国家标准 GB/T36812一2018 马铃薯黄矮病毒分子生物学检测方法 Moleculardetectionmethodofrotatoyelowdwrfvirus 2018-09-17发布 2019-04-01实施国家市场监督管理总局发布币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36812一2018 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本标准起草单位:福建出人境检验检疫局、福清出人境检验检疫局、福建农林大学、检验检疫科学研究院本标准主要起草人:沈建国、蔡伟、高芳銮、张永江、陈细红、李敏、王宇吴祖建、陈寿铃
GB/36812一2018 马铃薯黄矮病毒分子生物学检测方法范围本标准规定了马铃薯黄矮病毒(Potaoyellowduwarfvirus)的分子生物学检测方法本标准适用于可能携带马铃薯黄矮病毒的植物及植物产品检疫鉴定规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T2964植物病毒检测规范 SN/T3457植物病毒分子生物学检测规范马铃薯黄矮病毒基本信息中文名;马铃薯黄矮病毒学名;Potatoyellowdwarfviru,缩写,PYDv 分类地位;弹状病毒科(Rhabdoiridae)、细胞核弹状病毒属(Nucleorhabdovirus) 马铃黄矮病毒的其他信息参见附录A 方法原理马铃薯黄矮病毒的分子生物学特性是制定本检测方法的主要依据 5 仪器用具及试剂 5.1仪器高速冷冻离心机、电子天平、,PCR仪、荧光PCR仪,水平电泳系统、一20C低温冰箱和-80C超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台等 5.2用具可调移液器(2.5AL，10L20AL100AL，200L1000L)和可调移液器枪头、离心管、研钵等 5.3试剂除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定 RT-PCR检测试剂见附录B;实时荧光RT-PCR检测试剂见附录C
GB/T36812一2018 6 抽样和样品制备 6.1抽样尽量抽取有病毒危害症状的植物材料,PYDV的危害症状描述参见附录A;抽样方法按照 SN/T2122中规定执行 6.2样品制备分别按照有症和无症进行样品制备,具体方法按照SN/T2964和SN/T3457中规定执行检测鉴定 7.1RT-PCR检测以含PYD材料作为阳性对照,以不含PYDV的健康植物组织作为阴性对照,同时以双蒸水代替模板作为空白对照分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后进行PCR检测,具体操作见附录B 如采用商品化一步法试剂盒,则按照试剂盒说明进行 7.2实时荧光RT-PCR检测以含PYDV材料作为阳性对照,以不含PYDv的健康植物组织作为阴性对照,同时以双蒸水代替模板作为空白对照分别提取样品和对照的总RNA,反转录合成cDNA后进行实时荧光PCR检测,具体操作见附录C 如采用商品化一步法试剂盒,则按照试剂盒说明进行结果判定 8 样品检测时,检测流程及结果判定按下述原则进行: RT-PCR初步筛检,若检测结果为阴性,则判定样品不携带PYDV;若检测结果为阳性,则采用 PCR产物序列测定或实时荧光RT-PCR进行验证; -若验证结果为阳性,则判定样品携带PYDV;若验证结果为阴性,则判定样品不携带PYDV 样品保存与结果记录 9 g.1样品保存经检测确定携带PYDV的样品应保存在适合的条件下以备复核种苗、叶片等样品保存在 -80C冰箱中;做好登记和标记工作,保存期限至少1年 9.2结果记录记录包括样品来源、种类、检测时间,地点、方法和结果、检测人员签字 RT-PCR检测应有电泳图片;实时荧光RT-PCR检测应有实时荧光结果图片
GB/36812一2018 附录 A 资料性附录马铃薯黄矮病毒相关资料 A.1寄主范围已报道的寄主包括茄科,夹竹桃科、菊科、十字花科、唇形科、豆科、萝科和玄参科植物,主要自然寄主为马铃薯(Solanumtuberosum) A.2病害症状侵染马铃薯引起病株矮缩,黄化,茎的生长点早期坏死等症状(见图A.l) 注:引自CornellUniversity，Bugwood.org 图A.1PYDv侵染马铃薯引起的症状 A.3分布地区主要分布于加拿大,美国 A.4传播途径主要经昆虫介体叶蝉Aceralagalliasanguinolenta、Aceratagalliasp.、" Agalia la.conxtricta传播,也可通过带毒种薯,块茎远距离传播 A.5粒体形态病毒粒体有包膜,杆菌状或子弹状,大小约380nm×75” nm
GB/T36812一2018 A.6病毒基因组负义单链RNA病毒,全长约12875bp
GB/36812一2018 附录B 规范性附录) RI-CR检测 B.1试剂 B.1.1Trizol裂解液 B.1.25×TBE缓冲液: Tris碱 54.0" 酬酸(H,BO. 27.5g 0.5mol/LEDTA(pH8.0 20ml 补充蒸水至1L 用时加蒸水稀释至0.5×TBE. B.1.3三氯甲熔异丙醉 B.1.4 B.1.575%乙醇 B.1.6无水乙醉 B.1.7RT缓冲液 mmol/L B.1.8dNTPs:10 B.1.9M-MLVRT;200U/aL B.1.10RNasin;40U/AL B.1.11TaqPCRmix B.1.12引物序列根据已报道的PYDV基因组序列设计1对用于特异性扩增的引物正向引物PYDV-F;5'-ATATTcATTTcCAGGCTTGCAT-3 反向引物PYDV-R:5'-CTATTTTcCcCTCAGTAGTcCCAC-3 PCR产物大小588bp B.2RT-PCR检测 B.2.1总RNA提取取0.1只样品组织置于研钵中,加人液氮充分研磨至粉末状后迅速移人1.5m离心管,再加人 lmlTriaol裂解液,剧烈震荡摇匀3min;4C,12000越离心10min取上清液;加人三氧甲烧300AL. 剧烈震荡15s,室温静置5min,4C,12000 离心15min,取上层水相;加人等体积的异丙醉颠倒混匀后室温下静置15min.4C,12000越离心10min,弃上清液;加人1ml75%的乙醉洗涤沉淀2次每次4C,7500迟离心3min,弃上清液;RNA沉淀干燥后,用20lL一40AL经DEPc(焦碳酸二乙酯》处理过的双蒸水溶解，一80C保存备用 B.2.2cDNA合成在PCR管中加人3AL总RNA,lAL反向引物(PYDV-R,10mol/L),双蒸水7AL.70C水浴 10min 1,迅速冰浴5min,再加人下列试剂:5×RT缓冲液5Al,dNTPs(10mmol/L)2L,M-MLVRT
GB/T36812一2018 (200U/L)1MlLRRNasin(40U/L)1L 42C水浴60min,70C水浴10min,自然冷却至室温， -20C保存备用 B.2.3CR扩增 PCR反应体系见表B.1,每个反应设置2个重复 min,9430s,50C45s,721min PCR反应条件:94C3 1,共35个循环;72C10min. 表B.1CR反应体系名称加样量/儿 cDNA 3.0 YVF(0pm) 1.0 PYDV-R104mol/I 1.0 2×TaqPCRmix 12.5 双蒸水 7.5 总体积 25.0 B.2.4阴性对照、阳性对照和空白对照的设置 B.2.4.1阴性对照;不含PYDV的健康植物组织 B.2.4.2阳性对照:含PYDV材料 B.2.4.3空白对照:双蒸水 B.2.5琼脂糖凝胶电泳制备1.5%的琼脂糖凝胶，对PCR产物进行电泳电泳结束后,在澳化乙锭EB,浓度为 0.5g/mL)溶液染色10min,再在凝胶成像分析系统中观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带,拍照并做记录 B.2.6结果判断如果阴性对照和空白对照无特异性扩增,阳性对照在588bp大小处有扩增条带,待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带,则判定为阳性如果阴性对照和空白对照无特异性扩增,阳性对照在588bp大小处有扩增条带,待测样品未出现与阳性对照一致的扩增条带,则判定为阴性如果采用P(CR产物序列测定方法进一步确认,当序列测定得到的核昔酸序列与已知的PYDV序列一致,则判定样品携带PYDV;若序列不一致,则判定样品不携带PYDV
GB/36812一2018 录附 C 规范性附录实时荧光RT-PCR检测 C.1试剂核酸提取,反转录试剂同B.1 TaqManPCRmix C.2引物及探针实时荧光RT-PCR检测引物及探针见表C.1 表c.1实时荧光RT-PCR检测引物及探针名称序列(5'-8 PYDv-n GG;TcAAATcGGAAATGAG PYDV-l CTGGTTACAGTGATCAGA PYDv-2 CTACCATTAGAACAAGTTACG PYDV-r2 GGTGGATAAcTGTTGAAG PYDV-Probel FAM-TAAGcG;GCAACcAAC'TGTCG-TAMRA PYDV-Probe2 FAMCAGTCcAGcGGAAGTCAccAATT-TAMRA c.3总RNA提取方法同B.2.1 C.4eDNA合成方法同B.2.2 C.5实时荧光CR反应实时荧光PCR反应体系见表c.2,每个反应设置2个重复反应程序;95C10s,95C5s,55C10s,72C20s,共40个循环
GB/T36812一2018 表c.2实时荧光CR反应体系名称加样量/Ml 2×TaqManPCRmix 12.5 PYDV-1(10Amol/L PYDV-rl(104mol/L) PYDV-f2(10mol/1 PYDV-r2(104mol/L PYDV-Probel(5Amol/L PYDV-Probe2(5Amol/L cNA 2.0 4.5 双燕水 25.0 总体积 C.6阴性对照、阳性对照和空白对照的设置同B.2.4 结果判定在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线、阳性对照Ct值<30并出现典型扩增曲线的条件下待测样品的c'值>40时,判定YD阴性待测样品的C值<35时,判定PYDV阳性待测样品的35GB/36812一2018 参考文献 [1]李芝芳马铃薯主要病毒图鉴[M] 北京;农业科学出版社，20o4l1m BarrusMF， 1922，123): [[2] chupp p(cc.Ydlowdwarffpoatoes[] Phbytopathologs 122-133. BrakkeMK，BlackLM，WyckoffRWG TheSedlimentationRateofPotatoYellow [3] DwarfVirus[] AmerieanJournalofBotany.1951，38(5):332-342. [4们 BrakkeMK.Stabilityofpotatoyellow-dwarfvirus[J] Virolo 1956，2(4):463-476. ogy [5" LinNS，HsuYH，ChiuRJ.ldentificationofViralStructuralProteinsintheNucleo lasm.ofPoualoYelowDwarfVirus-infetedCels[] JourmalfGenernalVirology，1987，68(10) 2723-2728.

马铃薯黄矮病毒分子生物学检测方法GB/T36812-2018

马铃薯是我国重要的农作物之一，而黄矮病毒则是危害马铃薯生长和产量的主要病毒之一。因此，对该病毒进行快速、准确的检测非常必要。分子生物学技术是目前最为先进的检测方法之一。

GB/T36812-2018标准中规定了马铃薯黄矮病毒分子生物学检测方法，具体包括以下几个步骤：

1. 样品的处理和提取

样品可以是马铃薯的叶片、茎或者土壤等。首先需要将样品进行处理，去掉杂质和不相关的部分。然后，用适当的缓冲液提取样品中的核酸。

2. 反转录

将提取出来的核酸进行反转录反应，使RNA转化为cDNA。这个步骤需要使用一些反转录酶和引物。

3. PCR扩增

将得到的cDNA进行PCR扩增，从而放大病毒的核酸片段。这个步骤需要使用一些特定的引物和酶，可以根据实际情况进行设计。

4. 凝胶电泳

将PCR产生的DNA片段进行凝胶电泳，可以检测是否存在目标核酸片段。

通过以上几个步骤，可以快速、准确地检测马铃薯中是否存在黄矮病毒。该方法具有灵敏、特异性强、可靠性高等优点。