钢或塑料 网的漏斗,将两层线虫滤纸(或卫生纸)铺在筛网上;漏斗柄端接一段乳胶管,管的近末端用止水夹夹紧 将烧杯中的线虫悬浮液倾人置于筛网上,加水没过筛网及样品,并保持水位;次日,打开止水夹,用小器 皿收集含线虫的水样 B.3蔗糖离心法 该方法利用线虫(相对密度一般为1.05)漂浮在相对密度为1.18左右的蔗糖溶液上 将大量的土样分批放在离心管内,加2倍土样体积的水,充分搅匀;配平后，置于离心机内以 1500g1800g离心4min,弃去上清液;加人2倍沉淀体积,相对密度约为1.18的蔗糖溶液蔗糖 484g,加水定容至1L),搅匀;配平后,再次以1500g1800g离心2min;将上清液倒人用20目 00目.400目组成的套筛中;用清水将100目和400目筛中的残留物冲洗到烧杯或其他小容器中,待 镜检
GB/T32766一2016 附 录 c 资料性附录 最大拟长针线虫形态特征图 房 里 品 L L 心 说明 虫体前部; -雌虫前生殖管; 雌雄虫热力杀死后的形状; B 齿针; -阴门与阴道; 罐虫尾部 G 头部侧面观; -雌虫尾部腹面观; K-雄虫后部; H 头部背腹面观 -雌虫尾部侧面观; -不同阶段的幼虫尾部 D 注:仿Sturhan,1963 图c.1最大拟长针线虫形态特征图
GB/T32766一2016 附 录D 资料性附录 最大拟长针线虫与近似种形态区别对照表 表D.1最大拟长针线虫与近似种形态区别对照表 形态特征及测计值 最大拟长针线虫 拟最大拟长针线虫 热杀死后形态 开螺旋形 开放的C形 唇区直径/m 35一39 23一29 口孔至导环的距离/4m" 3647 2839 侧器大小 大(大约占2/3唇区宽》 非常大(大约占4/5唇区宽 雌虫体长/mm 712 5,64~10.13 77133 133~182 齿尖针长/丝m 152~187 122~169 雌虫尾形 钝圆 圆锥 雕虫尾长/am 26一38 22一36 0.440.60 0.60~1.00 极少见 雄虫是否可见 常见 5486 交合刺长度/m 100一106 注:a 体长/最大体宽;e” -尾长/r门处体宽
GB/T32766?2016 nematodesandtheirassociatedviruses.Anin [1 Brown,D.J.F.andTrudgill,D.L.,L.ongidorid troductiontovirusvectornematodesandtheirassociatedviruses.1AV,De" epartamentodeZoologiaUnir tugal.1997,pp140 versidadedeCoimbra,Port ongidors maximus.CIHdes siticnematodes.St.AIbans Heyns,J.,Paraon criptionafplantpars UK:CommonwealthlInstituteofHelminthology.Set5,No.75.1975 Humt,DJ.Aphelencdhidha,longidoridaeandThidhodboridae;TheirsystemutiesandBioomices.CAB lnternational,UniversityPress,Cambridge.l1993. [4]Reddy,P.,PlantNematology.AgricolePublishingAcademy.India.1983. esinPantNematology [E51Racichandra,N.G.,Methodsandtechniques y.PHLearningPrivateLtd NewDelhi-ll0001.2010.

最大拟长针线虫检疫鉴定方法GB/T32766-2016

概述

最大拟长针线虫是一种致害植物的有害生物，在国际贸易中被列为检疫性有害生物。因此，对其进行检疫鉴定非常重要，GB/T32766-2016即为我国制定的最大拟长针线虫检疫鉴定方法。

检测原理

该检测方法基于PCR技术，通过特异引物扩增样品中最大拟长针线虫的ITS、COI和16S rRNA基因片段，再通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离和检测。

操作步骤

具体的操作步骤如下：

• 取样：从疑似感染的植物中取样。
• 提取DNA：使用适当的方法从样品中提取总DNA。
• PCR扩增：将特异引物加入总DNA，通过PCR扩增目标基因片段。
• 电泳检测：将PCR产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离和检测。

结果判断

根据PCR扩增产物的大小和电泳图谱特征，可以判断样品是否存在最大拟长针线虫。

结论

GB/T32766-2016是一种可靠的最大拟长针线虫检疫鉴定方法，可以有效地防止该有害生物在国际贸易中的传播。

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2022/10/5 10:31:44 现行